Autofagiaan liittyvien proteiinien ja tulehdusmerkkiaineiden välinen korrelaatio hemodialyysipotilailla

Tutkimussuunnittelu ja väestö

Tutkimussuunnitelma Otamme 30 tervettä vapaaehtoista kontrolliryhmään. Tähän tutkimukseen otetaan mukaan 180 sukupuolen ja iän mukaista hemodialyysipotilasta. Tutkimukseen osallistuvien potilaiden on oltava vähintään 20-vuotiaita ja avohoito hemodialyysissä (HD) vähintään 3 kuukautta. Potilaat suljetaan pois, jos heillä oli pahanlaatuinen kasvain, vaikea maksasairaus (bilirubiini > 1,6 mg/dl), hallitsematon verenpainetauti, vaikea liikalihavuus (BMI > 35) ja he saavat tällä hetkellä karbamatsepiinia, statiineja tai immunosuppressiivisia aineita. Tutkimuksessa yhteistyössä toimiva lääkäri tarkistaa jokaisen henkilön sairauskertomuksen perusteellisesti. Kaikki koehenkilöt antavat kirjallisen tietoisen suostumuksen osallistumiseen ja pöytäkirja lähetetään Tungs' Taichung Metroharbour -sairaalan institutionaalisille arviointilautakunnille.

Tutkimusparametrit Dialyysiä edeltävät verinäytteet otetaan keskellä viikkoa. 30 minuutin kuluessa näytteenoton jälkeen jäljelle jäänyt veri sentrifugoidaan 3 000 g:ssä 10 minuutin ajan, jaetaan välittömästi eriin ja pakastetaan -80 °C:seen lisäanalyysiin asti.

Sytokiinimääritykset Seuraavat tulehduksen ja hemostaasin markkerit määritetään ELISA:lla potilaiden seerumeista: interleukiini-6 (Quantikine, R&D Systems) ja plasman CRP-pitoisuudet erittäin herkässä määrityksessä (hsCRP).

Lipidien/lipoproteiinien analyysi Kokonaiskolesteroli, HDL-kolesteroli (HDL) ja triglyseridipitoisuudet määritetään entsymaattisesti. Plasman glukoosi mitataan glukoosioksidaasimenetelmällä.

Liposakkaridia sitovan proteiinin (LBP) mittaukset LBP määritettiin seeruminäytteistä ja kontrolleista käyttämällä standardoituja entsyymikytkentäisiä immunosorbenttimääritysmenetelmiä (ELISA) ja normaalien kontrollihenkilöiden seerumia käytettiin määritysten väliseen vaihteluun.

PBMC:iden eristäminen Etyleenidiamiinitetraetikkahappo Vacutainer™-putkia käytetään laskimoverinäytteiden (10 ml) keräämiseen paastoaneilta varhain aamulla. Supernatantin alikvootit kerätään sentrifugoimalla 800 x g:ssä ja 25 °C:ssa 15 minuutin ajan ja säilytetään sen jälkeen -80 °C:ssa. Jäljelle jäänyt veri sekoitetaan ja lisätään hitaasti tipoittain sentrifugiputkeen, joka sisältää 10 ml Ficoll-erotusväliainetta. PBMC:t eristetään valmistajan protokollan mukaisesti ja säilytetään -80 ˚C:ssa.

Western blotting -PBMC:t hajotetaan RIPA-lyysipuskurilla ja proteiinipitoisuudet määritetään BCA Protein Assay -kitillä valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sen jälkeen 20 µg proteiinia/kuoppa erotetaan käyttämällä 12 % SDS-PAGE:ta. Proteiinit siirretään tämän jälkeen nitroselluloosakalvoille 300 mA:lla 60 minuutin ajaksi. Nitroselluloosakalvot estetään Tris-puskuroidulla suolaliuoksella, joka sisältää 0,1 % Tween 20:tä (TBST) ja 5 % rasvatonta maitojauhetta, 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Nitroselluloosakalvoja inkuboidaan primääristen vasta-aineiden kanssa yön yli 4 °C:ssa ravistelijassa, joka on asetettu hitaalle nopeudelle. Nitroselluloosakalvot pestään kolmesti TBST:llä ja inkuboidaan sekundääristen vasta-aineiden kanssa 1 tunti huoneenlämpötilassa. Kolmen pesun jälkeen ECL-substraatti lisätään nitroselluloosakalvoon. Signaali havaitaan Image Lab™ -ohjelmistolla ja kaistan tiheys kvantifioidaan kuvantamisohjelmistolla.

Ensisijaiset vasta-aineet mikrotubuluksiin liittyviä proteiineja 1A/1B kevytketju 3A, ubikitiinia sitovaa proteiinia p62 ja beclin-1 sekä GAPDH:ta vastaan ​​ostetaan. Käytetään peroksidaasikonjugoituja vuohen anti-hiiri- ja vuohen anti-kaniinivasta-aineita.