Correlação dos Polimorfismos da Lipoproteína Lipase (LpL) e da Apolipoproteína E (Apo E) com o Perfil Lipídico de Crianças com Eucemia Linfoblástica Aguda Durante Terapia com L - Asparaginase.

Introdução

As malignidades durante a infância constituem a 2ª causa de morte, a seguir às lesões em todo o mundo. Segundo dados epidemiológicos, 300.000 novos casos de neoplasia se apresentam a cada ano em crianças e adolescentes menores de 19 anos1, 160.000 dos quais em menores de 15 anos. As neoplasias hematológicas constituem a doença neoplásica mais comum na população infantil, ocupando a leucemia aguda a primeira posição com uma percentagem de 32,8%, seguida dos tumores do sistema nervoso central com uma percentagem de 21% na segunda posição e do linfoma com uma percentagem de 12 % no terceiro lugar.

Definição - Fisiopatologia

A leucemia (L) é definida como um grupo de perturbações caracterizadas pela proliferação descontrolada de glóbulos brancos, devido à divergência primária da medula óssea em relação ao normal e à sua infiltração por células-tronco indiferenciadas imaturas. Por definição, mais de 20% da medula óssea é infiltrada por células-tronco. O mecanismo patogênico exato da leucemia ainda não foi esclarecido, mas parece ser o resultado de mutação genética e dano às células ancestrais hematopoiéticas multipotenciais, durante uma de suas distintas fases de diferenciação. Este fato leva à expansão clonal e inibição da diferenciação. O imunofenótipo da célula leucêmica reflete o nível de diferenciação alcançado pelo clone neoplásico. As células leucêmicas se dividem em um ritmo mais lento e requerem mais tempo para sintetizar o DNA em comparação com as células hematopoiéticas normais, causando anemia, trombocitopenia e neutropenia. No momento do diagnóstico, as células leucêmicas poderiam não apenas ter substituído as células normais da medula, mas também se expandido para áreas extramedulares.

Os vários tipos de leucemia são excepcionalmente heterogêneos e, dependendo da origem das células, diferenciam-se em leucemias linfoblásticas e não linfoblásticas. Cada um dos subgrupos mencionados acima pode ser encontrado em sua forma de Leucemia Aguda (AL) ou Leucemia Crônica (LC). Na forma aguda, as células imaturas do tecido hematopoiético são dominantes e a progressão da doença sem tratamento leva rapidamente à morte. Nas formas crônicas, as células maduras dominam o tecido e o desenvolvimento da doença, geralmente, é mais demorado. Em crianças, a leucemia é encontrada principalmente na forma aguda (97%) e na maioria dos casos se apresenta como Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA, 80%). A Leucemia Não Linfoblástica Aguda - ANLL é encontrada com menor frequência (17%) e inclui a Leucemia Mielóide Aguda - LMA (15%) e algumas outras formas raras (2%), enquanto os 3% restantes correspondem a leucemia crônica. A AL ocorre mais frequentemente entre as idades de 2 e 6 anos, enquanto a incidência é maior em meninos do que em meninas (1:1,3). 2,5% - 5% da LLA infantil e 6% - 14% da LMA infantil é encontrada em bebês com menos de 1 ano de idade. O tipo característico de LLA é a LLA de células B, que é adicionalmente a mais comum em crianças (85%) em comparação com a LLA de células T (15%) que é acompanhada por massas nos gânglios linfáticos do mediastino, entre outras áreas .

Epidemiologia

Nos Estados Unidos da América (EUA) e na maioria dos países da Europa Ocidental, a frequência de leucemia em crianças é de 3,5 a 4,0 casos por 100.000 crianças por ano e é classificada como a 20ª causa de morte entre as neoplasias malignas de todas as idades. Deduz-se de estudos de coorte em larga escala que a incidência de câncer infantil em países desenvolvidos está aumentando 1% a cada ano. A prevalência de LLA em crianças foi detectada pela primeira vez na década de 1930 no Reino Unido (RU) e nos EUA. Nos EUA, a ALL apareceu primeiro em crianças de ascendência europeia e, posteriormente, em crianças de ascendência africana na década de 1960. A frequência de LLA é menor em países em desenvolvimento e subdesenvolvidos, fato que sugere uma possível correlação entre industrialização e leucemogênese.

Asparaginase (ASP)

Os tratamentos combinados de quimioterapia usados ​​hoje para tratar a LLA melhoraram significativamente o curso de longo prazo da doença, com uma taxa de sobrevida global de cinco anos superior a 80%, enquanto a respectiva proporção na década de 1960 era inferior a 30%. Um dos principais motivos que contribuíram para esse desenvolvimento é a administração intensiva, prolongada e em dosagens mais altas de Asparaginase. A L-asparaginase (L-ASP) é um componente fundamental durante a dose de ataque para alcançar a remissão da doença e, da mesma forma, durante a dose de manutenção com a intenção de estabelecer essa remissão em crianças e adultos com LLA. O efeito citotóxico da administração exógena de asparaginase é causado pelo esgotamento da reserva de asparagina no sangue. A asparaginase atua como um catalisador para a hidrólise da asparagina em ácido aspártico e amônia. A asparagina é vital para a síntese de proteínas e células e, portanto, para sua sobrevivência. As células normais do corpo humano têm a capacidade de produzir asparagina a partir do ácido aspártico, com o auxílio da enzima asparagina sintetase. No entanto, as células neoplásicas carecem completamente da enzima ou contêm quantidades mínimas dela, resultando em sua incapacidade de sintetizar asparagina de novo. A sobrevivência dessas células e sua capacidade de sintetizar proteínas depende inteiramente do recebimento de asparagina do sangue. Assim, a administração de asparaginase leva à inibição da síntese de DNA, RNA e proteínas que, por sua vez, resulta na apoptose dessas células. Os baixos níveis de asparagina afetam apenas a capacidade de sobrevivência das células cancerígenas, deixando as células saudáveis ​​intactas.

A capacidade do L-ASP de suprimir a proliferação das células leucêmicas foi observada pela primeira vez em estudos clínicos durante a década de 1970 e, a partir desse momento, permaneceu como a pedra angular do tratamento infantil da LLA. As formas naturais da enzima, produzidas pelas bactérias Erwinia chrysanthemi e Escherichia coli (E.Coli), estão sendo usadas para tratamento, assim como o produto L-ASP criado a partir da conjugação de E. Coli. com polietileno glicol (Peguilado-Asparaginase, PEG-ASP) com meia-vida prolongada de 5,5 dias em vez da meia-vida de 26 horas das formas naturais. Os protocolos de quimioterapia para LLA recomendam a dosagem de 1.000 - 2.500 UI/m2 de PEG-ASP e 5.000 - 12.000 UI/m2 da forma natural.

Reações Adversas da Asparaginase

Apesar da importância primordial do L-ASP no tratamento quimioterápico da leucemia, ele é responsável por uma infinidade de efeitos adversos tóxicos que às vezes até exigem o término de sua administração. Estudos têm demonstrado que a omissão de administração de doses devido ao surgimento de efeitos adversos tóxicos em administrações anteriores está ligada a prognósticos ruins em crianças com LLA. Os efeitos adversos mais comuns são as reações de hipersensibilidade, pois estudos indicam que sua taxa de ocorrência chega a 75%. O ASP que está sendo utilizado é uma grande molécula de origem bacteriana (principalmente E. Coli) e assim é capaz de induzir uma resposta imune que se torna mais intensa após exposições repetidas e, principalmente, após um retardo na administração do medicamento. Além das reações clínicas de hipersensibilidade que sinalizam uma resposta imediata da equipe médica assistente, também existem reações subclínicas que podem levar a uma diminuição da potência do medicamento que é difícil de detectar para agir rapidamente. A pancreatite é relatada em uma taxa tão alta quanto 18% dos pacientes com LLA durante o tratamento com ASP. O mecanismo patogênico ainda não é conhecido, mas parece que a culpa está na diminuição da síntese protéica de órgãos com renovação proteica significativa, como o pâncreas. Além disso, considera-se que este mecanismo também seja responsável pela hepatotoxicidade detectada durante o tratamento com asparaginase. Além disso, a diminuição induzida por ASP na síntese de proteínas está envolvida nos processos de coagulação e fibrinólise que, por sua vez, leva a episódios trombóticos do sistema nervoso central e trombose venosa profunda das extremidades. Outras reações adversas são hiperglicemia, como resultado da diminuição da produção de insulina e mielossupressão, principalmente devido ao aumento do efeito de supressão de outras drogas quimioterápicas. Além disso, houve relatos de incidentes de encefalopatia durante a terapia com ASP que podem estar relacionados com os níveis elevados de amônia resultantes da degradação da ASP.

Um evento adverso crítico da ASP que pode resultar em complicações adicionais se não for prontamente identificado é um distúrbio no metabolismo de lipídios. Especificamente, parece que a ativação da via endógena que produz triglicerídeos por meio da síntese hepática leva à hipertrigliceridemia. Alguns estudos indicam que a taxa de valores elevados de triglicerídeos é de 67% 8 a 14 dias após a administração do medicamento. O fígado é capaz de sintetizar VLDL (lipoproteínas de densidade muito baixa) que são ricas em triglicerídeos. Utilizando o efeito da enzima Lipoproteína Lipase (LpL), localizada no endotélio vascular, os triglicerídeos se desprendem do VLDL fazendo com que este se transforme em IDL (Lipoproteínas de Densidade Intermediária) e depois em LDL (Lipoproteínas de Baixa Densidade). Os triglicerídeos são posteriormente extraídos do sistema circulatório sanguíneo e armazenados no tecido adiposo, enquanto as partículas de LDL se conectam com receptores teciduais ou receptores de macrófagos. Os produtos finais da degradação (provenientes da hidrólise periférica dos triglicerídeos com a ajuda de LpL) dos quilomícrons, VLDL, os remanescentes das lipoproteínas, serão eventualmente removidos pelos receptores hepáticos. A apolipoproteína E (apo-E) tem papel importante nesse procedimento, ligando-se a esses remanescentes na presença de LpL e lipase hepática.

Lipoproteína Lipase (LpL)

O gene LpL está localizado no cromossomo 8p22 e é composto por 10 exons. Foram registadas cerca de 100 mutações, sendo 3 delas as mais comuns, 2 das quais estão relacionadas com a redução da funcionalidade da LpL e aumento do risco cardiovascular. A mutação conhecida como polimorfismo N291S está presente em 2-5% da população geral e a sua existência está associada à diminuição da funcionalidade da LpL e a um desequilíbrio no metabolismo das VLDL [aumento dos triglicéridos, diminuição das HDL (High Density Lipoproteins)]. Além disso, parece que o efeito desta mutação é amplificado pela coexistência de outros fatores genéticos (hipercolesterolemia familiar, apolipoproteína E2/E2). A segunda mutação, conhecida como polimorfismo D9N, está relacionada ao aumento do risco de aterosclerose, mesmo que a mutação cause uma leve diminuição da funcionalidade da LpL. Ultimamente, observou-se que a combinação de polimorfismos de pequenos nucleotídeos (SNP) nos genes da Apo E e da LpL denomina um grupo de alto risco para doenças cardiovasculares. Por último, a terceira mutação, encontrada em 20% da população geral, o polimorfismo S447X está relacionado com níveis ligeiramente elevados de HDL e baixos níveis de triglicerídeos e, portanto, tem um impacto positivo no perfil lipídico.

Ao longo do tratamento com ASP, registra-se redução da funcionalidade de LpL, provavelmente causada pela síntese proteica totalmente reduzida do fígado, como é aparente pela diminuição das concentrações de outras proteínas, como albumina e fibrinogênio. Estudos têm demonstrado, em particular, que a supressão dos efeitos da LpL está ligada a um aumento na relação ApoCIII/ApoCII, onde a ApoCII é um cofator essencial da LpL e promove a hidrólise dos triglicerídeos e a ApoCIII atua como um inibidor da LpL enquanto simultaneamente parece ser capaz de regular os níveis de triglicerídeos no soro independentemente da LpL. Assim, cria-se um problema na limpeza dos triglicerídeos do plasma à medida que seus níveis aumentam. Outro mecanismo sugerido para os níveis elevados de triglicerídeos durante o tratamento com asparaginase é o aumento da síntese de VLDL, que também se reflete na alta concentração da apolipoproteína ApoB100, um componente do VLDL.

Apolipoproteína E (Apo E)

O gene da Apo E está situado no cromossomo 19 e é composto por 4 exons. A apolipoproteína E (Apo E) é um dos componentes estruturais incluídos nas lipoproteínas, que são ricas em triglicerídeos, e desempenha um papel importante na ingestão de proteínas hepáticas. A apolipoproteína E (Apo E) possui 3 alelos ε2, ε3, ε4 [APOE-ε2 (cys112, cis158), APOE-ε3 (cys112, arg158) e APOE-ε4 (arg112, arg158)]. ε3 é o mais comum na população em geral e contém cisteína na posição 112 e arginina na posição 158. ε4 difere de ε3 na posição 112, onde ao invés disso substitui a cisteína por arginina55. O isomorfo ε2 tem uma conexão mais fraca com os receptores de lipoproteínas do fígado, o que resulta no acúmulo de remanescentes de quilomícrons e VLDLs.

ApoE4 liga-se aos receptores de lipoproteínas no fígado in vitro tendo a mesma afinidade que ApoE3, porém o efeito de ApoE4 na limpeza de lipoproteínas ricas em triglicerídeos in vivo ainda é indefinido. O alelo ε2 está relacionado com níveis mais elevados de triglicerídeos após o jejum, enquanto o alelo ε4 está relacionado com hipercolesterolemia e colesterol LDL elevado. Os indivíduos com o genótipo E3/E4 apresentam uma limpeza mais lenta das lipoproteínas ricas em triglicerídeos em comparação com os indivíduos com o genótipo E3/E3. O alelo ε4 parece estar associado a um metabolismo de triglicerídeos afetado. Os indivíduos com o alelo ε2 têm níveis de colesterol mais baixos em comparação com os indivíduos com alelos ε3 e ε4. Estudos indicam, ainda, que indivíduos com genótipo E2/E4 apresentam maiores níveis de triglicerídeos após jejum em relação aos indivíduos com genótipo E3/E3.

Alterações no gene ApoE levam a alterações nos aminoácidos da proteína codificada, o que resulta em uma estrutura modificada da proteína normal. Este último resulta em uma limpeza mais lenta das lipoproteínas ricas em triglicerídeos. Em um estudo, foi revelado que havia uma maior prevalência do fenótipo E4/E3 em pacientes com hipertrigliceridemia em comparação com pacientes com níveis normais de triglicerídeos. Além disso, nenhuma diferença estatística significativa foi observada entre os níveis de triglicerídeos e os fenótipos de ApoE após o tratamento com asparaginase.

Asparaginase e perfil lipídico

No que diz respeito ao efeito da asparaginase nos níveis de colesterol, os estudos não permitem chegar a nenhuma conclusão confiável, pois alguns estudos encontraram um aumento em uma pequena porcentagem dos pacientes após a administração do medicamento, outros indicaram um aumento significativo, enquanto outros ainda apresentaram uma pequena, mas não significativa diminuição. Em relação aos níveis de HDL, estudos descobriram que eles são mais baixos em crianças com doenças malignas, especificamente de tipo hematológico. Outro estudo com foco em crianças com LLA, durante e após o tratamento com ASP, os níveis de HDL aumentaram com uma queda simultânea dos níveis de Apo-A1. O HDL desempenha um papel crucial no processo de transferência reversa do colesterol do tecido periférico para o fígado, um mecanismo que confere ao HDL as propriedades de um agente anticoagulante. Funcionando em conjunto com as propriedades acima mencionadas, outras partes do HDL têm propriedades antioxidantes, antiinflamatórias, antiapoptóticas e anticoagulantes que contribuem para a proteção contra a aterogênese. A lipoproteína Apo-A1 compreende a principal proteína estrutural do HDL. É evidente que a asparaginase como fator inibitório da síntese protéica possivelmente poderia modificar a proporção de lipídios/proteínas em favor da primeira nas moléculas de HDL. Baixos níveis de HDL e Apo-A1 foram observados mesmo em sobreviventes livres de LLA após o término do tratamento. Essa observação é de particular importância se pensarmos no perigo de ateromatose e doença coronariana devido aos baixos níveis de HDL.

A hipertrigliceridemia pode se tornar o único contribuinte para o desenvolvimento de pancreatite aguda. Quando os níveis de triglicerídeos sobem acima de 900 mg/dl, eles formam quilomícrons, moléculas grandes o suficiente para obstruir os capilares pancreáticos, levando à isquemia e liberação de lipase pancreática. Este último reforçará a lipólise com um aumento de ácidos graxos livres que, por sua vez, permitirá a liberação de radicais livres e derivados pró-inflamatórios causando, ao final, inflamação e necrose. Como visto acima, a asparaginase é capaz de participar da patogênese da pancreatite por duas vias, uma independente e outra dependente de triglicerídeos. A hipertrigliceridemia também poderia promover uma predisposição para trombose em pacientes com LLA e que estão em tratamento com ASP, pois por um lado o medicamento está ligado a modificações do sistema fibrinolítico, como já foi mencionado, enquanto por outro lado o aumento de triglicerídeos causa hiperviscosidade do sangue aumentando o risco de complicações tromboembólicas. Com base nos casos documentados na bibliografia universal, fica claro que a maioria das tromboses envolve o sistema nervoso central (SNC), enquanto em segundo lugar estão os casos de trombose venosa profunda das extremidades superiores.

Por último, é importante acrescentar que a administração de ASP a crianças com neoplasias hematológicas em múltiplas fases do tratamento é co-administrada com corticosteróides, prednisona ou dexametasona. Pode-se facilmente perceber que os corticosteroides podem sinergizar e intensificar os eventos adversos, como hiperlipidemia, pancreatite e trombose. Além disso, a asparaginase pode contribuir para alguns eventos adversos dos corticosteroides, como a osteonecrose, pelo estado hipercoagulante que ela cria. Uma vez que ambos os medicamentos são fatores terapêuticos essenciais, é necessário um monitoramento muito próximo e atento da condição do paciente e do surgimento de eventos adversos para intervir, se necessário.

Originalidade

Tanto a bibliografia universal quanto nacional que diz respeito ao efeito da asparaginase na potência de LpL e Apo E e aos valores dos lipídios em crianças que sofrem de LLA durante a quimioterapia com ASP é limitada, enquanto não existe referência bibliográfica correlacionando a genética antecedentes a LpL e Apo E e a relação do perfil lipídico. O presente estudo examinará pela primeira vez os polimorfismos gênicos de LpL e Apo E em crianças com LLA aguda durante o tratamento com ASP.

Importância

Neste estudo particular os investigadores irão focar-se na investigação do perfil lipídico de crianças com LLA, no efeito da ASP no perfil lipídico destes doentes, bem como na correlação entre os polimorfismos da lipoproteína lipase (LpL) e da apolipoproteína E (ApoE) com os valores de lipídios durante o protocolo quimioterápico. A hipótese a ser testada é se o registro dos genótipos das crianças em estudo com LLA poderá constituir um fator indicativo preemptivo para o resultado de seu tratamento.

Desta forma, serão extraídas conclusões vitais para a provável contribuição dos genótipos de crianças que estão recebendo L-ASP para a demonstração laboratorial de distúrbios lipídicos durante o tratamento, a supervisão mais próxima durante as fases correspondentes do tratamento e a intervenção terapêutica oportuna para para evitar qualquer complicação.

Metodologia

Tipo de estudo: Estudo prospectivo de caso-controle O estudo epidemiológico de caracterização está totalmente de acordo com o objetivo do nosso estudo, um estudo do efeito do ASP no perfil lipídico de crianças e adolescentes com LLA (Grupo de Pacientes), bem como a correlação de os polimorfismos de LpL e ApoE com a duração dos níveis lipídicos do protocolo quimioterápico. A existência de dois grupos infantis adicionais que atuarão como controle populacional (crianças e adolescentes da mesma faixa etária que não manifestam a doença e participantes de idades semelhantes que manifestaram a doença e completaram a quimioterapia conforme o protocolo por pelo menos 6 meses antes) especializa nosso tipo de estudo em um estudo de caso-controle.

Local do Estudo: O estudo será conduzido na Unidade de Hematologia Pediátrica e Adolescente - Unidade de Oncologia do 2º Departamento de Pediatria, Universidade Aristóteles de Thessaloniki (AUTH), no Hospital Geral Universitário AHEPA.

Descrição dos parâmetros registrados

Durante o diagnóstico da doença, o perfil lipídico dos pacientes será determinado pela medição dos seguintes parâmetros: colesterol total, triglicerídeos, HDL-colesterol, LDL-colesterol, apolipoproteína A1, apolipoproteína B100, lipoproteína α [Lp(α)], glicose , Transaminase glutâmica oxaloacética sérica (SGOT), Transaminase glutâmica pirúvica sérica (SGPT), Hormônio estimulante da tireoide (TSH), Tiroxina livre (FT4), amilase, lipase. Adicionalmente, uma análise genética para polimorfismos de LpL e Apo E será realizada. Medições semelhantes serão feitas para todos os participantes de todos os grupos.

Os participantes do grupo A serão imediatamente submetidos ao protocolo quimioterápico ALLIC BFM 2009. Durante a dose de ataque, essas crianças receberão tratamento com prednisolona por 33 dias consecutivos e a asparaginase será adicionada nos dias 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33. Durante a fase de manutenção as crianças serão submetidas novamente a tratamento com corticosteroides, dexametasona e será adicionada asparaginase nos dias 8, 11, 16, 18. A identidade lipídica será verificada antes da administração de ASP nos dias 0 e 11, bem como após a administração de ASP e antes da administração da próxima dose na dose de ataque, ou seja, dias 15, 24, 33. Da mesma forma, a identidade lipídica será verificada na fase de manutenção, ou seja, nos dias 8, 16, 21, bem como após o término de cada fase do protocolo quimioterápico em que não seja administrado ASP.

Além disso, um exame dos polimorfismos LpL (os três polimorfismos mais comuns p.N291S, p.D9N, p.S447X) e dos polimorfismos Apo E [ε2(rs7412-T,rs429358-T), ε3(rs7412-C, rs429358- T) e ε4 (rs7412-C, rs429358-C)] após isolamento do DNA do sangue periférico e análise com técnicas moleculares.

Os participantes que atenderem a todos os critérios de inclusão deste estudo serão examinados e submetidos a tratamento com ASP (Grupo de pacientes) e serão comparados com as respectivas equipes de crianças saudáveis ​​e crianças doentes e sem quimioterapia há pelo menos 6 meses (Grupo de controles ).