Korrelation av polymorfismer av Lipoprotein Lipas (LpL) och Apolipoprotein E (Apo E) med lipidprofil hos barn med akut lymfoblastisk eukemi under terapi med L - Asparaginas.

Introduktion

Maligniteter under barndomen utgör den andra dödsorsaken, efter skador över hela världen. Enligt epidemiologiska data uppstår 300 000 nya fall av neoplasi varje år hos barn och tonåringar under 19 år1, varav 160 000 gäller barn under 15 år. Hematologiska maligniteter utgör den vanligaste neoplastiska sjukdomen i barnpopulationen, där akut leukemi upptar plats nummer ett med en procentandel på 32,8 %, följt av tumörer i centrala nervsystemet med en procentandel på 21 % på den andra fläcken och lymfom med en procentandel på 12 % på tredje plats.

Definition - Patofysiologi

Leukemi (L) definieras som en grupp störningar som kännetecknas av okontrollerad proliferation av vita blodkroppar, på grund av benmärgens primära divergens från det normala och dess infiltration av omogna odifferentierade stamceller. Per definition infiltreras mer än 20 % av benmärgen av stamceller. Leukemis exakta patogena mekanism har ännu inte klarlagts, den verkar dock vara resultatet av genetisk mutation och skada på de multipotentiella hematopoetiska förfäderscellerna, under ett av deras distinkta stadier av differentiering. Detta faktum leder till klonal expansion och hämning av differentiering. Den leukemiska cellens immunfenotyp återspeglar den differentieringsnivå som uppnås av den neoplastiska klonen. Leukemicellerna delar sig i en långsammare takt och kräver ytterligare tid för att syntetisera DNA jämfört med normala hematopoetiska celler som orsakar anemi, trombocytopeni och neutropeni. Vid tidpunkten för diagnosen kunde de leukemiska cellerna inte bara ha ersatt de normala cellerna i märgen utan även expanderat till extramärgområden.

De olika typerna av leukemi är exceptionellt heterogena och beroende på cellernas ursprung differentieras de till lymfoblastiska och icke-lymfoblastiska leukemier. Var och en av de ovan nämnda undergrupperna kan påträffas i dess form av akut leukemi (AL) eller kronisk leukemi (CL). I den akuta formen är de omogna cellerna i den hematopoetiska vävnaden dominerande och sjukdomens fortskridande utan behandling leder snabbt till döden. I de kroniska formerna dominerar de mogna cellerna vävnaden och utvecklingen av sjukdomen tar i allmänhet längre tid. Hos barn förekommer leukemi främst i sin akuta form (97 %) och i majoriteten av fallen presenteras den som akut lymfatisk leukemi (ALL, 80 %). Akut icke-lymfoblastisk leukemi - ANLL påträffas mer sällan (17 %) och inkluderar Akut myelogen leukemi - AML (15 %) och vissa andra sällsynta former (2 %), medan resterande 3 % motsvarar kronisk leukemi. AL förekommer oftare mellan 2 och 6 år medan incidensen är högre hos pojkar jämfört med flickor (1:1,3). 2,5 % - 5 % av barns ALL och 6 % - 14 % av barns AML påträffas hos spädbarn under 1 år. Den karakteristiska typen av ALL är B-cellen ALL, som dessutom är den vanligaste hos barn (85 %) jämfört med T-cellen ALL (15 %) som åtföljs av massor i mediastinums lymfkörtlar bland andra områden .

Epidemiologi

I USA (USA) och de flesta länder i Västeuropa är frekvensen av leukemi hos barn 3,5 - 4,0 fall per 100 000 barndomsbefolkning årligen och den rankas som den 20:e dödsorsaken bland maligniteter i alla åldrar. Man drar slutsatsen från storskaliga kohortstudier att förekomsten av barncancer i utvecklade länder ökar med 1 % varje år. Prevalensen av ALL hos barn upptäcktes för första gången på 1930-talet i Storbritannien (Storbritannien) och USA. I USA dök ALL först upp hos barn av europeisk härkomst, och därefter hos barn av afrikanskt ursprung på 1960-talet. Frekvensen av ALL är lägre i utvecklingsländer och underutvecklade länder, ett faktum som antyder en möjlig korrelation mellan industrialisering och leukemogenes.

Asparaginas (ASP)

De kombinationsbehandlingar med kemoterapi som används idag för att behandla ALL har avsevärt förbättrat sjukdomens långtidsförlopp med den totala femårsöverlevnaden som översteg 80 %, medan respektive förhållande på 1960-talet var under 30 %. En av huvudorsakerna som bidrog till denna utveckling är den intensiva, förlängda och högre doserade administreringen av asparaginas. L-asparaginas (L-ASP) är en grundläggande komponent under laddningsdosen för att uppnå remission av sjukdomen och likaså under underhållsdosen med avsikt att fastställa denna remission hos både barn och vuxna som lider av ALL. Den cytotoxiska effekten av exogen administrering av asparaginas orsakas av utarmningen av asparaginreserven i blodet. Asparaginas fungerar som en katalysator för hydrolys av asparagin till asparaginsyra och ammoniak. Asparagin är avgörande för protein- och cellsyntes och därför för deras överlevnad. Människokroppens normala celler har förmågan att producera asparagin från asparaginsyra, med hjälp av enzymet asparaginsyntetas. Emellertid saknar de neoplastiska cellerna enzymet helt eller innehåller små mängder av det, vilket resulterar i deras oförmåga att syntetisera asparagin de novo. Dessa cellers överlevnad och deras förmåga att syntetisera proteiner beror helt på att de får asparagin från blodet. Således leder administreringen av asparaginas till inhibering av DNA, RNA och proteinsyntes, vilket i sin tur resulterar i apoptos av dessa celler. De låga nivåerna av asparagin påverkar bara cancercellernas överlevnadsförmåga och lämnar de friska cellerna ostörda.

Förmågan hos L-ASP att undertrycka spridningen av leukemiceller observerades först i kliniska studier under 1970-talet, och från det ögonblicket har det förblivit hörnstenen i ALL-behandling hos barn. De naturliga formerna av enzymet, som produceras av bakterierna Erwinia chrysanthemi och Escherichia coli (E.Coli), används för behandling, ungefär som L-ASP:s produkt skapad från konjugering av E. Coli. med polyetylenglykol (Pegylated-Asparaginase, PEG-ASP) med förlängd halveringstid på 5,5 dagar istället för 26 timmars halveringstid för de naturliga formerna. Kemoterapiprotokoll för ALLA rekommenderar en dos på 1 000 - 2 500 IE/m2 PEG-ASP och 5 000 - 12 000 IE/m2 av den naturliga formen.

Biverkningar av asparaginas

Trots L-ASP:s avgörande betydelse vid kemoterapibehandling av leukemi, är det ansvarigt för en uppsjö av toxiska biverkningar som ibland till och med kräver att administreringen avbryts. Studier har visat att utelämnandet av administrering av doser på grund av uppkomsten av toxiska biverkningar vid tidigare administreringar är kopplat till dåliga prognoser hos barn med ALL. De vanligaste biverkningarna är överkänslighetsreaktioner, eftersom studier visar att deras förekomst är så hög som 75 %. Den ASP som används är en stor molekyl av bakteriellt ursprung (främst E. Coli) och kan således inducera ett immunsvar som växer mer intensivt efter upprepad exponering och främst efter en fördröjning av läkemedelsadministreringen. Förutom de kliniska överkänslighetsreaktionerna som signalerar ett omedelbart svar från den behandlande medicinska personalen, finns det även subkliniska reaktioner som kan leda till en minskning av läkemedlets styrka som är svår att upptäcka för att kunna agera snabbt. Pankreatit rapporteras i en takt så hög som 18 % av patienterna med ALL under behandling med ASP. Den patogena mekanismen är ännu inte känd, men det verkar som om felet ligger i minskningen av proteinsyntesen från organ med betydande proteinomsättning, som bukspottkörteln. Dessutom anses det att denna mekanism också är ansvarig för den levertoxicitet som detekteras under behandling med asparaginas. Dessutom är den ASP-inducerade minskningen av proteinsyntesen involverad i koagulations- och fibrinolysprocesserna, vilket i sin tur leder till trombotiska episoder av centrala nervsystemet och djup ventrombos i extremiteterna. Andra biverkningar är hyperglykemi, som ett resultat av minskad insulinproduktion och myelosuppression, främst på grund av att de andra kemoterapiläkemedlens undertryckande effekt förstärks. Vidare har det förekommit rapporter om incidenter av encefalopati under behandling med ASP som kan relateras till de förhöjda nivåerna av ammoniak som är resultatet av nedbrytningen av ASP.

En kritisk oönskad händelse av ASP som kan resultera i ytterligare komplikationer om den inte snabbt identifieras är en störning i metabolismen av lipider. Specifikt verkar det som att aktiveringen av den endogena vägen som producerar triglycerider genom leversyntes leder till hypertriglyceridemi. Vissa studier indikerar att frekvensen av höga värden av triglycerider är 67 % 8 - 14 dagar efter administrering av läkemedlet. Levern är kapabel att syntetisera VLDL (Very Low Density Lipoproteins) som är rika på triglycerider. Genom att använda effekten av enzymet Lipoprotein Lipase (LpL), som ligger på det vaskulära endotelet, lossnar triglyceriderna från VLDL vilket gör att det senare omvandlas till IDL (Intermediate Density Lipoproteins) och därefter till LDL (Low Density Lipoproteins). Triglyceriderna extraheras senare från blodcirkulationssystemet och lagras i fettvävnaden, medan LDL-partiklarna ansluter till vävnadsreceptorer eller makrofagreceptorer. Slutprodukterna av nedbrytningen (som kommer från den perifera hydrolysen av triglycerider med hjälp av LpL) av kylomikroner, VLDL, resterna av lipoproteiner, kommer så småningom att avlägsnas av leverreceptorer. Apolipoprotein E (apo-E) spelar en viktig roll i denna procedur, det binder dessa rester i närvaro av LpL och leverlipas.

Lipoprotein Lipas (LpL)

LpL-genen är belägen på kromosom 8p22 och består av 10 exoner. Det har registrerats ungefär 100 mutationer, varav 3 av dem är de vanligaste, varav 2 är kopplade till minskad funktionalitet av LpL och ökad kardiovaskulär risk. Mutationen känd som polymorfism N291S finns hos 2-5% av den allmänna befolkningen och dess existens är associerad med minskad funktionalitet av LpL och en obalans i VLDL-metabolismen [ökning av triglycerider, minskning av HDL (High Density Lipoproteins)]. Dessutom verkar det som om effekten av denna mutation förstärks av samexistensen av andra genetiska faktorer (familjär hyperkolesterolemi, apolipoprotein E2/E2). Den andra mutationen, känd som polymorfism D9N, är relaterad till ökad risk för åderförkalkning, även om mutationen orsakar en lätt minskning av funktionaliteten hos LpL. Senare har det observerats att kombinationen av små nukleotidpolymorfismer (SNP) på generna av Apo E och LpL betecknar en högriskgrupp för hjärt-kärlsjukdom. Slutligen, den tredje mutationen, som påträffas i 20% av den allmänna befolkningen, polymorfism S447X är kopplad till något förhöjda HDL-nivåer och låga nivåer av triglycerider och har således en positiv inverkan på lipidprofilen.

Under behandlingen med ASP registreras reducerad LpL-funktionalitet, troligen orsakad av den totalt reducerade proteinsyntesen från levern, vilket framgår av de minskade koncentrationerna av andra proteiner, såsom albumin och fibrinogen. Studier har särskilt visat att undertryckandet av LpL:s effekter är kopplat till en ökning av förhållandet ApoCIII/ApoCII, där ApoCII är en väsentlig cofaktor för LpL och den främjar hydrolysen av triglycerider och ApoCIII fungerar som en hämmare av LpL samtidigt som den verkar kunna reglera nivåerna av triglycerider i serumet oberoende av LpL. Följaktligen skapas ett problem i att triglyceriden rensar bort från plasman när deras nivåer stiger. En annan föreslagen mekanism för de höga nivåerna av triglycerider under behandling med asparaginas är ökningen av VLDL-syntes, vilket också återspeglas i den höga koncentrationen av apolipoprotein ApoB100, en komponent i VLDL.

Apolipoprotein E (Apo E)

Genen av Apo E är belägen på kromosom 19 och den består av 4 exoner. Apolipoprotein E (Apo E) är en av de strukturella komponenterna som ingår i lipoproteiner, som är rika på triglycerider, och det spelar en viktig roll i leverns proteinintag. Apolipoprotein E (Apo E) har 3 alleler ε2, ε3, ε4 [APOE-ε2 (cys112, cys158), APOE-ε3 (cys112, arg158) och APOE-ε4 (arg112, arg158)]. ε3 är den vanligaste i den allmänna befolkningen och den innehåller cystein i position 112 och arginin i position 158. ε4 skiljer sig från ε3 vid position 112, där istället för det ersätter cysteinet med arginin55. Isomorfen ε2 har en svagare koppling till lipoproteinreceptorerna i levern vilket resulterar i ackumulering av rester från kylomikroner och VLDL.

ApoE4 fäster till lipoproteinreceptorerna i levern in vitro och har samma affinitet som ApoE3, men effekten av ApoE4 vid rensningen av lipoproteiner rika på triglycerider in vivo är ännu odefinierad. ε2-allelen är kopplad till högre triglyceridnivåer efter fasta, medan ε4-allelen är kopplad till hyperkolesterolemi och högt LDL-kolesterol. Individer med genotyp E3/E4 uppvisar långsammare rening av lipoproteiner rika på triglycerider jämfört med individer med genotyp E3/E3. ε4-allelen ser ut att vara associerad med en påverkad triglyceridmetabolism. Individerna med ε2-allelen har lägre kolesterolnivåer jämfört med individerna med ε3- och ε4-alleler. Studier tyder vidare på att individer med genotyp E2/E4 har högre triglyceridnivåer efter fasta i förhållande till individer med genotyp E3/E3.

Förändringar i ApoE-genen leder till förändringar i aminosyrorna i det kodade proteinet, vilket resulterar i en modifierad struktur hos det normala proteinet. Det senare resulterar i en långsammare rening av lipoproteiner rika på triglycerider. I en studie avslöjades att det fanns en högre prevalens av fenotypen E4/E3 hos patienter med hypertriglyceridemi jämfört med patienter med normala triglyceridnivåer. Dessutom observerades ingen signifikant statistisk skillnad mellan triglyceridnivåer och fenotyperna av ApoE efter behandling med asparaginas.

Asparaginas och lipidprofil

När det gäller effekten av asparaginas på kolesterolnivåerna, tillåter studierna inte att nå någon tillförlitlig slutsats, eftersom vissa studier fann en ökning hos en liten andel av patienterna efter att ha administrerat läkemedlet, andra indikerade en signifikant ökning, medan andra ännu presenterade en liten men inte signifikant minskning. När det gäller HDL-nivåerna har studier upptäckt att de är lägre hos barn som lider av maligniteter, speciellt av hematologisk typ. En annan studie med fokus på barn med ALL, under och efter behandling med ASP steg HDL-nivåerna samtidigt som Apo-A1-nivåerna föll. HDL spelar en avgörande roll i processen för omvänd överföring av kolesterol från den perifera vävnaden till levern, en mekanism som ger HDL egenskaperna hos ett antikoagulerande medel. Fungerar tillsammans med de ovan nämnda egenskaperna, andra delar av HDL har antioxiderande, antiinflammatoriska, anti-apoptotiska och antikoagulerande egenskaper som bidrar till att skydda mot aterogenes. Lipoprotein Apo-A1 utgör det huvudsakliga strukturella proteinet för HDL. Det är uppenbart att asparaginas som en hämmande faktor för proteinsyntes möjligen skulle kunna modifiera förhållandet mellan lipider/proteiner till förmån för det första på HDL-molekylerna. Låga HDL- och Apo-A1-nivåer har noterats även hos personer som överlevt ALL utan sjukdom efter avslutad behandling. Denna observation är särskilt viktig om man tänker på risken för ateromatos och kranskärlssjukdom på grund av låga nivåer av HDL.

Hypertriglyceridemi kan bli den enda bidragsgivaren till utvecklingen av akut pankreatit. När nivåerna av triglycerider stiger över 900 mg/dl bildar de kylomikroner, molekyler som är tillräckligt stora för att de kan blockera bukspottkörtelns kapillärer vilket leder till ischemi och frisättning av bukspottkörtellipas. Det senare kommer att förstärka lipolysen med en ökning av fria fettsyror som i sin tur kommer att tillåta frisättning av fria radikaler och pro-inflammatoriska derivat, vilket i slutändan orsakar inflammation och nekros. Som framgått ovan kan asparaginas delta i patogenesen av pankreatit genom två vägar, en oberoende och en beroende av triglycerider. Hypertriglyceridemi kan också främja en anlag för trombos hos patienter som lider av ALL och som är under behandling med ASP, eftersom läkemedlet å ena sidan är kopplat till modifieringar av det fibrinolytiska systemet, som redan nämnts, samtidigt som å andra sidan ökningen av triglycerider orsakar hyperviskositet i blodet vilket ökar risken för tromboemboliska komplikationer. Med ledning av de fall som dokumenterats i den universella bibliografin görs det klart att majoriteten av tromboserna involverar det centrala nervsystemet (CNS), medan på andra plats fall av djup ventrombos i de övre extremiteterna.

Slutligen är det viktigt att tillägga att administrering av ASP till barn med hematologiska maligniteter i flera faser av behandlingen administreras samtidigt med kortikosteroider, antingen prednison eller dexametason. Det kan lätt uppfattas att kortikosteroider kan synergisera och intensifiera biverkningarna, såsom hyperlipidemi, pankreatit och trombos. Dessutom kan asparaginas bidra till vissa biverkningar av kortikosteroiderna, såsom osteonekros genom det hyperkoagulerande tillstånd som det skapar. Eftersom båda dessa mediciner är centrala terapeutiska faktorer, krävs en mycket noggrann och uppmärksam övervakning av patientens tillstånd och uppkomsten av biverkningar för att kunna ingripa vid behov.

Originalitet

Både den universella och nationella bibliografin som avser effekten av asparaginas på styrkan av LpL och Apo E och till värdena av lipiderna hos barn som lider av ALL under kemoterapi med ASP är begränsad, medan det inte finns någon bibliografisk referens som korrelerar den genetiska bakgrund till LpL och Apo E och förhållandet mellan lipidprofilen. Den aktuella studien kommer för första gången att undersöka genpolymorfismer av LpL och Apo E hos barn med akut ALL under behandling med ASP.

Betydelse

I denna speciella studie kommer utredarna att fokusera på att undersöka lipidprofilen hos barn med ALL, på effekten av ASP på lipidprofilen hos dessa patienter, samt korrelationen mellan polymorfismerna av lipoproteinlipas (LpL) och Apolipoprotein E (ApoE) med värdena av lipider under hela det kemoterapeutiska protokollet. Hypotesen som kommer att testas är huruvida registrering av genotyperna för de undersökta barnen med ALL kommer att kunna utgöra en förebyggande indikativ faktor för resultatet av deras behandling.

På detta sätt kommer viktiga slutsatser att dras för det sannolika bidraget från genotyper av barn som administreras L-ASP till laboratoriepåvisandet av lipidrubbningar under behandlingen, den närmare övervakningen under motsvarande faser av behandlingen och den terapeutiska interventionen i tid för att för att förhindra eventuella komplikationer.

Metodik

Studietyp: Prospektiv fall-kontrollstudie Den karakteriseringsepidemiologiska studien är helt i överensstämmelse med syftet med vår studie, en studie av effekten av ASP på lipidprofilen hos barn och ungdomar med ALL (patientgrupp) samt korrelationen mellan polymorfismerna av LpL och ApoE med lipidnivåernas varaktighet för det kemoterapeutiska protokollet. Förekomsten av ytterligare två barngrupper som kommer att fungera som befolkningskontroll (barn och ungdomar i samma åldersgrupp som inte manifesterar sjukdomen och deltagare i liknande åldrar som har manifesterat sjukdomen och som har genomfört kemoterapi enligt protokollet i minst 6 månader innan) specialiserar vår studietyp till en fallkontrollstudie.

Studieplats: Studien kommer att genomföras i Pediatric and Adolescent Hematology - Oncology Unit vid 2nd Department of Peediatrics, Aristoteles University of Thessaloniki (AUTH), vid University General Hospital AHEPA.

Beskrivning av de registrerade parametrarna

Under diagnosen av sjukdomen kommer lipidprofilen för patienten att bestämmas genom att mäta följande parametrar: totalkolesterol, triglycerider, HDL-kolesterol, LDL-kolesterol, apolipoprotein A1, apolipoprotein B100, lipoprotein α [Lp(α)], glukos , Serum glutaminsyraoxaloättiksyratransaminas (SGOT), serumglutaminpyruvictransaminas (SGPT), sköldkörtelstimulerande hormon (TSH), fritt tyroxin (FT4), amylas, lipas. Dessutom kommer en genetisk analys för polymorfismer av LpL och Apo E att genomföras. Liknande mätningar kommer att göras för alla deltagare i alla grupper.

Deltagarna i grupp A kommer omedelbart att utsättas för kemoterapiprotokollet ALLIC BFM 2009. Under laddningsdosen kommer dessa barn att få behandling med prednisolon i 33 dagar i följd och asparaginas tillsätts dag 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33. Under underhållsfasen kommer barnen att på nytt utsättas för behandling med kortikosteroider, dexametason och asparaginas kommer att läggas till dag 8, 11, 16, 18. Lipididentiteten kommer att kontrolleras före administrering av ASP på dag 0 och 11 samt efter administrering av ASP och före administrering av nästa dos vid laddningsdosen, vilket betyder dag 15, 24, 33. På liknande sätt kommer lipididentiteten att kontrolleras på underhållsfasen, vilket innebär dag 8, 16, 21 såväl som efter slutet av varje fas av kemoterapiprotokoll där ASP inte administreras.

Dessutom en undersökning av LpL-polymorfismer (de tre vanligaste polymorfismerna p.N291S, p.D9N, p.S447X) och av Apo E-polymorfismer [ε2(rs7412-T,rs429358-T), ε3(rs7412-43-C, 58rs T) och ε4 (rs7412-C, rs429358-C)] kommer att utföras efter att DNA har isolerats från det perifera blodet och analyserats med molekylära tekniker.

Deltagare som uppfyller alla inklusionskriterier för denna studie kommer att undersökas och genomgå behandling med ASP (patientgrupp) och kommer att jämföras med motsvarande team av friska barn och barn som har sjuka och är frånvarande kemoterapi i minst 6 månader (kontrollgrupp) ).