L-天冬酰胺酶治疗期间脂蛋白脂肪酶 (LpL) 和载脂蛋白 E (Apo E) 多态性与急性淋巴细胞性白血病患儿血脂谱的相关性。

介绍

儿童时期的恶性肿瘤是全球第二大死因，仅次于伤害。 根据流行病学数据，每年有 300,000 例新发肿瘤病例发生在 19 岁以下的儿童和青少年1，其中 160,000 例涉及 15 岁以下的儿童。 血液系统恶性肿瘤是儿童人群中最常见的肿瘤疾病，其中急性白血病以32.8%的比例位居第一，其次是中枢神经系统肿瘤，占21%，淋巴瘤占12% % 第三名。

定义 - 病理生理学

白血病 (L) 被定义为一组以白细胞不受控制的增殖为特征的紊乱，这是由于骨髓与正常的原始分化及其被未成熟的未分化干细胞浸润所致。 根据定义，超过 20% 的骨髓被干细胞浸润。 白血病的确切致病机制至今尚未阐明，但似乎是多能造血祖细胞在其不同分化阶段之一发生基因突变和损伤的结果。 这一事实导致克隆扩增和分化抑制。 白血病细胞的免疫表型反映了肿瘤克隆所达到的分化水平。 与导致贫血、血小板减少症和中性粒细胞减少症的正常造血细胞相比，白血病细胞分裂速度较慢并且需要更多时间来合成 DNA。 在诊断时，白血病细胞可能不仅取代了骨髓中的正常细胞，而且还扩展到髓外区域。

各种类型的白血病异质性极强，根据细胞的来源，它们可分为淋巴母细胞白血病和非淋巴母细胞白血病。 上述每一个亚组都可能以其急性白血病 (AL) 或慢性白血病 (CL) 形式出现。 在急性形式中，造血组织的未成熟细胞占主导地位，如果不进行任何治疗，疾病的进展会迅速导致死亡。 在慢性形式中，成熟细胞在组织中占主导地位，并且疾病的发展通常需要更长的时间。 在儿童中，白血病主要以急性形式出现 (97%)，并且在大多数情况下它表现为急性淋巴细胞白血病 (ALL，80%)。 急性非淋巴细胞白血病 - ANLL 发生频率较低 (17%)，它包括急性髓性白血病 - AML (15%) 和一些其他罕见形式 (2%)，而其余 3% 对应于慢性白血病。 AL 更常发生在 2 至 6 岁之间，男孩的发病率高于女孩 (1:1.3)。 2.5% - 5% 的儿童 ALL 和 6% - 14% 的儿童 AML 发生在 1 岁以下的婴儿身上。 ALL 的特征类型是 B 细胞 ALL，与 T 细胞 ALL (15%) 相比，它在儿童中最常见 (85%)，T 细胞 ALL 伴有纵隔淋巴结肿块等区域.

流行病学

在美利坚合众国（USA）和大部分西欧国家，儿童白血病的发生率为每年每10万儿童人口3.5-4.0例，在所有年龄段的恶性肿瘤死亡原因中排名第20位。 从大规模队列研究中推断，发达国家的儿童癌症发病率每年上升1%。 1930 年代，英国 (UK) 和美国首次检测到儿童 ALL 的患病率。 在美国，ALL 首先出现在欧洲人后裔的儿童中，然后在 1960 年代出现在非洲人后裔的儿童中。 ALL 在发展中国家和欠发达国家的发病率较低，这一事实暗示工业化与白血病发生之间可能存在相关性。

天门冬酰胺酶 (ASP)

今天用于治疗 ALL 的化疗联合疗法显着改善了疾病的长期病程，总体五年生存率超过 80%，而 1960 年代的相应比率低于 30%。 促成这一发展的主要原因之一是天冬酰胺酶的强化、延长和更高剂量给药。 L-天冬酰胺酶 (L-ASP) 在负荷剂量期间是实现疾病缓解的基本成分，同样，在维持剂量期间也是为了在患有 ALL 的儿童和成人中建立缓解的基本成分。 天冬酰胺酶的外源性给药的细胞毒性作用是由血液中天冬酰胺储备的耗尽引起的。 天冬酰胺酶作为天冬酰胺水解成天冬氨酸和氨的催化剂。 天冬酰胺对于蛋白质和细胞的合成至关重要，因此对于它们的生存也至关重要。 在天冬酰胺合成酶的协助下，人体的正常细胞具有从天冬氨酸产生天冬酰胺的能力。 然而，肿瘤细胞要么完全缺乏这种酶，要么含有微量酶，导致它们无法从头合成天冬酰胺。 这些细胞的存活及其合成蛋白质的能力完全取决于从血液中接受天冬酰胺。 因此，施用天冬酰胺酶会抑制 DNA、RNA 和蛋白质的合成，进而导致这些细胞的凋亡。 低水平的天冬酰胺只会影响癌细胞的生存能力，而不会影响健康细胞。

L-ASP 抑制白血病细胞增殖的能力最早是在 1970 年代的临床研究中观察到的，从那时起，它一直是儿童 ALL 治疗的基石。 这种酶的天然形式由菊欧文氏菌和大肠杆菌 (E.Coli) 产生，正被用于治疗，很像 L-ASP 由大肠杆菌结合产生的产物。 聚乙二醇（聚乙二醇化天冬酰胺酶，PEG-ASP）的半衰期延长至 5.5 天，而不是天然形式的 26 小时半衰期。 ALL 的化疗方案推荐剂量为 1,000 - 2,500 IU/m2 的 PEG-ASP 和 5,000 - 12,000 IU/m2 的天然形式。

天门冬酰胺酶的不良反应

尽管 L-ASP 在白血病的化学治疗中极为重要，但它会导致过多的毒性副作用，有时甚至需要终止其给药。 研究表明，由于先前给药中出现的毒性副作用而导致的剂量给药遗漏与 ALL 儿童的不良预后有关。 最常见的不良反应是超敏反应，研究表明其发生率高达 75%。 正在使用的 ASP 是一种源自细菌（主要是大肠杆菌）的大分子，因此能够诱导免疫反应，这种反应在反复接触后以及主要是在药物给药延迟后变得更加强烈。 除了表明主治医务人员会立即做出反应的临床超敏反应外，还存在亚临床反应，这些反应会导致药物效力下降，而这些反应很难被发现以便迅速采取行动。 据报道，在接受 ASP 治疗期间，ALL 患者中胰腺炎的发生率高达 18%。 致病机制尚不清楚，但似乎故障在于具有显着蛋白质周转的器官（如胰腺）的蛋白质合成减少。 此外，这种机制被认为也是在用天冬酰胺酶治疗期间检测到的肝毒性的原因。 此外，ASP 诱导的蛋白质合成减少参与凝血和纤维蛋白溶解过程，进而导致中枢神经系统血栓形成和四肢深静脉血栓形成。 其他不良反应为高血糖，由于胰岛素产生减少和骨髓抑制，主要是由于增强了其他化疗药物的抑制作用。 此外，有报道称在使用 ASP 治疗期间发生脑病事件可能与 ASP 分解导致的氨水平升高有关。

ASP 的一个严重不良事件是脂质代谢紊乱，如果不及时识别可能会导致额外的并发症。 具体而言，似乎激活通过肝脏合成产生甘油三酯的内源性途径会导致高甘油三酯血症。 有研究表明，服药后8-14天甘油三酯高值率为67%。 肝脏能够合成富含甘油三酯的 VLDL（极低密度脂蛋白）。 利用位于血管内皮上的脂蛋白脂肪酶 (LpL) 的作用，甘油三酯从 VLDL 分离，导致后者转化为 IDL（中密度脂蛋白），然后转化为 LDL（低密度脂蛋白）。 甘油三酯随后从血液循环系统中提取并储存在脂肪组织中，而低密度脂蛋白颗粒则与组织受体或巨噬细胞受体连接。 乳糜微粒分解的最终产物（在 LpL 的帮助下来自甘油三酯的外周水解），VLDL，脂蛋白的残余物，最终将被肝受体去除。 载脂蛋白 E (apo-E) 在此过程中起着重要作用，它在 LpL 和肝脂肪酶存在的情况下结合这些残余物。

脂蛋白脂肪酶 (LpL)

LpL基因位于染色体8p22，由10个外显子组成。 已经记录了大约 100 种突变，其中 3 种是最常见的，其中 2 种与 LpL 功能降低和心血管风险增加有关。 称为多态性 N291S 的突变存在于 2-5% 的普通人群中，它的存在与 LpL 功能下降和 VLDL 代谢失衡 [甘油三酯升高，HDL（高密度脂蛋白）降低]有关。 此外，似乎这种突变的影响因其他遗传因素（家族性高胆固醇血症、载脂蛋白 E2/E2）的共存而被放大。 第二种突变称为多态性 D9N，与动脉粥样硬化风险增加有关，即使该突变导致 LpL 功能轻微下降。 最近，观察到 Apo E 和 LpL 基因上的小核苷酸多态性 (SNP) 组合表明心血管疾病的高危人群。 最后，在 20% 的普通人群中遇到的第三个突变，多态性 S447X 与略微升高的 HDL 水平和低水平的甘油三酯相关，因此对脂质谱具有积极影响。

在 ASP 治疗期间，记录到 LpL 功能降低，这可能是由肝脏蛋白质合成完全减少引起的，这从其他蛋白质（如白蛋白和纤维蛋白原）浓度降低中可以明显看出。 研究特别表明，抑制 LpL 的作用与 ApoCIII/ApoCII 比率的增加有关，其中 ApoCII 是 LpL 的重要辅助因子，它促进甘油三酯的水解，而 ApoCIII 作为 LpL 的抑制剂同时似乎能够独立于 LpL 调节血清中甘油三酯的水平。 因此，随着甘油三酯水平的升高，血浆中的甘油三酯清除过程中会出现问题。 天冬酰胺酶处理期间甘油三酯水平升高的另一个建议机制是 VLDL 合成增加，这也反映在高载脂蛋白 ApoB100 浓度（VLDL 的一个组成部分）上。

载脂蛋白 E (Apo E)

Apo E基因位于19号染色体，由4个外显子组成。 载脂蛋白E（Apo E）是脂蛋白中的结构成分之一，富含甘油三酯，在肝脏蛋白质摄入中起重要作用。 载脂蛋白 E (Apo E) 具有 3 个等位基因 ε2、ε3、ε4 [APOE-ε2 (cys112、cys158)、APOE-ε3 (cys112、arg158) 和 APOE-ε4 (arg112、arg158)]。 ε3 在一般人群中最常见，它包含第 112 位的半胱氨酸和第 158 位的精氨酸。 ε4 在第 112 位与 ε3 不同，它用半胱氨酸代替精氨酸 55。 同形体 ε2 与肝脏脂蛋白受体的联系较弱，导致乳糜微粒和 VLDL 残留物的积累。

ApoE4 在体外以与 ApoE3 相同的亲和力附着于肝脏中的脂蛋白受体，但 ApoE4 在体内清洁富含甘油三酯的脂蛋白方面的作用目前尚不明确。 ε2 等位基因与禁食后较高的甘油三酯水平有关，而 ε4 等位基因与高胆固醇血症和高低密度脂蛋白胆固醇有关。 与基因型 E3/E3 的个体相比，基因型 E3/E4 的个体对富含甘油三酯的脂蛋白的清除速度较慢。 ε4 等位基因看起来与受影响的甘油三酯代谢有关。 与具有 ε3 和 ε4 等位基因的个体相比，具有 ε2 等位基因的个体具有较低的胆固醇水平。 此外，研究表明，与基因型 E3/E3 的个体相比，基因型 E2/E4 的个体在禁食后具有更高的甘油三酯水平。

ApoE 基因的改变导致编码蛋白质的氨基酸发生变化，从而导致正常蛋白质的结构发生改变。 后者导致富含甘油三酯的脂蛋白的清洁速度变慢。 一项研究表明，与甘油三酯水平正常的患者相比，高甘油三酯血症患者表型 E4/E3 的患病率更高。 此外，在用天冬酰胺酶处理后，甘油三酯水平和 ApoE 表型之间没有观察到显着的统计学差异。

天冬酰胺酶和脂质概况

关于天门冬酰胺酶对胆固醇水平的影响，研究无法得出任何可靠的结论，因为一些研究发现服用该药后一小部分患者有所增加，其他人则表示有显着增加，而其他人则尚未提出小幅下降但不显着。 关于 HDL 水平，研究发现患有恶性肿瘤的儿童的 HDL 水平较低，特别是血液病儿童。 另一项针对 ALL 儿童的研究表明，在使用 ASP 治疗期间和之后，HDL 水平上升，同时 Apo-A1 水平下降。 HDL 在胆固醇从外周组织反向转移到肝脏的过程中起着至关重要的作用，这种机制赋予 HDL 抗凝剂的特性。 与上述特性协同作用，HDL 的其他部分具有抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡和抗凝血特性，有助于防止动脉粥样硬化形成。 脂蛋白 Apo-A1 包含 HDL 的主要结构蛋白。 很明显，天冬酰胺酶作为蛋白质合成的抑制因子可能会改变脂质/蛋白质的比例，有利于 HDL 分子中的第一个。 即使在治疗结束后的 ALL 无疾病幸存者中，也已注意到低 HDL 和 Apo-A1 水平。 如果考虑到低水平 HDL 导致的动脉粥样硬化和冠心病的危险，这一观察就特别重要。

高甘油三酯血症能够成为急性胰腺炎发展的唯一因素。 当甘油三酯水平超过 900 mg/dl 时，它们会形成乳糜微粒，这种分子的大小足以阻塞胰腺毛细血管，导致局部缺血和胰脂肪酶释放。 后者将通过增加游离脂肪酸来加强脂肪分解，这反过来又会释放自由基和促炎衍生物，最终导致炎症和坏死。 如上所述，天冬酰胺酶能够通过两条途径参与胰腺炎的发病机制，一条是独立的，一条是依赖于甘油三酯的。 高甘油三酯血症还可能促进 ALL 患者和正在接受 ASP 治疗的患者血栓形成的倾向，因为一方面，药物与纤维蛋白溶解系统的改变有关，正如已经提到的，同时另一方面增加了甘油三酯会导致血液粘度过高，从而增加血栓栓塞并发症的风险。 从通用参考书目中记录的病例可以清楚地看出，大多数血栓形成涉及中枢神经系统 (CNS)，而排在第二位的是上肢深静脉血栓形成病例。

最后，重要的是要补充一点，在治疗的多个阶段，ASP 与皮质类固醇（泼尼松或地塞米松）共同给药于患有血液系统恶性肿瘤的儿童。 很容易看出皮质类固醇激素可以协同和加剧高脂血症、胰腺炎和血栓形成等不良事件。 此外，天冬酰胺酶可导致皮质类固醇的一些不良事件，例如通过其产生的高凝状态引起的骨坏死。 由于这两种药物都是关键的治疗因素，因此需要对患者的状况和不良事件的出现进行非常密切和细心的监测，以便在必要时进行干预。

独创性

关于天冬酰胺酶对 LpL 和 Apo E 效力的影响以及在 ASP 化疗期间患有 ALL 的儿童的脂质值的通用和国家参考书目都是有限的，而且没有参考书目与遗传相关LpL 和 Apo E 的背景以及脂质谱的关系。 目前的研究将首次检测急性 ALL 患儿在 ASP 治疗期间的 LpL 和 Apo E 基因多态性。

重要性

在这项特殊的研究中，研究人员将重点研究 ALL 儿童的血脂谱、ASP 对这些患者血脂谱的影响，以及脂蛋白脂肪酶 (LpL) 和载脂蛋白 E (ApoE) 的多态性与化疗方案期间的脂质值。 将要检验的假设是，记录正在研究的 ALL 患儿的基因型是否能够构成其治疗结果的先发性指示因素。

以这种方式，将得出重要结论，即正在接受 L-ASP 治疗的儿童的基因型可能对治疗期间脂质紊乱的实验室证明、相应治疗阶段的更密切监督以及及时的治疗干预有何贡献以防止任何并发症。

方法

研究类型：前瞻性病例对照研究 特征流行病学研究完全符合我们的研究目的，研究 ASP 对儿童和青少年 ALL（患者组）血脂谱的影响以及与 ALL 的相关性LpL 和 ApoE 的多态性与化疗方案持续时间的脂质水平。 存在两个额外的儿童群体作为人口控制（未表现出疾病的同一年龄组的儿童和青少年，以及表现出疾病并已按照方案至少完成化疗的年龄相近的参与者） 6 个月前）将我们的研究类型专门化为病例对照研究。

研究地点：该研究将在塞萨洛尼基亚里士多德大学 (AUTH) 大学总医院 AHEPA 儿科和青少年血液学 - 儿科第二科肿瘤科进行。

记录参数说明

在疾病诊断期间，将通过测量以下参数来确定患者的血脂谱：总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白 A1、载脂蛋白 B100、脂蛋白 α [Lp(α)]、葡萄糖, 血清谷氨酸草酰乙酸转氨酶 (SGOT), 血清谷氨酸丙酮酸转氨酶 (SGPT), 促甲状腺激素 (TSH), 游离甲状腺素 (FT4), 淀粉酶, 脂肪酶。 此外，还将对 LpL 和 Apo E 的多态性进行遗传分析。 将对所有组的所有参与者进行类似的测量。

A 组的参与者将立即接受化疗方案 ALLIC BFM 2009。 在负荷剂量期间，这些儿童将接受连续 33 天的泼尼松龙治疗，并在第 12、15、18、21、24、27、30、33 天添加天冬酰胺酶。 在维持阶段，孩子们将重新接受皮质类固醇、地塞米松治疗，并在第 8、11、16、18 天添加天冬酰胺酶。 在第 0 天和第 11 天施用 ASP 之前以及施用 ASP 之后和以负荷剂量施用下一个剂量之前，即第 15、24、33 天，将检查脂质特性。 同样，将在维持阶段检查脂质特性，即第 8、16、21 天以及未施用 ASP 的化疗方案的每个阶段结束后。

此外，LpL 多态性（三种最常见的多态性 p.N291S、p.D9N、p.S447X）和 Apo E 多态性 [ε2(rs7412-T,rs429358-T), ε3(rs7412-C, rs429358- T）和ε4（rs7412-C，rs429358-C）]将从外周血中分离DNA并用分子技术分析后进行。

符合本研究所有纳入标准的参与者将接受检查并接受 ASP 治疗（患者组），并将与相应的健康儿童和已停止化疗至少 6 个月的儿童（对照组）进行比较).