Корреляция полиморфизмов липопротеинлипазы (LpL) и аполипопротеина E (Apo E) с липидным профилем у детей с острой лимфобластной евкемией на фоне терапии L-аспарагиназой.

Введение

Злокачественные новообразования в детском возрасте составляют вторую причину смерти после травм во всем мире. По эпидемиологическим данным ежегодно регистрируется 300 000 новых случаев неоплазии у детей и подростков в возрасте до 19 лет1, из них 160 000 детей в возрасте до 15 лет. Гематологические злокачественные новообразования составляют наиболее распространенную неопластическую болезнь в детской популяции, при этом острый лейкоз занимает первое место с процентом 32,8%, за ним следуют опухоли центральной нервной системы с процентом 21% и лимфома с процентом 12. % на третьем месте.

Определение — патофизиология

Лейкемию (Л) определяют как группу нарушений, характеризующихся неконтролируемой пролиферацией лейкоцитов вследствие первичного отклонения костного мозга от нормального и инфильтрации его незрелыми недифференцированными стволовыми клетками. По определению более 20% костного мозга инфильтрировано стволовыми клетками. Точный патогенетический механизм лейкемии до сих пор не выяснен, однако, по-видимому, он является результатом генетической мутации и повреждения мультипотентных гематопоэтических клеток предков во время одной из их отдельных стадий дифференцировки. Этот факт приводит к клональной экспансии и ингибированию дифференцировки. Иммунофенотип лейкемической клетки отражает уровень дифференцировки, достигнутый неопластическим клоном. Лейкемические клетки делятся медленнее, и им требуется дополнительное время для синтеза ДНК по сравнению с нормальными кроветворными клетками, вызывающими анемию, тромбоцитопению и нейтропению. На момент постановки диагноза лейкемические клетки могли не только заменить нормальные клетки костного мозга, но и распространиться в экстрамедуллярные области.

Различные типы лейкозов исключительно гетерогенны и в зависимости от происхождения клеток дифференцируются на лимфобластные и нелимфобластные лейкозы. Каждая из вышеупомянутых подгрупп может встречаться в форме острого лейкоза (AL) или хронического лейкоза (CL). При острой форме преобладают незрелые клетки кроветворной ткани и прогрессирование заболевания без какого-либо лечения быстро приводит к летальному исходу. При хронических формах в ткани преобладают зрелые клетки и развитие заболевания, как правило, протекает дольше. У детей лейкоз встречается преимущественно в острой форме (97%) и в большинстве случаев представлен острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ, 80%). Острый нелимфобластный лейкоз - ОНЛЛ встречается реже (17%) и включает острый миелогенный лейкоз - ОМЛ (15%) и некоторые другие редкие формы (2%), а остальные 3% соответствуют хроническому лейкозу. ОЛ чаще возникает в возрасте от 2 до 6 лет, при этом заболеваемость выше у мальчиков по сравнению с девочками (1:1,3). 2,5–5% детских ОЛЛ и 6–14% детских ОМЛ встречаются у детей до 1 года. Характерным типом ОЛЛ является В-клеточный ОЛЛ, который также чаще встречается у детей (85%) по сравнению с Т-клеточным ОЛЛ (15%), который сопровождается образованиями в лимфатических узлах средостения среди других областей. .

Эпидемиология

В Соединенных Штатах Америки (США) и большинстве стран Западной Европы частота лейкемии у детей составляет 3,5 - 4,0 случая на 100 000 детского населения в год и занимает 20-е место среди причин смерти среди злокачественных новообразований всех возрастов. Из крупномасштабных когортных исследований следует, что заболеваемость раком у детей в развитых странах ежегодно увеличивается на 1%. Распространенность ОЛЛ у детей впервые была выявлена ​​в 1930-х годах в Соединенном Королевстве (Великобритания) и США. В США ОЛЛ впервые появился у детей европейского происхождения, а затем у детей африканского происхождения в 1960-х годах. Частота ОЛЛ ниже в развивающихся и слаборазвитых странах, что намекает на возможную корреляцию между индустриализацией и лейкемогенезом.

Аспарагиназа (АСП)

Комбинированное химиотерапевтическое лечение, используемое сегодня для лечения ВСЕХ, значительно улучшило долгосрочное течение заболевания, при этом общая пятилетняя выживаемость превысила 80%, в то время как соответствующий показатель в 1960-х годах был ниже 30%. Одной из основных причин, способствовавших такому развитию, является интенсивное, продолжительное и более высокодозированное введение аспарагиназы. L-аспарагиназа (L-ASP) является основным компонентом во время нагрузочной дозы в отношении достижения ремиссии заболевания, а также во время поддерживающей дозы с целью установления этой ремиссии как у детей, так и у взрослых, страдающих ОЛЛ. Цитотоксический эффект экзогенного введения аспарагиназы обусловлен истощением запаса аспарагина в крови. Аспарагиназа действует как катализатор гидролиза аспарагина до аспарагиновой кислоты и аммиака. Аспарагин жизненно важен для синтеза белка и клеток и, следовательно, для их выживания. Нормальные клетки человеческого организма способны производить аспарагин из аспарагиновой кислоты с помощью фермента аспарагинсинтетазы. Однако опухолевые клетки либо полностью лишены фермента, либо содержат его в незначительных количествах, что приводит к их неспособности синтезировать аспарагин de novo. Выживание этих клеток и их способность синтезировать белки полностью зависят от поступления аспарагина из крови. Таким образом, введение аспарагиназы приводит к ингибированию синтеза ДНК, РНК и белка, что, в свою очередь, приводит к апоптозу этих клеток. Низкий уровень аспарагина влияет только на выживаемость раковых клеток, оставляя здоровые клетки нетронутыми.

Способность L-ASP подавлять пролиферацию лейкемических клеток была впервые обнаружена в клинических исследованиях в 1970-х годах, и с тех пор она остается краеугольным камнем лечения ОЛЛ у детей. Природные формы фермента, продуцируемые бактериями Erwinia chrysanthemi и Escherichia coli (E.Coli), используются для лечения, как и продукт L-ASP, полученный из конъюгации кишечной палочки. с полиэтиленгликолем (пегилированная аспарагиназа, ПЭГ-АСП) с длительным периодом полувыведения 5,5 дней вместо 26-часового периода полувыведения природных форм. Протоколы химиотерапии для ALL рекомендуют дозировку 1000-2500 МЕ/м2 ПЭГ-АСП и 5000-12000 МЕ/м2 натуральной формы.

Побочные реакции аспарагиназы

Несмотря на первостепенное значение L-ASP в химиотерапевтическом лечении лейкемии, он вызывает множество токсических побочных эффектов, которые иногда даже требуют прекращения его введения. Исследования показали, что пропуск введения доз из-за возникновения токсических побочных эффектов при предыдущих введениях связан с неблагоприятным прогнозом у детей с ОЛЛ. Наиболее частыми побочными эффектами являются реакции гиперчувствительности, поскольку исследования показывают, что частота их возникновения достигает 75%. Используемый ASP представляет собой крупную молекулу бактериального происхождения (в основном E. Coli) и, таким образом, способен индуцировать иммунный ответ, который становится более интенсивным после многократного воздействия и, главным образом, после отсрочки введения препарата. Помимо клинических реакций гиперчувствительности, которые сигнализируют о немедленном ответе лечащего медицинского персонала, также существуют субклинические реакции, которые могут привести к снижению активности препарата, что трудно обнаружить для быстрого действия. Сообщается, что панкреатит встречается у 18% пациентов с ОЛЛ во время лечения АСП. Патогенный механизм еще не известен, однако, похоже, что вина заключается в снижении синтеза белка в органах со значительным обменом белка, таких как поджелудочная железа. Более того, считается, что этот механизм также отвечает за гепатотоксичность, обнаруживаемую при лечении аспарагиназой. Кроме того, индуцированное АСП снижение синтеза белка вовлекается в процессы коагуляции и фибринолиза, что в свою очередь приводит к тромботическим эпизодам ЦНС и тромбозу глубоких вен конечностей. Другими побочными реакциями являются гипергликемия в результате снижения выработки инсулина и миелосупрессия, в основном из-за усиления подавляющего действия других химиотерапевтических препаратов. Кроме того, были сообщения о случаях энцефалопатии во время терапии АСП, которые могли быть связаны с повышенным уровнем аммиака в результате распада АСП.

Критическим побочным эффектом АСБ, который может привести к дополнительным осложнениям, если его своевременно не выявить, является нарушение липидного обмена. В частности, похоже, что активация эндогенного пути, который производит триглицериды посредством синтеза в печени, приводит к гипертриглицеридемии. Некоторые исследования показывают, что частота высоких значений триглицеридов составляет 67% через 8-14 дней после приема лекарства. Печень способна синтезировать ЛПОНП (липопротеины очень низкой плотности), богатые триглицеридами. Под действием фермента липопротеинлипазы (ЛПЛ), локализованного в эндотелии сосудов, триглицериды отделяются от ЛПОНП, в результате чего последние трансформируются в ЛПНП (липопротеины промежуточной плотности), а затем в ЛПНП (липопротеины низкой плотности). Позже триглицериды экстрагируются из системы кровообращения и сохраняются в жировой ткани, тогда как частицы ЛПНП связываются с рецепторами тканей или рецепторами макрофагов. Конечные продукты распада (поступающие от периферического гидролиза триглицеридов с помощью ЛПЛ) хиломикронов, ЛПОНП, остатки липопротеидов со временем удаляются печеночными рецепторами. Аполипопротеин Е (апо-Е) играет важную роль в этой процедуре, он связывает эти остатки в присутствии LpL и печеночной липазы.

Липопротеинлипаза (LpL)

Ген LpL расположен на хромосоме 8p22 и состоит из 10 экзонов. Зарегистрировано около 100 мутаций, из них 3 наиболее распространенные, 2 из которых связаны со снижением функциональности LpL и повышенным сердечно-сосудистым риском. Мутация, известная как полиморфизм N291S, присутствует у 2-5% населения в целом, и ее существование связано со снижением функциональности LpL и дисбалансом метаболизма ЛПОНП [увеличение триглицеридов, снижение ЛПВП (липопротеинов высокой плотности)]. Кроме того, оказывается, что эффект этой мутации усиливается сосуществованием других генетических факторов (семейная гиперхолестеринемия, аполипопротеин Е2/Е2). Вторая мутация, известная как полиморфизм D9N, связана с повышенным риском атеросклероза, даже если мутация вызывает легкое снижение функциональности LpL. В последнее время было замечено, что сочетание полиморфизмов малых нуклеотидов (SNP) в генах Apo E и LpL определяет группу высокого риска сердечно-сосудистых заболеваний. Наконец, третья мутация, встречающаяся у 20% населения в целом, полиморфизм S447X связана с несколько повышенным уровнем ЛПВП и низким уровнем триглицеридов и, таким образом, оказывает положительное влияние на липидный профиль.

Во время лечения ASP регистрируется снижение функциональности LpL, вероятно, вызванное в целом снижением синтеза белка в печени, что видно из снижения концентрации других белков, таких как альбумин и фибриноген. Исследования показали, в частности, что подавление эффектов LpL связано с увеличением соотношения ApoCIII/ApoCII, где ApoCII является важным кофактором LpL и способствует гидролизу триглицеридов, а ApoCIII действует как ингибитор LpL. в то же время, по-видимому, способен регулировать уровни триглицеридов в сыворотке независимо от LpL. Таким образом, возникает проблема очистки плазмы от триглицеридов по мере повышения их уровня. Другим предполагаемым механизмом высокого уровня триглицеридов во время лечения аспарагиназой является увеличение синтеза ЛПОНП, что также отражается в высокой концентрации аполипопротеина АроВ100, компонента ЛПОНП.

Аполипопротеин Е (Аро Е)

Ген Аро Е расположен на хромосоме 19 и состоит из 4 экзонов. Аполипопротеин Е (Аро Е) является одним из структурных компонентов, входящих в состав липопротеинов, богатых триглицеридами, и играет важную роль в потреблении белка печенью. Аполипопротеин Е (Аро Е) имеет 3 аллеля ε2, ε3, ε4 [АРОЕ-ε2 (cys112, cys158), АРОЕ-ε3 (cys112, arg158) и АРОЕ-ε4 (arg112, arg158)]. ε3 является наиболее распространенным среди населения в целом и содержит цистеин в положении 112 и аргинин в положении 158. ε4 отличается от ε3 в положении 112, где вместо него цистеин заменен на аргинин55. Изоморфа ε2 имеет более слабую связь с липопротеиновыми рецепторами печени, что приводит к накоплению остатков хиломикронов и ЛПОНП.

ApoE4 прикрепляется к рецепторам липопротеинов в печени in vitro, обладая тем же сродством, что и ApoE3, однако эффект ApoE4 на очищение от липопротеинов, богатых триглицеридами, in vivo пока не определен. Аллель ε2 связан с более высоким уровнем триглицеридов после голодания, тогда как аллель ε4 связан с гиперхолестеринемией и высоким уровнем холестерина ЛПНП. У лиц с генотипом Е3/Е4 происходит более медленное очищение липопротеидов, богатых триглицеридами, по сравнению с лицами с генотипом Е3/Е3. Аллель ε4, по-видимому, связан с нарушением метаболизма триглицеридов. У лиц с аллелем ε2 уровень холестерина ниже, чем у лиц с аллелями ε3 и ε4. Кроме того, исследования показывают, что люди с генотипом E2/E4 имеют более высокие уровни триглицеридов после голодания по сравнению с людьми с генотипом E3/E3.

Изменения в гене ApoE приводят к изменению аминокислот кодируемого белка, что приводит к модификации структуры нормального белка. Последнее приводит к более медленному очищению от липопротеинов, богатых триглицеридами. В одном исследовании было выявлено, что фенотип Е4/Е3 чаще встречается у пациентов с гипертриглицеридемией по сравнению с пациентами с нормальным уровнем триглицеридов. Кроме того, не наблюдалось существенной статистической разницы между уровнями триглицеридов и фенотипами ApoE после лечения аспарагиназой.

Аспарагиназа и липидный профиль

Что касается влияния аспарагиназы на уровень холестерина, то исследования не позволяют прийти к какому-либо достоверному выводу, так как в одних исследованиях было обнаружено повышение у небольшого процента пациентов после введения препарата, в других указывалось на значительное повышение, а в других пока не представлено небольшое, но не существенное снижение. Что касается уровней ЛПВП, исследования показали, что они ниже у детей, страдающих злокачественными новообразованиями, особенно гематологического типа. В другом исследовании, посвященном детям с ОЛЛ, во время и после лечения АСП уровни ЛПВП повышались с одновременным падением уровней апо-А1. ЛПВП играет решающую роль в процессе обратного переноса холестерина из периферических тканей в печень, что придает ЛПВП свойства антикоагулянта. Функционируя в тандеме с вышеупомянутыми свойствами, другие части ЛПВП обладают антиоксидантными, противовоспалительными, антиапоптотическими и антикоагулянтными свойствами, которые способствуют защите от атерогенеза. Липопротеин Аро-А1 представляет собой основной структурный белок ЛПВП. Очевидно, что аспарагиназа как ингибирующий фактор белкового синтеза могла, возможно, модифицировать соотношение липиды/белки в пользу в первую очередь на молекулах ЛПВП. Низкие уровни ЛПВП и Апо-А1 были отмечены даже у здоровых лиц, перенесших ОЛЛ, после окончания лечения. Это наблюдение имеет особое значение, если подумать об опасности атероматоза и коронарной болезни из-за низкого уровня ЛПВП.

Гипертриглицеридемия может стать единственным фактором, способствующим развитию острого панкреатита. Когда уровни триглицеридов превышают 900 мг/дл, они образуют хиломикроны, молекулы достаточно больших размеров, которые могут закупорить капилляры поджелудочной железы, что приводит к ишемии и высвобождению панкреатической липазы. Последнее усилит липолиз с увеличением количества свободных жирных кислот, что, в свою очередь, позволит высвобождать свободные радикалы и провоспалительные производные, вызывая, в конце концов, воспаление и некроз. Как показано выше, аспарагиназа способна принимать участие в патогенезе панкреатита двумя путями: независимым и зависимым от триглицеридов. Гипертриглицеридемия также может способствовать предрасположенности к тромбозам у больных ОЛЛ, находящихся на лечении АСП, так как, с одной стороны, препарат связан с модификациями фибринолитической системы, как уже упоминалось, а с другой стороны, увеличение триглицериды вызывают повышенную вязкость крови, повышая риск тромбоэмболических осложнений. Из случаев, задокументированных в универсальной библиографии, видно, что большинство тромбозов поражает центральную нервную систему (ЦНС), а на втором месте стоят случаи тромбоза глубоких вен верхних конечностей.

Наконец, важно добавить, что введение АСП детям с гематологическими злокачественными новообразованиями на нескольких этапах лечения проводится совместно с кортикостероидами, либо преднизоном, либо дексаметазоном. Легко заметить, что кортикостероиды могут синергизировать и усиливать нежелательные явления, такие как гиперлипидемия, панкреатит и тромбоз. Кроме того, аспарагиназа может способствовать некоторым побочным эффектам кортикостероидов, таким как остеонекроз, из-за состояния гиперкоагуляции, которое она создает. Поскольку оба этих препарата являются ключевыми терапевтическими факторами, требуется очень тщательный и внимательный мониторинг состояния пациента и возникновения нежелательных явлений, чтобы при необходимости вмешаться.

Оригинальность

Как универсальная, так и национальная библиография, относящаяся к влиянию аспарагиназы на активность LpL и Апо Е, а также к значениям липидов у детей, страдающих ОЛЛ во время химиотерапии с АСП, ограничена, в то время как не существует библиографической ссылки, коррелирующей с генетическими данными. фон для LpL и Apo E и соотношение липидного профиля. В настоящем исследовании впервые будут изучены полиморфизмы генов LpL и Apo E у детей с острым ОЛЛ во время лечения АСП.

Важность

В данном конкретном исследовании исследователи сосредоточатся на изучении липидного профиля детей с ОЛЛ, на влиянии АСП на липидный профиль этих пациентов, а также корреляции между полиморфизмами липопротеинлипазы (ЛПЛ) и аполипопротеина Е (АпоЕ) с значения липидов на время химиотерапевтического протокола. Гипотеза, которая будет проверена, заключается в том, сможет ли регистрация генотипов детей с ОЛЛ, находящихся в стадии исследования, стать упреждающим ориентировочным фактором для исхода их лечения.

Таким образом, будут сделаны важные выводы о вероятном вкладе генотипов детей, получающих L-ASP, в лабораторную демонстрацию липидных нарушений во время лечения, более тщательное наблюдение на соответствующих этапах лечения и своевременное терапевтическое вмешательство для для предотвращения каких-либо осложнений.

Методология

Тип исследования: Проспективное исследование случай-контроль Характеристика эпидемиологического исследования полностью соответствует цели нашего исследования, изучению влияния АСП на липидный профиль детей и подростков с ОЛЛ (группа пациентов), а также корреляции полиморфизмы LpL и ApoE в зависимости от уровня липидов в химиотерапевтическом протоколе. Существование двух дополнительных детских групп, которые будут выступать в качестве популяционного контроля (дети и подростки той же возрастной группы, у которых нет манифестации заболевания, и участники того же возраста, которые манифестируют заболевание и прошли химиотерапию в соответствии с протоколом в течение не менее за 6 месяцев до этого) превращает наш тип исследования в исследование случай-контроль.

Место исследования: Исследование будет проводиться в отделении детской и подростковой гематологии - онкологии 2-го отделения педиатрии Университета Аристотеля в Салониках (AUTH), в университетской больнице общего профиля AHEPA.

Описание записываемых параметров

При диагностике заболевания липидный профиль пациентов будет определяться путем измерения следующих параметров: общий холестерин, триглицериды, холестерин ЛПВП, холестерин ЛПНП, аполипопротеин А1, аполипопротеин В100, липопротеин α [Lp(α)], глюкоза , сывороточная глутаминовая щавелевоуксусная трансаминаза (SGOT), сывороточная глутаминовая пировиноградная трансаминаза (SGPT), тиреостимулирующий гормон (TSH), свободный тироксин (FT4), амилаза, липаза. Кроме того, будет проведен генетический анализ полиморфизмов LpL и Аро Е. Аналогичные измерения будут сделаны для всех участников всех групп.

Участники группы А будут немедленно подвергнуты химиотерапии по протоколу ALLIC BFM 2009. Во время нагрузочной дозы эти дети будут получать лечение преднизолоном в течение 33 дней подряд, а аспарагиназа будет добавлена ​​на 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33 дни. На поддерживающей фазе детей будут заново лечить кортикостероидами, дексаметазоном и добавлять аспарагиназу на 8, 11, 16, 18 дни. Идентичность липидов будет проверяться перед введением ASP в дни 0 и 11, а также после введения ASP и перед введением следующей нагрузочной дозы, то есть в дни 15, 24, 33. Точно так же идентичность липидов будет проверяться на поддерживающей фазе, то есть на 8, 16, 21 день, а также после окончания каждой фазы протокола химиотерапии, в которой ASP не вводится.

Кроме того, изучение полиморфизмов LpL (три наиболее распространенных полиморфизма p.N291S, p.D9N, p.S447X) и полиморфизмов Apo E [ε2(rs7412-T,rs429358-T), ε3(rs7412-C, rs429358- T) и ε4 (rs7412-C, rs429358-C)] будут выполнять после выделения ДНК из периферической крови и ее анализа молекулярными методами.

Участники, отвечающие всем критериям включения в это исследование, будут обследованы и пройдут лечение с помощью ASP (группа пациентов) и будут сравниваться с соответствующими группами здоровых детей и детей, которые больны и не проходят химиотерапию в течение как минимум 6 месяцев (контрольная группа). ).