Korelacja polimorfizmów lipazy lipoproteinowej (LpL) i apolipoproteiny E (Apo E) z profilem lipidowym dzieci z ostrą eukemią limfoblastyczną podczas terapii L-asparaginazą.

Wstęp

Nowotwory wieku dziecięcego stanowią drugą, po urazach, przyczynę zgonów na całym świecie. Według danych epidemiologicznych co roku stwierdza się 300 000 nowych zachorowań na nowotwory u dzieci i młodzieży do 19 roku życia1, z czego 160 000 dotyczy dzieci do 15 roku życia. Nowotwory układu krwiotwórczego są najczęstszą chorobą nowotworową populacji dziecięcej, na pierwszym miejscu znajduje się ostra białaczka z odsetkiem 32,8%, na drugim miejscu plasują się guzy ośrodkowego układu nerwowego z odsetkiem 21% i chłoniaki z odsetkiem 12 % na trzecim miejscu.

Definicja - Patofizjologia

Białaczka (L) jest zdefiniowana jako grupa zaburzeń charakteryzujących się niekontrolowaną proliferacją białych krwinek, spowodowaną pierwotną rozbieżnością szpiku kostnego z prawidłowym i naciekaniem go przez niedojrzałe, niezróżnicowane komórki macierzyste. Z definicji ponad 20% szpiku kostnego jest naciekane przez komórki macierzyste. Dokładny mechanizm patogenetyczny białaczki nie został jeszcze wyjaśniony, wydaje się jednak, że jest wynikiem mutacji genetycznej i uszkodzenia multipotencjalnych krwiotwórczych komórek przodków podczas jednego z ich odrębnych etapów różnicowania. Fakt ten prowadzi do ekspansji klonalnej i zahamowania różnicowania. Immunofenotyp komórki białaczkowej odzwierciedla poziom zróżnicowania osiągnięty przez klon nowotworowy. Komórki białaczkowe dzielą się wolniej i wymagają dodatkowego czasu na syntezę DNA w porównaniu do normalnych komórek krwiotwórczych, powodując anemię, małopłytkowość i neutropenię. W momencie rozpoznania komórki białaczkowe mogły nie tylko zastąpić normalne komórki szpiku, ale także rozszerzyć się na obszary pozaszpikowe.

Różne rodzaje białaczek są wyjątkowo heterogenne iw zależności od pochodzenia komórek dzielą się na białaczki limfoblastyczne i nielimfoblastyczne. Każdą z wymienionych podgrup można spotkać w postaci białaczki ostrej (AL) lub białaczki przewlekłej (CL). W ostrej postaci dominują niedojrzałe komórki tkanki krwiotwórczej, a postęp choroby bez leczenia prowadzi szybko do śmierci. W postaciach przewlekłych w tkance dominują dojrzałe komórki, a rozwój choroby na ogół trwa dłużej. U dzieci białaczka występuje głównie w postaci ostrej (97%), aw większości przypadków jest przedstawiana jako ostra białaczka limfoblastyczna (ALL, 80%). Ostra białaczka nielimfoblastyczna - ANLL jest spotykana rzadziej (17%) i obejmuje ostrą białaczkę szpikową - AML (15%) i kilka innych rzadkich postaci (2%), podczas gdy pozostałe 3% odpowiada białaczce przewlekłej. AL występuje częściej w wieku od 2 do 6 lat, przy czym zapadalność jest wyższa u chłopców niż u dziewczynek (1:1,3). 2,5% - 5% dziecięcej ALL i 6% - 14% dziecięcej AML występuje u niemowląt poniżej 1 roku życia. Charakterystycznym typem ALL jest ALL B-komórkowa, która dodatkowo występuje najczęściej u dzieci (85%) w porównaniu z ALL T-komórkową (15%), której towarzyszą guzy m.in. w węzłach chłonnych śródpiersia .

Epidemiologia

W Stanach Zjednoczonych Ameryki (USA) i większości krajów Europy Zachodniej częstość występowania białaczki u dzieci wynosi 3,5 - 4,0 przypadków na 100 000 populacji dziecięcej rocznie i jest klasyfikowana jako 20. przyczyna zgonów wśród nowotworów złośliwych w każdym wieku. Z szeroko zakrojonych badań kohortowych wywnioskowano, że częstość występowania raka u dzieci w krajach rozwiniętych rośnie o 1% każdego roku. Częstość występowania ALL u dzieci została wykryta po raz pierwszy w latach 30. XX wieku w Wielkiej Brytanii (UK) i USA. W USA ALL pojawił się najpierw u dzieci pochodzenia europejskiego, a następnie w latach 60. u dzieci pochodzenia afrykańskiego. Częstość występowania ALL jest niższa w krajach rozwijających się i słabo rozwiniętych, co wskazuje na możliwą korelację między industrializacją a leukaemogenezą.

Asparaginaza (ASP)

Leczenie skojarzone chemioterapii stosowane obecnie w leczeniu ALL znacznie poprawiło długoterminowy przebieg choroby, przy czym ogólny pięcioletni wskaźnik przeżycia przekroczył 80%, podczas gdy odpowiedni wskaźnik w latach 60. XX wieku wynosił poniżej 30%. Jednym z głównych powodów, które przyczyniły się do tego rozwoju, jest intensywne, przedłużone i wyższe dawki asparaginazy. L-asparaginaza (L-ASP) jest podstawowym składnikiem w dawce nasycającej w celu uzyskania remisji choroby, a także w dawce podtrzymującej w celu uzyskania remisji zarówno u dzieci, jak iu dorosłych chorych na ALL. Efekt cytotoksyczny egzogennego podania asparaginazy jest spowodowany wyczerpywaniem się rezerwy asparaginy we krwi. Asparaginaza działa jako katalizator hydrolizy asparaginy do kwasu asparaginowego i amoniaku. Asparagina jest niezbędna do syntezy białek i komórek, a zatem do ich przetrwania. Normalne komórki ludzkiego organizmu mają zdolność wytwarzania asparaginy z kwasu asparaginowego przy pomocy enzymu syntetazy asparaginowej. Jednak komórki nowotworowe albo całkowicie nie mają enzymu, albo zawierają jego niewielkie ilości, co powoduje, że nie są w stanie syntetyzować asparaginy de novo. Przeżycie tych komórek i ich zdolność do syntezy białek zależy całkowicie od przyjmowania asparaginy z krwi. Zatem podanie asparaginazy prowadzi do zahamowania syntezy DNA, RNA i białek, co z kolei skutkuje apoptozą tych komórek. Niski poziom asparaginy wpływa jedynie na przeżywalność komórek nowotworowych, pozostawiając zdrowe komórki w stanie nienaruszonym.

Zdolność L-ASP do hamowania proliferacji komórek białaczkowych po raz pierwszy zaobserwowano w badaniach klinicznych w latach 70. XX wieku i od tego momentu pozostaje ona kamieniem węgielnym leczenia ALL u dzieci. Naturalne formy enzymu, wytwarzane przez bakterie Erwinia chrysanthemi i Escherichia coli (E.Coli), są wykorzystywane do leczenia, podobnie jak produkt L-ASP powstały z koniugacji E. Coli. z glikolem polietylenowym (Pegylowana asparaginaza, PEG-ASP) o wydłużonym okresie półtrwania wynoszącym 5,5 dnia zamiast 26-godzinnego okresu półtrwania form naturalnych. Protokoły chemioterapii dla ALL zalecają dawkę 1000 - 2500 IU/m2 PEG-ASP i 5000 - 12 000 IU/m2 postaci naturalnej.

Działania niepożądane asparaginazy

Pomimo ogromnego znaczenia L-ASP w chemioterapii białaczki, jest on odpowiedzialny za mnóstwo toksycznych działań niepożądanych, które czasami wymagają nawet przerwania jego podawania. Badania wykazały, że pominięcie podawania dawek z powodu pojawienia się toksycznych działań niepożądanych we wcześniejszych podaniach wiąże się ze złym rokowaniem u dzieci z ALL. Najczęstszym działaniem niepożądanym są reakcje nadwrażliwości, gdyż badania wskazują, że częstość ich występowania sięga nawet 75%. Wykorzystywana ASP jest dużą cząsteczką pochodzenia bakteryjnego (głównie E. coli), dzięki czemu jest zdolna do indukowania odpowiedzi immunologicznej, która nasila się po wielokrotnym narażeniu, a przede wszystkim po opóźnieniu podania leku. Oprócz klinicznych reakcji nadwrażliwości, sygnalizujących natychmiastową reakcję personelu medycznego, istnieją również reakcje subkliniczne, które mogą prowadzić do trudnego do wykrycia osłabienia siły działania leku w celu szybkiego działania. Zapalenie trzustki jest zgłaszane z częstością aż 18% pacjentów z ALL podczas leczenia ASP. Mechanizm patogenezy nie jest jeszcze znany, wydaje się jednak, że wina leży po stronie zmniejszenia syntezy białek w narządach o znacznym obrocie białkowym, takich jak trzustka. Ponadto uważa się, że ten mechanizm jest również odpowiedzialny za hepatotoksyczność wykrytą podczas leczenia asparaginazą. Dodatkowo indukowany przez ASP spadek syntezy białek bierze udział w procesach krzepnięcia i fibrynolizy, co z kolei prowadzi do epizodów zakrzepowych ośrodkowego układu nerwowego i zakrzepicy żył głębokich kończyn. Inne działania niepożądane to hiperglikemia w wyniku zmniejszonej produkcji insuliny i mielosupresja, głównie z powodu nasilenia efektu supresyjnego innych leków stosowanych w chemioterapii. Ponadto, istnieją doniesienia o przypadkach encefalopatii podczas leczenia ASP, które mogą być związane z podwyższonym poziomem amoniaku wynikającym z rozkładu ASP.

Krytycznym zdarzeniem niepożądanym ASP, które może skutkować dodatkowymi powikłaniami, jeśli nie zostanie szybko zidentyfikowane, jest zaburzenie metabolizmu lipidów. W szczególności wydaje się, że aktywacja szlaku endogennego, który wytwarza triglicerydy poprzez syntezę w wątrobie, prowadzi do hipertriglicerydemii. Niektóre badania wskazują, że wskaźnik wysokich wartości trójglicerydów wynosi 67% 8 - 14 dni po podaniu leku. Wątroba jest zdolna do syntezy VLDL (lipoprotein o bardzo małej gęstości), które są bogate w trójglicerydy. Wykorzystując działanie enzymu lipazy lipoproteinowej (LpL), znajdującej się w śródbłonku naczyń, trójglicerydy odrywają się od VLDL, powodując jego przekształcenie w IDL (lipoproteiny o średniej gęstości), a następnie w LDL (lipoproteiny o niskiej gęstości). Trójglicerydy są później ekstrahowane z układu krwionośnego i magazynowane w tkance tłuszczowej, podczas gdy cząsteczki LDL łączą się z receptorami tkankowymi lub receptorami makrofagów. Końcowe produkty rozpadu (pochodzące z obwodowej hydrolizy triglicerydów przy pomocy LpL) chylomikronów, VLDL, pozostałości lipoprotein, zostaną ostatecznie usunięte przez receptory wątrobowe. Ważną rolę w tym zabiegu odgrywa apolipoproteina E (apo-E), która wiąże te pozostałości w obecności LpL i lipazy wątrobowej.

lipaza lipoproteinowa (LpL)

Gen LpL znajduje się na chromosomie 8p22 i składa się z 10 eksonów. Odnotowano około 100 mutacji, z których 3 są najczęstsze, z czego 2 związane są z obniżoną funkcjonalnością LpL i zwiększonym ryzykiem sercowo-naczyniowym. Mutacja określana jako polimorfizm N291S występuje u 2-5% populacji ogólnej, a jej istnienie jest związane ze zmniejszoną funkcjonalnością LpL i zaburzeniem równowagi w metabolizmie VLDL [wzrost trójglicerydów, spadek HDL (lipoproteiny o dużej gęstości)]. Ponadto wydaje się, że efekt tej mutacji jest wzmacniany przez współistnienie innych czynników genetycznych (hipercholesterolemia rodzinna, apolipoproteina E2/E2). Druga mutacja, znana jako polimorfizm D9N, wiąże się ze zwiększonym ryzykiem miażdżycy, nawet jeśli mutacja powoduje nieznaczny spadek funkcjonalności LpL. Ostatnio zaobserwowano, że kombinacja polimorfizmów małych nukleotydów (SNP) w genach Apo E i LpL określa grupę wysokiego ryzyka chorób sercowo-naczyniowych. Wreszcie trzecia mutacja, spotykana u 20% populacji ogólnej, polimorfizm S447X, wiąże się z nieznacznie podwyższonym poziomem HDL i niskim poziomem triglicerydów, a tym samym ma pozytywny wpływ na profil lipidowy.

W czasie trwania leczenia ASP rejestruje się zmniejszoną funkcjonalność LpL, prawdopodobnie spowodowaną całkowitym zmniejszeniem syntezy białek w wątrobie, co wynika ze zmniejszonych stężeń innych białek, takich jak albumina i fibrynogen. Badania wykazały w szczególności, że tłumienie działania LpL wiąże się ze wzrostem stosunku ApoCIII/ApoCII, gdzie ApoCII jest niezbędnym kofaktorem LpL i sprzyja hydrolizie trójglicerydów, a ApoCIII działa jako inhibitor LpL jednocześnie wydaje się być w stanie regulować poziom trójglicerydów w surowicy niezależnie od LpL. W związku z tym powstaje problem w usuwaniu triglicerydów z osocza wraz ze wzrostem ich poziomu. Innym sugerowanym mechanizmem wysokiego poziomu triglicerydów podczas leczenia asparaginazą jest wzrost syntezy VLDL, co znajduje również odzwierciedlenie w wysokim stężeniu apolipoproteiny ApoB100, składnika VLDL.

Apolipoproteina E (Apo E)

Gen Apo E znajduje się na chromosomie 19 i składa się z 4 eksonów. Apolipoproteina E (Apo E) jest jednym ze składników strukturalnych lipoprotein bogatych w trójglicerydy i odgrywa ważną rolę w pobieraniu białka przez wątrobę. Apolipoproteina E (Apo E) ma 3 allele ε2, ε3, ε4 [APOE-ε2 (cys112, cys158), APOE-ε3 (cys112, arg158) i APOE-ε4 (arg112, arg158)]. ε3 występuje najczęściej w populacji ogólnej i zawiera cysteinę w pozycji 112 oraz argininę w pozycji 158. ε4 różni się od ε3 w pozycji 112, gdzie zamiast niej zastępuje cysteinę argininą55. Izomorf ε2 ma słabsze połączenie z receptorami lipoproteinowymi wątroby, co powoduje gromadzenie się pozostałości po chylomikronach i VLDL.

ApoE4 przyłącza się in vitro do receptorów lipoprotein w wątrobie z takim samym powinowactwem jak ApoE3, jednak wpływ ApoE4 na oczyszczanie lipoprotein bogatych w triglicerydy in vivo nie został jeszcze określony. Allel ε2 jest związany z wyższymi poziomami trójglicerydów po poście, natomiast allel ε4 jest związany z hipercholesterolemią i wysokim poziomem cholesterolu LDL. Osoby z genotypem E3/E4 wykazują wolniejsze oczyszczanie lipoprotein bogatych w trójglicerydy w porównaniu z osobami z genotypem E3/E3. Wygląda na to, że allel ε4 jest związany z zaburzonym metabolizmem trójglicerydów. Osoby z allelem ε2 mają niższy poziom cholesterolu w porównaniu z osobami z allelami ε3 i ε4. Badania wskazują ponadto, że osoby z genotypem E2/E4 mają wyższy poziom trójglicerydów po poście w stosunku do osób z genotypem E3/E3.

Zmiany w genie ApoE prowadzą do zmian w aminokwasach kodowanego białka, co skutkuje zmodyfikowaną strukturą normalnego białka. To ostatnie skutkuje wolniejszym oczyszczaniem lipoprotein bogatych w trójglicerydy. W jednym z badań wykazano, że fenotyp E4/E3 występował częściej u pacjentów z hipertriglicerydemią w porównaniu z pacjentami z prawidłowym poziomem triglicerydów. Ponadto nie zaobserwowano istotnej statystycznej różnicy między poziomem triglicerydów a fenotypami ApoE po leczeniu asparaginazą.

Profil asparaginazy i lipidów

Jeśli chodzi o wpływ asparaginazy na poziom cholesterolu, badania nie pozwalają na wyciągnięcie wiarygodnych wniosków, ponieważ niektóre badania wykazały wzrost u niewielkiego odsetka pacjentów po podaniu leku, inne wskazywały na znaczny wzrost, a jeszcze inne mały, ale nie znaczący spadek. Jeśli chodzi o poziomy HDL, badania wykazały, że są one niższe u dzieci cierpiących na nowotwory złośliwe, zwłaszcza typu hematologicznego. W innym badaniu skupiającym się na dzieciach z ALL, w trakcie i po leczeniu ASP poziom HDL wzrósł przy jednoczesnym spadku poziomu Apo-A1. HDL odgrywa kluczową rolę w procesie odwrotnego transferu cholesterolu z tkanki obwodowej do wątroby, mechanizmie, który nadaje HDL właściwości antykoagulantu. Działając w parze z wyżej wymienionymi właściwościami, inne części HDL mają właściwości przeciwutleniające, przeciwzapalne, przeciwapoptotyczne i przeciwzakrzepowe, które przyczyniają się do ochrony przed aterogenezą. Lipoproteina Apo-A1 zawiera główne białko strukturalne HDL. Jest oczywiste, że asparaginaza jako czynnik hamujący syntezę białek może prawdopodobnie modyfikować stosunek lipidy/białka na korzyść pierwszego w cząsteczkach HDL. Niski poziom HDL i Apo-A1 został zauważony nawet u osób bez choroby, które przeżyły ALL po zakończeniu leczenia. Ta obserwacja ma szczególne znaczenie, jeśli myśli się o niebezpieczeństwie miażdżycy i choroby wieńcowej z powodu niskiego poziomu HDL.

Hipertriglicerydemia może stać się jedyną przyczyną rozwoju ostrego zapalenia trzustki. Kiedy poziom trójglicerydów wzrasta powyżej 900 mg/dl, tworzą one chylomikrony, cząsteczki na tyle duże, że mogą zatkać naczynia włosowate trzustki, prowadząc do niedokrwienia i uwolnienia lipazy trzustkowej. Te ostatnie wzmocnią lipolizę wraz ze wzrostem wolnych kwasów tłuszczowych, co z kolei umożliwi uwolnienie wolnych rodników i pochodnych prozapalnych, powodując ostatecznie stan zapalny i martwicę. Jak widać powyżej, asparaginaza może brać udział w patogenezie zapalenia trzustki dwiema drogami, niezależną i zależną od triglicerydów. Hipertrójglicerydemia może również sprzyjać predyspozycji do zakrzepicy u pacjentów cierpiących na ALL leczonych ASP, ponieważ z jednej strony lek wiąże się z modyfikacjami układu fibrynolitycznego, jak już wspomniano, z drugiej strony wzrost trójglicerydy powodują nadmierną lepkość krwi, zwiększając ryzyko powikłań zakrzepowo-zatorowych. Na podstawie przypadków udokumentowanych w bibliografii powszechnej stwierdza się, że większość zakrzepic dotyczy ośrodkowego układu nerwowego (OUN), na drugim miejscu znajdują się przypadki zakrzepicy żył głębokich kończyn górnych.

Na koniec należy dodać, że podawanie ASP dzieciom z nowotworami układu krwiotwórczego w wielu fazach leczenia jest skojarzone z kortykosteroidami, prednizonem lub deksametazonem. Łatwo zauważyć, że kortykosteroidy mogą synergizować i nasilać działania niepożądane, takie jak hiperlipidemia, zapalenie trzustki i zakrzepica. Co więcej, asparaginaza może przyczyniać się do niektórych działań niepożądanych kortykosteroidów, takich jak martwica kości poprzez wywołany przez nią stan hiperkoagulacyjny. Ponieważ oba te leki są kluczowymi czynnikami terapeutycznymi, konieczne jest bardzo ścisłe i uważne monitorowanie stanu pacjenta i pojawiania się działań niepożądanych, aby w razie potrzeby interweniować.

Oryginalność

Zarówno uniwersalna, jak i krajowa bibliografia dotycząca wpływu asparaginazy na siłę działania LpL i Apo E oraz wartości lipidów u dzieci chorych na ALL w trakcie chemioterapii z użyciem ASP jest ograniczona, brakuje natomiast odniesień bibliograficznych korelujących genetyczną tło dla LpL i Apo E oraz związek profilu lipidowego. Obecne badanie po raz pierwszy zbada polimorfizmy genów LpL i Apo E u dzieci z ostrą ALL podczas leczenia ASP.

Znaczenie

W tym konkretnym badaniu badacze skupią się na badaniu profilu lipidowego dzieci z ALL, wpływie ASP na profil lipidowy tych pacjentów, a także korelacji między polimorfizmami lipazy lipoproteinowej (LpL) i apolipoproteiny E (ApoE) z wartości lipidów w czasie trwania protokołu chemioterapeutycznego. Hipoteza, która zostanie przetestowana, dotyczy tego, czy rejestracja genotypów niedostatecznie badanych dzieci z ALL będzie w stanie stanowić prewencyjny czynnik wskazujący na wynik ich leczenia.

W ten sposób zostaną wyciągnięte istotne wnioski dotyczące prawdopodobnego udziału genotypów dzieci, którym podaje się L-ASP, w laboratoryjnym wykazaniu zaburzeń lipidowych podczas leczenia, ściślejszego nadzoru podczas odpowiednich faz leczenia i wczesnej interwencji terapeutycznej w celu aby zapobiec wszelkim komplikacjom.

Metodologia

Rodzaj badania: Prospektywne badanie kliniczno-kontrolne Charakterystyczne badanie epidemiologiczne jest całkowicie zgodne z celem naszego badania, badaniem wpływu ASP na profil lipidowy dzieci i młodzieży z ALL (grupa pacjentów) oraz korelacji polimorfizmy LpL i ApoE z poziomem lipidów w czasie trwania protokołu chemioterapeutycznego. Istnienie dwóch dodatkowych grup dzieci, które będą stanowić kontrolę populacji (dzieci i młodzież w tej samej grupie wiekowej, u których nie występuje choroba, oraz uczestnicy w podobnym wieku, u których wystąpiła choroba i którzy ukończyli chemioterapię zgodnie z protokołem przez co najmniej 6 miesięcy wcześniej) specjalizuje się w naszym typie badania w badaniu kliniczno-kontrolnym.

Miejsce badania: Badanie zostanie przeprowadzone na Oddziale Hematologii i Onkologii Dziecięcej i Młodzieżowej II Oddziału Pediatrii Uniwersytetu Arystotelesa w Salonikach (AUTH), w Uniwersyteckim Szpitalu Ogólnym AHEPA.

Opis zarejestrowanych parametrów

Podczas diagnozy choroby profil lipidowy pacjentów zostanie określony poprzez pomiar następujących parametrów: cholesterol całkowity, triglicerydy, cholesterol HDL, cholesterol LDL, apolipoproteina A1, apolipoproteina B100, lipoproteina α [Lp(α)], glukoza , Surowica Transaminaza glutaminowo-szczawiooctowa (SGOT), Serum Transaminaza glutaminowo-pirogronowa (SGPT), Hormon stymulujący tarczycę (TSH), Wolna tyroksyna (FT4), amylaza, lipaza. Dodatkowo zostanie przeprowadzona analiza genetyczna pod kątem polimorfizmów LpL i Apo E. Podobne pomiary zostaną wykonane dla wszystkich uczestników ze wszystkich grup.

Uczestnicy grupy A zostaną niezwłocznie poddani protokołowi chemioterapii ALLIC BFM 2009. Podczas dawki wysycającej dzieci te będą otrzymywać prednizolon przez 33 kolejne dni, a asparaginaza zostanie dodana w dniach 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33. W fazie podtrzymującej dzieci będą ponownie leczone kortykosteroidami, deksametazonem i asparaginazą w dniach 8, 11, 16, 18. Tożsamość lipidowa zostanie sprawdzona przed podaniem ASP w dniu 0 i 11 oraz po podaniu ASP i przed podaniem kolejnej dawki w dawce nasycającej, tj. w dniach 15, 24, 33. Podobnie tożsamość lipidowa będzie sprawdzana w fazie podtrzymującej, czyli w dniach 8, 16, 21 oraz po zakończeniu każdej fazy protokołu chemioterapii, w której nie stosuje się ASP.

Ponadto zbadano polimorfizmy LpL (trzy najczęściej spotykane polimorfizmy p.N291S, p.D9N, p.S447X) oraz polimorfizmy Apo E [ε2(rs7412-T,rs429358-T), ε3(rs7412-C, rs429358- T) i ε4 (rs7412-C, rs429358-C)] zostaną wykonane po wyizolowaniu DNA z krwi obwodowej i przeanalizowaniu go technikami molekularnymi.

Uczestnicy, którzy spełniają wszystkie kryteria włączenia do tego badania, zostaną zbadani i poddani leczeniu ASP (grupa pacjentów) i zostaną porównani z odpowiednimi zespołami zdrowych dzieci i dzieci, które chorowały i nie brały chemioterapii przez co najmniej 6 miesięcy (grupa kontrolna ).