Correlazione dei polimorfismi della lipoproteina lipasi (LpL) e dell'apolipoproteina E (Apo E) con il profilo lipidico dei bambini con eucemia linfoblastica acuta durante la terapia con L-asparaginasi.

introduzione

I tumori maligni durante l'infanzia costituiscono la seconda causa di morte, dopo gli infortuni in tutto il mondo. Secondo i dati epidemiologici, ogni anno si presentano 300.000 nuovi casi di neoplasia in bambini e adolescenti sotto i 19 anni1, di cui 160.000 riguardano bambini sotto i 15 anni. Le neoplasie ematologiche costituiscono la malattia neoplastica più diffusa nella popolazione infantile, con la leucemia acuta che occupa il primo posto con una percentuale del 32,8%, seguita dai tumori del sistema nervoso centrale con una percentuale del 21% al secondo posto e dal linfoma con una percentuale del 12%. % al terzo posto.

Definizione - Fisiopatologia

La leucemia (L) è definita come un gruppo di perturbazioni caratterizzate da una proliferazione incontrollata di globuli bianchi, dovuta alla divergenza primaria del midollo osseo dal normale e alla sua infiltrazione da parte di cellule staminali immature indifferenziate. Per definizione, più del 20% del midollo osseo è infiltrato da cellule staminali. L'esatto meccanismo patogenetico della leucemia non è stato ancora chiarito, ma sembra essere il risultato di una mutazione genetica e di un danno alle cellule ancestrali ematopoietiche multipotenti, durante uno dei loro distinti stadi di differenziazione. Questo fatto porta all'espansione clonale e all'inibizione della differenziazione. L'immunofenotipo della cellula leucemica riflette il livello di differenziazione raggiunto dal clone neoplastico. Le cellule leucemiche si dividono a un ritmo più lento e richiedono più tempo per sintetizzare il DNA rispetto alle normali cellule ematopoietiche causando anemia, trombocitopenia e neutropenia. Al momento della diagnosi, le cellule leucemiche avrebbero potuto non solo sostituire le normali cellule del midollo ma anche espandersi in aree extramidollari.

I vari tipi di leucemia sono eccezionalmente eterogenei e, a seconda dell'origine delle cellule, si differenziano in leucemie linfoblastiche e non linfoblastiche. Ciascuno dei sottogruppi sopra menzionati può essere incontrato nella sua forma di leucemia acuta (AL) o di leucemia cronica (CL). Nella forma acuta predominano le cellule immature del tessuto ematopoietico e la progressione della malattia senza alcun trattamento porta rapidamente alla morte. Nelle forme croniche, le cellule mature dominano il tessuto e lo sviluppo della malattia, generalmente, richiede più tempo. Nei bambini, la leucemia si riscontra principalmente nella sua forma acuta (97%) e nella maggior parte dei casi si presenta come leucemia linfoblastica acuta (LLA, 80%). La leucemia acuta non linfoblastica - ANLL si riscontra meno frequentemente (17%) e comprende la leucemia mieloide acuta - AML (15%) e alcune altre forme rare (2%), mentre il restante 3% corrisponde alla leucemia cronica. L'AL si verifica più spesso tra i 2 ei 6 anni di età, mentre l'incidenza è maggiore nei maschi rispetto alle femmine (1:1,3). Il 2,5% - 5% della LAL infantile e il 6% - 14% della LMA infantile si riscontrano nei bambini di età inferiore a 1 anno. Il tipo caratteristico di LLA è la LLA a cellule B, che è inoltre la più comune nei bambini (85%) rispetto alla LLA a cellule T (15%) che è accompagnata da masse nei linfonodi del mediastino tra le altre aree .

Epidemiologia

Negli Stati Uniti d'America (USA) e nella maggior parte dei paesi dell'Europa occidentale, la frequenza della leucemia nei bambini è di 3,5 - 4,0 casi per 100.000 bambini all'anno ed è classificata come la 20a causa di morte tra i tumori maligni di tutte le età. Da studi di coorte su larga scala si deduce che l'incidenza del cancro infantile nei paesi sviluppati aumenta dell'1% ogni anno. La prevalenza di LLA nei bambini è stata rilevata per la prima volta negli anni '30 nel Regno Unito (Regno Unito) e negli Stati Uniti. Negli Stati Uniti, ALL è apparso prima nei bambini di origine europea e, successivamente, nei bambini di origine africana negli anni '60. La frequenza di ALL è inferiore nei paesi in via di sviluppo e sottosviluppati, un fatto che suggerisce una possibile correlazione tra industrializzazione e leucemogenesi.

Asparaginasi (ASP)

I trattamenti combinati chemioterapici utilizzati oggi per trattare la LLA hanno migliorato significativamente il decorso a lungo termine della malattia con un tasso complessivo di sopravvivenza a cinque anni superiore all'80%, mentre il rispettivo rapporto negli anni '60 era inferiore al 30%. Uno dei motivi principali che hanno contribuito a questo sviluppo è la somministrazione intensiva, prolungata ea dosi più elevate di Asparaginase. L-Asparaginasi (L-ASP) è un componente fondamentale durante la dose di carico per quanto riguarda il raggiungimento della remissione della malattia e, allo stesso modo, durante la dose di mantenimento con l'intenzione di stabilire tale remissione sia nei bambini che negli adulti affetti da LAL. L'effetto citotossico della somministrazione esogena di asparaginasi è causato dall'esaurimento della riserva di asparagina nel sangue. L'asparaginasi funge da catalizzatore per l'idrolisi dell'asparagina ad acido aspartico e ammoniaca. L'asparagina è vitale per la sintesi proteica e cellulare e, quindi, per la loro sopravvivenza. Le normali cellule del corpo umano hanno la capacità di produrre asparagina dall'acido aspartico, con l'assistenza dell'enzima asparagina sintetasi. Tuttavia, le cellule neoplastiche mancano completamente dell'enzima o ne contengono piccole quantità con conseguente incapacità di sintetizzare l'asparagina de novo. La sopravvivenza di queste cellule e la loro capacità di sintetizzare le proteine ​​dipende interamente dalla ricezione di asparagina dal sangue. Pertanto, la somministrazione di asparaginasi porta all'inibizione della sintesi di DNA, RNA e proteine ​​che, a sua volta, provoca l'apoptosi di queste cellule. I bassi livelli di asparagina influenzano solo la sopravvivenza delle cellule tumorali, lasciando indisturbate le cellule sane.

La capacità di L-ASP di sopprimere la proliferazione delle cellule leucemiche è stata osservata per la prima volta negli studi clinici negli anni '70 e da quel momento è rimasta la pietra angolare del trattamento della LLA infantile. Le forme naturali dell'enzima, prodotte dai batteri Erwinia chrysanthemi ed Escherichia coli (E.Coli), vengono utilizzate per il trattamento, proprio come il prodotto di L-ASP creato dalla coniugazione di E. Coli. con polietilenglicole (Pegylated-Asparaginase, PEG-ASP) con emivita prolungata di 5,5 giorni invece dell'emivita di 26 ore delle forme naturali. I protocolli chemioterapici per ALL raccomandano un dosaggio di 1.000 - 2.500 UI/m2 di PEG-ASP e 5.000 - 12.000 UI/m2 della forma naturale.

Reazioni avverse dell'asparaginasi

Nonostante l'importanza fondamentale di L-ASP nel trattamento chemioterapico della leucemia, è responsabile di una pletora di effetti avversi tossici che a volte richiedono anche l'interruzione della sua somministrazione. Gli studi hanno dimostrato che l'omissione della somministrazione di dosi dovuta alla comparsa di effetti avversi tossici nelle somministrazioni precedenti è legata a prognosi sfavorevole nei bambini con LLA. Gli effetti avversi più comuni sono le reazioni di ipersensibilità, poiché gli studi indicano che il loro tasso di occorrenza raggiunge il 75%. L'ASP che si sta utilizzando è una grossa molecola di origine batterica (principalmente E. Coli) e quindi è in grado di indurre una risposta immunitaria che diventa più intensa dopo ripetute esposizioni e, soprattutto, dopo un ritardo nella somministrazione del farmaco. Oltre alle reazioni di ipersensibilità clinica che segnalano una risposta immediata da parte del personale medico curante, esistono anche reazioni subcliniche che possono portare a una diminuzione della potenza del farmaco difficile da rilevare per agire rapidamente. La pancreatite è segnalata a un tasso pari al 18% dei pazienti con ALL durante il trattamento con ASP. Il meccanismo patogenetico non è ancora noto, tuttavia sembra che la colpa sia della diminuzione della sintesi proteica da parte di organi con un significativo ricambio proteico, come il pancreas. Inoltre, si ritiene che questo meccanismo sia anche responsabile dell'epatotossicità rilevata durante il trattamento con asparaginasi. Inoltre, la diminuzione della sintesi proteica indotta da ASP è coinvolta nei processi di coagulazione e fibrinolisi che a loro volta portano a episodi trombotici del sistema nervoso centrale e trombosi venosa profonda delle estremità. Altre reazioni avverse sono l'iperglicemia, come conseguenza della ridotta produzione di insulina e la mielosoppressione, dovuta principalmente al potenziamento dell'effetto soppressivo degli altri farmaci chemioterapici. Inoltre, sono stati segnalati episodi di encefalopatia durante la terapia con ASP che potrebbero essere correlati ai livelli elevati di ammoniaca che derivano dalla scomposizione dell'ASP.

Un evento avverso critico di ASP che potrebbe causare ulteriori complicazioni se non viene identificato tempestivamente è un disturbo nel metabolismo dei lipidi. Nello specifico, sembra che l'attivazione della via endogena che produce trigliceridi attraverso la sintesi epatica porti all'ipertrigliceridemia. Alcuni studi indicano che il tasso di valori elevati di trigliceridi è del 67% 8 - 14 giorni dopo la somministrazione del medicinale. Il fegato è in grado di sintetizzare le VLDL (Very Low Density Lipoproteins) ricche di trigliceridi. Sfruttando l'effetto dell'enzima Lipoproteina Lipasi (LpL), localizzato sull'endotelio vascolare, i trigliceridi si staccano dalle VLDL provocando la trasformazione di queste ultime in IDL (Lipoproteine ​​a Densità Intermedia) e successivamente in LDL (Lipoproteine ​​a Bassa Densità). I trigliceridi vengono successivamente estratti dal sistema circolatorio sanguigno e immagazzinati nel tessuto adiposo, mentre le particelle LDL si connettono con i recettori tissutali o con i recettori dei macrofagi. I prodotti finali della degradazione (provenienti dall'idrolisi periferica dei trigliceridi con l'ausilio di LpL) dei chilomicroni, le VLDL, i resti delle lipoproteine, verranno infine rimossi dai recettori epatici. L'apolipoproteina E (apo-E) svolge un ruolo importante in questa procedura, lega questi residui in presenza di LpL e lipasi epatica.

Lipoproteina Lipasi (LpL)

Il gene LpL si trova sul cromosoma 8p22 ed è composto da 10 esoni. Sono state registrate circa 100 mutazioni, di cui 3 sono le più comuni, 2 delle quali sono collegate alla ridotta funzionalità di LpL e all'aumento del rischio cardiovascolare. La mutazione nota come polimorfismo N291S è presente nel 2-5% della popolazione generale e la sua esistenza è associata a una ridotta funzionalità di LpL e uno squilibrio nel metabolismo delle VLDL [aumento dei trigliceridi, diminuzione delle HDL (lipoproteine ​​ad alta densità)]. Inoltre, sembra che l'effetto di questa mutazione sia amplificato dalla coesistenza di altri fattori genetici (ipercolesterolemia familiare, apolipoproteina E2/E2). La seconda mutazione, nota come polimorfismo D9N, è correlata all'aumento del rischio di aterosclerosi, anche se la mutazione provoca una leggera diminuzione della funzionalità di LpL. Recentemente, è stato osservato che la combinazione di piccoli polimorfismi nucleotidici (SNP) sui geni di Apo E e di LpL denomina un gruppo ad alto rischio di malattie cardiovascolari. Infine, la terza mutazione, riscontrata nel 20% della popolazione generale, il polimorfismo S447X è legata a livelli di HDL leggermente elevati e bassi livelli di trigliceridi e quindi ha un impatto positivo sul profilo lipidico.

Lungo la durata del trattamento con ASP si registra una ridotta funzionalità di LpL, probabilmente causata dalla del tutto ridotta sintesi proteica da parte del fegato, come risulta evidente dalle diminuite concentrazioni di altre proteine, quali albumina e fibrinogeno. Gli studi hanno dimostrato, in particolare, che la soppressione degli effetti della LpL è correlata ad un aumento del rapporto ApoCIII/ApoCII, dove ApoCII è un cofattore essenziale della LpL e promuove l'idrolisi dei trigliceridi e ApoCIII funge da inibitore della LpL mentre contemporaneamente sembra essere in grado di regolare i livelli di trigliceridi nel siero indipendentemente dalla LpL. Quindi, si crea un problema nella pulizia dei trigliceridi dal plasma man mano che i loro livelli aumentano. Un altro meccanismo suggerito per gli alti livelli di trigliceridi durante il trattamento con asparaginasi è l'aumento della sintesi di VLDL, che si riflette anche nell'elevata concentrazione di apolipoproteina ApoB100, un componente delle VLDL.

Apolipoproteina E (Apo E)

Il gene dell'Apo E è situato sul cromosoma 19 ed è composto da 4 esoni. L'apolipoproteina E (Apo E) è uno dei componenti strutturali inclusi nelle lipoproteine, ricche di trigliceridi, e svolge un ruolo importante nell'assunzione di proteine ​​epatiche. L'apolipoproteina E (Apo E) ha 3 alleli ε2, ε3, ε4 [APOE-ε2 (cys112, cys158), APOE-ε3 (cys112, arg158) e APOE-ε4 (arg112, arg158)]. ε3 è il più comune nella popolazione generale e contiene cisteina in posizione 112 e arginina in posizione 158. ε4 differisce da ε3 in posizione 112, dove invece sostituisce la cisteina con l'arginina55. L'isomorfo ε2 ha una connessione più debole con i recettori delle lipoproteine ​​del fegato che si traduce nell'accumulo di resti di chilomicroni e VLDL.

L'ApoE4 si lega ai recettori delle lipoproteine ​​nel fegato in vitro avendo la stessa affinità dell'ApoE3, tuttavia l'effetto dell'ApoE4 nella pulizia delle lipoproteine ​​ricche di trigliceridi in vivo non è ancora definito. L'allele ε2 è collegato a livelli più alti di trigliceridi dopo il digiuno, mentre l'allele ε4 è collegato a ipercolesterolemia e colesterolo LDL alto. Gli individui con il genotipo E3/E4 mostrano una pulizia più lenta delle lipoproteine ​​ricche di trigliceridi rispetto agli individui con il genotipo E3/E3. L'allele ε4 sembra essere associato a un metabolismo dei trigliceridi interessato. Gli individui con l'allele ε2 hanno livelli di colesterolo più bassi rispetto agli individui con alleli ε3 e ε4. Gli studi indicano, inoltre, che gli individui con genotipo E2/E4 hanno livelli di trigliceridi più elevati dopo il digiuno rispetto agli individui con genotipo E3/E3.

Le alterazioni nel gene ApoE portano a cambiamenti negli aminoacidi della proteina codificata, che si traduce in una struttura modificata della proteina normale. Quest'ultimo si traduce in una pulizia più lenta delle lipoproteine ​​ricche di trigliceridi. In uno studio, è stato rivelato che vi era una maggiore prevalenza del fenotipo E4/E3 nei pazienti con ipertrigliceridemia rispetto ai pazienti con livelli normali di trigliceridi. Inoltre, non è stata osservata alcuna differenza statistica significativa tra i livelli di trigliceridi e i fenotipi di ApoE dopo il trattamento con asparaginasi.

Asparaginasi e profilo lipidico

Per quanto riguarda l'effetto dell'asparaginasi sui livelli di colesterolo, gli studi non consentono di giungere ad alcuna conclusione attendibile, in quanto alcuni studi hanno rilevato un aumento in una piccola percentuale di pazienti dopo la somministrazione del medicinale, altri hanno indicato un aumento significativo, mentre altri ancora hanno presentato una piccola ma non significativa diminuzione. Per quanto riguarda i livelli di HDL, gli studi hanno scoperto che sono più bassi nei bambini affetti da neoplasie, in particolare di tipo ematologico. Un altro studio incentrato su bambini con ALL, durante e dopo il trattamento con ASP i livelli di HDL sono aumentati con un calo simultaneo dei livelli di Apo-A1. L'HDL svolge un ruolo cruciale nel processo di trasferimento inverso del colesterolo dal tessuto periferico al fegato, meccanismo che conferisce all'HDL le proprietà di un agente anticoagulante. Funzionando in tandem con le suddette proprietà, altre parti di HDL hanno proprietà antiossidanti, antinfiammatorie, anti-apoptotiche e anticoagulanti che contribuiscono alla salvaguardia contro l'aterogenesi. La lipoproteina Apo-A1 comprende la principale proteina strutturale per HDL. È evidente che l'asparaginasi come fattore inibitorio della sintesi proteica potrebbe eventualmente modificare il rapporto lipidi/proteine ​​a favore del primo sulle molecole di HDL. Bassi livelli di HDL e Apo-A1 sono stati osservati anche nei sopravvissuti liberi da malattia di ALL dopo la fine del trattamento. Questa osservazione è di particolare importanza se si pensa al pericolo di ateromatosi e malattia coronarica dovuta a bassi livelli di HDL.

L'ipertrigliceridemia è in grado di diventare l'unico contributore allo sviluppo della pancreatite acuta. Quando i livelli di trigliceridi superano i 900 mg/dl si formano i chilomicroni, molecole di dimensioni tali da poter ostruire i capillari pancreatici portando all'ischemia e al rilascio di lipasi pancreatica. Quest'ultimo rafforzerà la lipolisi con un aumento degli acidi grassi liberi che, a loro volta, permetteranno il rilascio di radicali liberi e derivati ​​pro-infiammatori causando, alla fine, infiammazione e necrosi. Come visto in precedenza, l'asparaginasi è in grado di prendere parte alla patogenesi della pancreatite attraverso due vie, una indipendente e una dipendente dai trigliceridi. L'ipertrigliceridemia potrebbe anche favorire una predisposizione alla trombosi in pazienti affetti da LLA e in cura con ASP, in quanto da un lato il farmaco è collegato a modificazioni del sistema fibrinolitico, come già accennato, dall'altro dall'altro l'aumento di i trigliceridi provocano iperviscosità del sangue aumentando il rischio di complicanze tromboemboliche. Attingendo ai casi documentati nella bibliografia universale, si evince che la maggior parte delle trombosi coinvolge il sistema nervoso centrale (SNC), mentre al secondo posto vi sono i casi di trombosi venosa profonda degli arti superiori.

Infine, è significativo aggiungere che la somministrazione di ASP a bambini con neoplasie ematologiche in più fasi del trattamento è co-somministrata con corticosteroidi, prednisone o desametasone. Si può facilmente percepire che i corticosteroidi possono sinergizzare e intensificare gli eventi avversi, come l'iperlipidemia, la pancreatite e la trombosi. Inoltre, l'asparaginasi può contribuire ad alcuni eventi avversi dei corticosteroidi, come l'osteonecrosi, attraverso lo stato di ipercoagulante che crea. Poiché entrambi questi farmaci sono fattori terapeutici cardine, è necessario un monitoraggio molto attento e attento delle condizioni del paziente e dell'insorgenza di eventi avversi per poter intervenire se necessario.

Originalità

Sia la bibliografia universale che quella nazionale che riguarda l'effetto dell'asparaginasi sulla potenza di LpL e Apo E e sui valori dei lipidi nei bambini che soffrono di LLA durante chemioterapia con ASP è limitata, mentre non esiste alcun riferimento bibliografico che correli la genetica background di LpL e Apo E e la relazione del profilo lipidico. L'attuale studio esaminerà per la prima volta i polimorfismi genici di LpL e Apo E nei bambini con ALL acuta durante il trattamento con ASP.

Importanza

In questo particolare studio i ricercatori si concentreranno sulla ricerca del profilo lipidico dei bambini con LLA, sull'effetto dell'ASP sul profilo lipidico di questi pazienti, nonché sulla correlazione tra i polimorfismi della lipoproteina lipasi (LpL) e dell'apolipoproteina E (ApoE) con i valori dei lipidi per tutta la durata del protocollo chemioterapico. L'ipotesi che verrà verificata è se la registrazione dei genotipi dei bambini in studio con LLA possa costituire un fattore indicativo preventivo per l'esito del loro trattamento.

In questo modo, verranno estratte conclusioni vitali per il probabile contributo dei genotipi di bambini a cui viene somministrato L-ASP alla dimostrazione in laboratorio dei disturbi lipidici durante il trattamento, la più stretta supervisione durante le corrispondenti fasi del trattamento e l'intervento terapeutico tempestivo per per prevenire eventuali complicazioni.

Metodologia

Tipo di studio: studio prospettico caso-controllo Lo studio epidemiologico di caratterizzazione è in completo accordo con lo scopo del nostro studio, uno studio dell'effetto dell'ASP sul profilo lipidico di bambini e adolescenti con LLA (gruppo di pazienti) nonché la correlazione di i polimorfismi di LpL e ApoE con la durata dei livelli lipidici del protocollo chemioterapico. L'esistenza di due ulteriori gruppi di bambini che fungeranno da controllo della popolazione (bambini e adolescenti della stessa fascia di età che non manifestano la malattia e partecipanti di età simili che hanno manifestato la malattia e hanno completato la chemioterapia come da protocollo per almeno 6 mesi prima) specializza il nostro tipo di studio in uno studio caso-controllo.

Sito dello studio: Lo studio sarà condotto nell'Unità di Ematologia Pediatrica e Adolescenziale - Oncologia del 2° Dipartimento di Pediatria, Università Aristotele di Salonicco (AUTH), presso l'Ospedale Generale Universitario AHEPA.

Descrizione dei parametri registrati

Durante la diagnosi della malattia, il profilo lipidico dei pazienti sarà determinato misurando i seguenti parametri: colesterolo totale, trigliceridi, colesterolo HDL, colesterolo LDL, apolipoproteina A1, apolipoproteina B100, lipoproteina α [Lp(α)], glucosio , transaminasi sierica glutammico-ossalacetica (SGOT), transaminasi sierica glutammico piruvica (SGPT), ormone stimolante la tiroide (TSH), tiroxina libera (FT4), amilasi, lipasi. Inoltre, sarà condotta un'analisi genetica per i polimorfismi di LpL e Apo E. Misure simili verranno effettuate a tutti i partecipanti di tutti i gruppi.

I partecipanti del gruppo A saranno immediatamente sottoposti al protocollo chemioterapico ALLIC BFM 2009. Durante la dose di carico, questi bambini riceveranno un trattamento con prednisolone per 33 giorni consecutivi e l'asparaginasi verrà aggiunta nei giorni 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33. Durante la fase di mantenimento i bambini saranno nuovamente sottoposti a trattamento con corticosteroidi, desametasone e verrà aggiunta asparaginasi nei giorni 8, 11, 16, 18. L'identità lipidica verrà controllata prima della somministrazione di ASP nei giorni 0 e 11, nonché dopo la somministrazione di ASP e prima della somministrazione della dose successiva alla dose di carico, ovvero i giorni 15, 24, 33. Analogamente, l'identità lipidica verrà controllata nella fase di mantenimento, ovvero nei giorni 8, 16, 21 nonché dopo la fine di ogni fase del protocollo chemioterapico in cui non viene somministrato ASP.

Inoltre, un esame dei polimorfismi LpL (i tre più comuni polimorfismi p.N291S, p.D9N, p.S447X) e dei polimorfismi Apo E [ε2(rs7412-T,rs429358-T), ε3(rs7412-C, rs429358- T) e ε4 (rs7412-C, rs429358-C)] saranno eseguiti dopo aver isolato il DNA dal sangue periferico e analizzato con tecniche molecolari.

I partecipanti che soddisfano tutti i criteri di inclusione per questo studio saranno esaminati e sottoposti a trattamento con ASP (gruppo di pazienti) e saranno confrontati con i corrispondenti team di bambini sani e bambini che hanno sofferto e sono fuori dalla chemioterapia per almeno 6 mesi (gruppo di controllo ).