Korelace polymorfismů lipoproteinové lipázy (LpL) a apolipoproteinu E (Apo E) s lipidovým profilem dětí s akutní lymfoblastickou eukémií během terapie L - asparaginázou.

Úvod

Malignity v dětství představují 2. příčinu úmrtí po úrazech na celém světě. Podle epidemiologických údajů se každý rok objeví 300 000 nových případů neoplazie u dětí a mladistvých do 19 let1, z toho 160 000 se týká dětí do 15 let. Nejčastějším neoplastickým onemocněním v dětské populaci jsou hematologické malignity, přičemž první místo zaujímá akutní leukémie s procentem 32,8 %, dále nádory centrálního nervového systému s procentem 21 % na druhém místě a lymfom s procentem 12. % na třetím místě.

Definice - Patofyziologie

Leukémie (L) je definována jako skupina poruch charakterizovaných nekontrolovanou proliferací bílých krvinek v důsledku primární odchylky kostní dřeně od normálu a její infiltrace nezralými nediferencovanými kmenovými buňkami. Podle definice je více než 20 % kostní dřeně infiltrováno kmenovými buňkami. Přesný patogenní mechanismus leukémie nebyl dosud objasněn, zdá se však, že je důsledkem genetické mutace a poškození multipotenciálních hematopoetických ancestrálních buněk během jednoho z jejich odlišných stádií diferenciace. Tato skutečnost vede ke klonální expanzi a inhibici diferenciace. Imunofenotyp leukemické buňky odráží úroveň diferenciace dosažené neoplastickým klonem. Leukemické buňky se dělí pomaleji a vyžadují více času na syntézu DNA ve srovnání s normálními hematopoetickými buňkami, což způsobuje anémii, trombocytopenii a neutropenii. V době diagnózy mohly leukemické buňky nejen nahradit normální buňky kostní dřeně, ale také expandovat do extramedulárních oblastí.

Různé typy leukemií jsou výjimečně heterogenní a v závislosti na původu buněk se rozlišují na lymfoblastické a nelymfoblastické leukémie. S každou z výše uvedených podskupin se můžeme setkat ve formě akutní leukémie (AL) nebo chronické leukémie (CL). U akutní formy jsou dominantní nezralé buňky krvetvorné tkáně a progrese onemocnění bez jakékoli léčby vede rychle ke smrti. U chronických forem dominují ve tkáni zralé buňky a vývoj onemocnění obecně trvá déle. U dětí se leukémie vyskytuje především v akutní formě (97 %) a ve většině případů je prezentována jako akutní lymfoblastická leukémie (ALL, 80 %). Akutní nelymfoblastická leukémie – ANLL se vyskytuje méně často (17 %) a zahrnuje akutní myeloidní leukémii – AML (15 %) a některé další vzácné formy (2 %), zatímco zbývající 3 % odpovídají chronické leukémii. AL se vyskytuje častěji ve věku od 2 do 6 let, zatímco výskyt je vyšší u chlapců než u dívek (1:1,3). 2,5 % - 5 % dětské ALL a 6 % - 14 % dětské AML se vyskytuje u kojenců mladších 1 roku. Charakteristickým typem ALL je B-buněčná ALL, která je navíc nejběžnější u dětí (85 %) ve srovnání s T-buněčnou ALL (15 %), která je mimo jiné doprovázena masy v lymfatických uzlinách mediastina. .

Epidemiologie

Ve Spojených státech amerických (USA) a ve většině zemí západní Evropy je frekvence leukémie u dětí 3,5 - 4,0 případů na 100 000 dětské populace ročně a řadí se na 20. místo příčiny úmrtí mezi zhoubnými nádory všech věkových kategorií. Z rozsáhlých kohortových studií vyplývá, že výskyt rakoviny u dětí ve vyspělých zemích každoročně stoupá o 1 %. Prevalence ALL u dětí byla poprvé zjištěna ve 30. letech 20. století ve Spojeném království (UK) a USA. V USA se ALL objevila nejprve u dětí evropského původu a poté u dětí afrického původu v 60. letech 20. století. Frekvence ALL je nižší v rozvojových a nerozvinutých zemích, což je skutečnost, která naznačuje možnou korelaci mezi industrializací a leukemogenezí.

asparagináza (ASP)

Kombinované chemoterapie používané dnes k léčbě ALL významně zlepšily dlouhodobý průběh onemocnění s celkovou pětiletou mírou přežití přesahující 80 %, zatímco příslušný poměr v 60. letech byl pod 30 %. Jedním z hlavních důvodů, které přispěly k tomuto vývoji, je intenzivní, prodloužené a vyšší dávky podávání asparaginázy. L-asparagináza (L-ASP) je základní složkou během nasycovací dávky s ohledem na dosažení remise onemocnění a podobně i během udržovací dávky se záměrem dosáhnout této remise u dětí i dospělých trpících ALL. Cytotoxický účinek exogenního podání asparaginázy je způsoben vyčerpáním rezervy asparaginu v krvi. Asparagináza působí jako katalyzátor hydrolýzy asparaginu na kyselinu asparagovou a amoniak. Asparagin je životně důležitý pro syntézu bílkovin a buněk, a tedy pro jejich přežití. Normální buňky lidského těla mají schopnost produkovat asparagin z kyseliny asparagové za pomoci enzymu asparaginsyntetázy. Neoplastické buňky však enzym buď zcela postrádají, nebo jej obsahují nepatrná množství, což vede k jejich neschopnosti syntetizovat asparagin de novo. Přežití těchto buněk a jejich schopnost syntetizovat proteiny zcela závisí na příjmu asparaginu z krve. Podávání asparaginázy tedy vede k inhibici syntézy DNA, RNA a proteinů, což následně vede k apoptóze těchto buněk. Nízké hladiny asparaginu ovlivňují pouze přežití rakovinných buněk a zdravé buňky zůstávají nerušené.

Schopnost L-ASP potlačit proliferaci leukemických buněk byla poprvé pozorována v klinických studiích v 70. letech 20. století a od tohoto okamžiku zůstala základním kamenem léčby dětské ALL. Přírodní formy enzymu produkované bakteriemi Erwinia chrysanthemi a Escherichia coli (E.Coli) se používají k léčbě, podobně jako produkt L-ASP vytvořený konjugací E. Coli. s polyethylenglykolem (Pegylated-asparaginase, PEG-ASP) s prodlouženým poločasem 5,5 dne namísto 26hodinového poločasu přirozené formy. Protokoly chemoterapie pro ALL doporučují dávkování 1 000 - 2 500 IU/m2 PEG-ASP a 5 000 - 12 000 IU/m2 přirozené formy.

Nežádoucí účinky asparaginázy

Navzdory prvořadému významu L-ASP v chemoterapeutické léčbě leukémie je odpovědný za množství toxických nežádoucích účinků, které někdy vyžadují i ​​ukončení jeho podávání. Studie prokázaly, že vynechání podávání dávek z důvodu výskytu toxických nežádoucích účinků při předchozích podáváních je spojeno se špatnou prognózou u dětí s ALL. Nejčastějšími nežádoucími účinky jsou reakce přecitlivělosti, protože studie ukazují, že jejich výskyt je až 75 %. Používaná ASP je velká molekula bakteriálního původu (zejména E. Coli) a je tak schopna vyvolat imunitní odpověď, která se zintenzivňuje po opakované expozici a hlavně po oddálení aplikace léku. Kromě klinických hypersenzitivních reakcí, které signalizují okamžitou reakci ošetřujícího zdravotnického personálu, existují také subklinické reakce, které mohou vést ke snížení účinnosti léku, které je obtížné detekovat, aby bylo možné rychle jednat. Pankreatitida je hlášena až u 18 % pacientů s ALL během léčby ASP. Patogenní mechanismus není dosud znám, ale zdá se, že na vině je pokles syntézy proteinů z orgánů s významným obratem proteinů, jako je pankreas. Navíc se má za to, že tento mechanismus je také zodpovědný za hepatotoxicitu zjištěnou během léčby asparaginázou. Kromě toho se snížení syntézy proteinů indukované ASP podílí na procesech koagulace a fibrinolýzy, což zase vede k trombotickým epizodám centrálního nervového systému a hluboké žilní trombóze končetin. Dalšími nežádoucími účinky jsou hyperglykémie v důsledku snížené produkce inzulinu a myelosuprese, zejména v důsledku zesílení supresivního účinku jiných chemoterapeutických léků. Kromě toho byly hlášeny případy encefalopatie během léčby ASP, které by mohly souviset se zvýšenými hladinami amoniaku, které jsou důsledkem rozpadu ASP.

Kritickým nežádoucím účinkem ASP, který by mohl vést k dalším komplikacím, pokud není okamžitě identifikován, je porucha metabolismu lipidů. Konkrétně se zdá, že aktivace endogenní dráhy, která produkuje triglyceridy prostřednictvím jaterní syntézy, vede k hypertriglyceridemii. Některé studie uvádějí, že míra vysokých hodnot triglyceridů je 67 % 8 - 14 dní po podání léku. Játra jsou schopna syntetizovat VLDL (Lipoproteiny s velmi nízkou hustotou), které jsou bohaté na triglyceridy. Využitím účinku enzymu Lipoprotein Lipáza (LpL), lokalizovaného na vaskulárním endotelu, se triglyceridy oddělí od VLDL a způsobí, že se VLDL přemění na IDL (Lipoproteiny střední hustoty) a následně na LDL (Lipoproteiny s nízkou hustotou). Triglyceridy jsou později extrahovány z krevního oběhového systému a uloženy v tukové tkáni, zatímco částice LDL se spojují s tkáňovými receptory nebo makrofágovými receptory. Konečné produkty rozkladu (pocházející z periferní hydrolýzy triglyceridů pomocí LpL) chylomikronů, VLDL, zbytků lipoproteinů, budou nakonec odstraněny jaterními receptory. V tomto postupu hraje důležitou roli apolipoprotein E (apo-E), který tyto zbytky váže za přítomnosti LpL a jaterní lipázy.

Lipoproteinová lipáza (LpL)

Gen LpL se nachází na chromozomu 8p22 a skládá se z 10 exonů. Bylo zaznamenáno zhruba 100 mutací, z toho 3 nejčastější, z nichž 2 jsou spojeny se sníženou funkčností LpL a zvýšeným kardiovaskulárním rizikem. Mutace známá jako polymorfismus N291S je přítomna u 2-5 % běžné populace a její existence je spojena se sníženou funkčností LpL a nerovnováhou v metabolismu VLDL [zvýšení triglyceridů, snížení HDL (High Density Lipoproteins)]. Navíc se zdá, že efekt této mutace je umocněn koexistencí dalších genetických faktorů (familiární hypercholesterolémie, apolipoprotein E2/E2). Druhá mutace, známá jako polymorfismus D9N, souvisí se zvýšeným rizikem aterosklerózy, i když mutace způsobí lehké snížení funkčnosti LpL. V poslední době bylo pozorováno, že kombinace malých nukleotidových polymorfismů (SNP) na genech Apo E a LpL označuje vysoce rizikovou skupinu pro kardiovaskulární onemocnění. A konečně, třetí mutace, se kterou se setkáváme u 20 % běžné populace, polymorfismus S447X, je spojen s mírně zvýšenými hladinami HDL a nízkými hladinami triglyceridů, a má tedy pozitivní dopad na lipidový profil.

Po dobu trvání léčby ASP je zaznamenána snížená funkčnost LpL, pravděpodobně způsobená celkově sníženou syntézou proteinů z jater, jak je zřejmé ze snížených koncentrací jiných proteinů, jako je albumin a fibrinogen. Studie prokázaly zejména, že potlačení účinků LpL je spojeno se zvýšením poměru ApoCIII/ApoCII, kde ApoCII je esenciálním kofaktorem LpL a podporuje hydrolýzu triglyceridů a ApoCIII působí jako inhibitor LpL přičemž se současně zdá, že je schopen regulovat hladiny triglyceridů v séru nezávisle na LpL. Vzniká tedy problém při čištění triglyceridů z plazmy, když jejich hladina stoupá. Dalším navrhovaným mechanismem pro vysoké hladiny triglyceridů během léčby asparaginázou je zvýšení syntézy VLDL, což se také odráží ve vysoké koncentraci apolipoproteinu ApoB100, složky VLDL.

Apolipoprotein E (Apo E)

Gen Apo E se nachází na chromozomu 19 a skládá se ze 4 exonů. Apolipoprotein E (Apo E) je jednou ze strukturálních složek lipoproteinů, které jsou bohaté na triglyceridy, a hraje důležitou roli v příjmu jaterních bílkovin. Apolipoprotein E (Apo E) má 3 alely ε2, ε3, ε4 [APOE-ε2 (cys112, cys158), APOE-ε3 (cys112, arg158) a APOE-ε4 (arg112, arg158)]. ε3 je nejběžnější v obecné populaci a obsahuje cystein na pozici 112 a arginin na pozici 158. ε4 se liší od ε3 v poloze 112, kde místo ní nahrazuje cystein za arginin55. Izomorf ε2 má slabší spojení s lipoproteinovými receptory jater, což má za následek akumulaci zbytků z chylomikronů a VLDL.

ApoE4 se váže na lipoproteinové receptory v játrech in vitro se stejnou afinitou jako ApoE3, avšak účinek ApoE4 na čištění lipoproteinů bohatých na triglyceridy in vivo není dosud definován. Alela ε2 je spojena s vyššími hladinami triglyceridů po hladovění, zatímco alela ε4 je spojena s hypercholesterolemií a vysokým LDL cholesterolem. Jedinci s genotypem E3/E4 vykazují pomalejší čištění lipoproteinů bohatých na triglyceridy ve srovnání s jedinci s genotypem E3/E3. Alela ε4 se zdá být spojena s ovlivněným metabolismem triglyceridů. Jedinci s alelou ε2 mají nižší hladiny cholesterolu ve srovnání s jedinci s alelami ε3 a ε4. Studie dále naznačují, že jedinci s genotypem E2/E4 mají vyšší hladiny triglyceridů po hladovění ve srovnání s jedinci s genotypem E3/E3.

Změny v genu ApoE vedou ke změnám v aminokyselinách kódovaného proteinu, což má za následek modifikovanou strukturu normálního proteinu. To má za následek pomalejší čištění lipoproteinů bohatých na triglyceridy. V jedné studii bylo zjištěno, že u pacientů s hypertriglyceridemií byla vyšší prevalence fenotypu E4/E3 ve srovnání s pacienty s normálními hladinami triglyceridů. Navíc nebyl pozorován žádný významný statistický rozdíl mezi hladinami triglyceridů a fenotypy ApoE po léčbě asparaginázou.

Asparaginázový a lipidový profil

Pokud jde o účinek asparaginázy na hladinu cholesterolu, studie neumožňují dospět k žádnému spolehlivému závěru, protože některé studie zjistily u malého procenta pacientů po podání léku zvýšení, jiné naznačovaly výrazné zvýšení, zatímco jiné dosud uvedly malý, ale ne významný pokles. Pokud jde o hladiny HDL, studie zjistily, že jsou nižší u dětí trpících malignitami, konkrétně hematologického typu. Další studie zaměřená na děti s ALL, během a po léčbě ASP hladiny HDL vzrostly se současným poklesem hladin Apo-A1. HDL hraje klíčovou roli v procesu zpětného přenosu cholesterolu z periferní tkáně do jater, což je mechanismus, který uděluje HDL vlastnosti antikoagulačního činidla. Fungují v tandemu s výše uvedenými vlastnostmi, další části HDL mají antioxidační, protizánětlivé, antiapoptotické a antikoagulační vlastnosti, které přispívají k ochraně proti aterogenezi. Lipoprotein Apo-A1 obsahuje hlavní strukturální protein pro HDL. Je zřejmé, že asparagináza jako inhibiční faktor syntézy proteinů by mohla případně modifikovat poměr lipidů/proteinů ve prospěch prvního na molekulách HDL. Nízké hladiny HDL a Apo-A1 byly po ukončení léčby zaznamenány i u pacientů, kteří ALL přežili bez onemocnění. Toto pozorování je zvláště důležité, pokud uvažujeme o nebezpečí ateromatózy a koronárního onemocnění kvůli nízkým hladinám HDL.

Hypertriglyceridémie se může stát jediným přispěvatelem k rozvoji akutní pankreatitidy. Když hladiny triglyceridů stoupnou nad 900 mg/dl, tvoří chylomikrony, molekuly dostatečně velké, aby mohly ucpat pankreatické kapiláry, což vede k ischemii a uvolnění pankreatické lipázy. Ten posílí lipolýzu se zvýšením volných mastných kyselin, což zase umožní uvolnění volných radikálů a prozánětlivých derivátů způsobujících v konečném důsledku zánět a nekrózu. Jak je vidět výše, asparagináza je schopna účastnit se patogeneze pankreatitidy dvěma cestami, nezávislou a závislou na triglyceridech. Hypertriglyceridémie by také mohla podporovat predispozici k trombóze u pacientů trpících ALL a léčených ASP, neboť na jedné straně je lék spojen s úpravami fibrinolytického systému, jak již bylo zmíněno, na druhé straně se zvýšením triglyceridy způsobují hyperviskozitu krve zvyšující riziko tromboembolických komplikací. Na základě případů dokumentovaných v univerzální bibliografii je zřejmé, že většina trombóz postihuje centrální nervový systém (CNS), zatímco na druhém místě jsou případy hluboké žilní trombózy horních končetin.

Na závěr je důležité dodat, že podávání ASP dětem s hematologickými malignitami ve více fázích léčby je souběžné s kortikosteroidy, buď prednisonem nebo dexamethasonem. Lze snadno pochopit, že kortikosteroidy mohou synergizovat a zesilovat nežádoucí účinky, jako je hyperlipidémie, pankreatitida a trombóza. Kromě toho může asparagináza přispívat k některým nežádoucím účinkům kortikosteroidů, jako je osteonekróza prostřednictvím hyperkoagulačního stavu, který vytváří. Protože obě tyto medikace jsou stěžejními terapeutickými faktory, je nutné velmi pečlivé a pozorné sledování stavu pacienta a výskytu nežádoucích účinků, aby bylo možné v případě potřeby zasáhnout.

Originalita

Univerzální i národní bibliografie, která se týká účinku asparaginázy na potenci LpL a Apo E a hodnoty lipidů u dětí, které trpí ALL během chemoterapie s ASP, je omezená, přičemž neexistuje žádný bibliografický odkaz, který by koreloval s genetickým pozadí k LpL a Apo E a vztah lipidového profilu. Tato studie bude poprvé zkoumat genové polymorfismy LpL a Apo E u dětí s akutní ALL během léčby ASP.

Důležitost

V této konkrétní studii se výzkumníci zaměří na výzkum lipidového profilu dětí s ALL, na vliv ASP na lipidový profil těchto pacientů a také na korelaci mezi polymorfismy lipoproteinové lipázy (LpL) a apolipoproteinu E (ApoE) s hodnoty lipidů po dobu trvání chemoterapeutického protokolu. Hypotéza, která bude testována, je, zda záznam genotypů studovaných dětí s ALL bude schopen představovat preemptivní indikativní faktor pro výsledek jejich léčby.

Tímto způsobem budou vytěženy zásadní závěry pro pravděpodobný přínos genotypů dětí, kterým je podáván L-ASP, k laboratornímu průkazu poruch lipidů v průběhu léčby, bližšímu dohledu v odpovídajících fázích léčby a včasnému terapeutickému zásahu aby se předešlo případným komplikacím.

Metodologie

Typ studie: Prospektivní případová-kontrolní studie Charakterizační epidemiologická studie je zcela v souladu s cílem naší studie, studiem vlivu ASP na lipidový profil dětí a dospívajících s ALL (skupina pacientů) a také korelací polymorfismy LpL a ApoE s lipidovými hladinami trvání chemoterapeutického protokolu. Existence dvou dalších dětských skupin, které budou fungovat jako kontrola populace (děti a dospívající ze stejné věkové skupiny, u kterých se nemoc neprojevuje, a účastníci v podobném věku, u kterých se nemoc projevila a absolvovali chemoterapii podle protokolu po dobu nejméně 6 měsíců před) specializuje náš typ studie na případovou a kontrolní studii.

Místo studie: Studie bude provedena na oddělení dětské a dorostové hematologie - onkologie 2. dětské kliniky Aristotelovy univerzity v Soluni (AUTH), ve Všeobecné nemocnici AHEPA.

Popis zaznamenaných parametrů

Při diagnostice onemocnění bude lipidový profil pacientů stanoven měřením následujících parametrů: celkový cholesterol, triglyceridy, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, apolipoprotein A1, apolipoprotein B100, lipoprotein α [Lp(α)], glukóza , sérová glutamová oxalooctová transamináza (SGOT), sérová glutamová pyruvická transamináza (SGPT), hormon stimulující štítnou žlázu (TSH), volný tyroxin (FT4), amyláza, lipáza. Kromě toho bude provedena genetická analýza polymorfismů LpL a Apo E. Podobná měření budou provedena u všech účastníků všech skupin.

Účastníci skupiny A budou okamžitě podrobeni protokolu chemoterapie ALLIC BFM 2009. Během nasycovací dávky budou tyto děti dostávat léčbu prednisolonem po dobu 33 po sobě jdoucích dnů a asparagináza bude přidána 12., 15., 18., 21., 24., 27., 30., 33. den. Během udržovací fáze budou děti nově podrobeny léčbě kortikosteroidy, dexamethasonem a 8., 11., 16., 18. den bude přidána asparagináza. Identita lipidů bude zkontrolována před podáním ASP v den 0 a 11, stejně jako po podání ASP a před podáním další dávky v nasycovací dávce, tj. 15., 24., 33. den. Podobně bude lipidová identita kontrolována v udržovací fázi, což znamená ve dnech 8, 16, 21 a také po ukončení každé fáze protokolu chemoterapie, ve které není podáván ASP.

Kromě toho zkoumání polymorfismů LpL (tři nejběžnější polymorfismy p.N291S, p.D9N, p.S447X) a polymorfismů Apo E [ε2(rs7412-T,rs429358-T), ε3(rs7412-C, rs429358- T) a ε4 (rs7412-C, rs429358-C)] budou provedeny po izolaci DNA z periferní krve a její analýze molekulárními technikami.

Účastníci, kteří splňují všechna zařazovací kritéria pro tuto studii, budou vyšetřeni a podstoupí léčbu ASP (skupina pacientů) a budou porovnáni s odpovídajícími týmy zdravých dětí a dětí, které onemocněly a jsou bez chemoterapie po dobu nejméně 6 měsíců (kontrolní skupina ).