乌司他丁可降低心脏手术后肺部并发症发生率

步骤Ⅰ：乌司他丁术中应用与PPCs风险的回顾性队列研究 本研究部分设计为一项回顾性、多中心观察性研究，纳入了2014年1月至2022年12月期间在中国武汉三家医疗中心（具体为同济光谷医院、同济中法医院和同济汉口医院）接受择期心脏手术的成年患者。 由于研究设计的回顾性性质，样本量已预先确定[14]。

参与者 连续筛查接受择期心脏手术的成年患者资格，手术类型包括体外循环下心脏瓣膜修复、瓣膜置换术以及非体外循环冠状动脉旁路移植术。 排除标准如下：（1）年龄＜18岁；（2）孕妇；（3）本次住院前有心脏手术史；（4）术前存在急性呼吸系统疾病，如呼吸道感染、呼吸衰竭、胸腔积液、肺不张、气胸、支气管痉挛和肺炎；（5）本次住院期间在心脏手术前接受过乌司他丁治疗；（6）术中使用的乌司他丁总剂量低于50,000 U；（7）有恶性肿瘤或骨髓移植史。

变量 主要暴露因素为术中乌司他丁给药，定义依据：（1）剂量：术中总剂量（≥50,000 U）；（2）时机：首次给药于麻醉诱导时 versus 体外循环期间；（3）途径：静脉滴注。

人口学特征包括年龄、性别和吸烟状况，均在入院时确定。 临床合并症根据病历中的临床诊断记录，包括高血压、糖尿病、慢性肺部疾病（慢性阻塞性肺疾病、哮喘、慢性支气管炎、支气管扩张）和慢性肾功能衰竭。 患者术前实验室指标包括入院24小时内获得的静脉血检测结果，涵盖白细胞计数和血红蛋白浓度。

基于既往文献和生物学合理性，测量的混杂因素包括已知或假设会影响PPCs风险的变量。 这些协变量包括年龄、性别、体重指数（BMI）、术前血红蛋白水平、术前白细胞计数、术前血压以及合并症。 所有协变量均预先指定并纳入多变量调整模型，以解决基线不平衡问题并减轻临床结局评估中的混杂偏倚。

结局 主要结局为术后7天内或出院前发生PPCs。 PPCs的诊断标准基于欧洲麻醉学会和欧洲重症监护医学会于2015年联合发布的《欧洲围术期临床结局定义》中的规定。 在本研究中，PPCs包括呼吸道感染、呼吸衰竭、胸腔积液、肺不张、支气管痉挛和吸入性肺炎。 值得注意的是，鉴于开胸是心脏手术的标准步骤，术后气胸因此是常见的手术后继发症，本研究将术后气胸排除在PPCs定义之外。

次要结局包括术后谵妄和院内全因死亡率。 术后谵妄诊断采用两项标准：（1）有记录的术后谵妄诊断被视为确诊并接受为有效；（2）若无初始术后谵妄诊断，数据提取员回顾性审查临床记录以寻找谵妄迹象。 回顾性术后谵妄诊断标准与《精神障碍诊断与统计手册》第五版（DSM-5）中谵妄的适应性补充诊断标准保持一致[7]。 院内全因死亡率定义为术后任何原因导致的院内死亡。

偏倚控制 研究全程实施多种策略以减轻潜在偏倚。 临床数据提取由两名训练有素的研究人员依据标准化方案独立进行，利用电子病历检索的信息。 分歧由第三位资深评审员裁决，以确保数据一致性和准确性。 临床结局由对暴露数据不知情的独立临床研究团队确定，从而进一步减少信息偏倚。 基于生物学合理性和既往证据确定的预定混杂变量被纳入多变量模型，以控制混杂偏倚。

步骤Ⅱ：基于网络药理学的预测与分子对接模拟 为探究乌司他丁降低心脏手术患者PPCs的分子机制，本部分采用网络药理学与分子对接相结合的综合方法。

疾病靶点收集与标准化

这些靶点涵盖六种关键PPCs相关临床病症，各自靶点数量如下：呼吸道感染（n = 14,411）；吸入性肺炎（n = 4,033）；肺不张（n = 1,107）；胸腔积液（n = 2,282）；支气管痉挛（n = 7,293）；呼吸衰竭（n = 12,467）。 为确保靶点名称一致性，所有靶点基因名称均使用UniProt数据库进行标准化。 通过筛选上述数据集中的重叠基因，识别出共表达基因，这些基因被视为连接乌司他丁与PPCs潜在病理生理机制的分子介质。

功能富集分析 为阐明共表达基因的生物学功能及其在信号级联中的参与，并行进行了基因本体（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析[17, 18]。 采用调整后P值＜0.05的统计阈值，以确保富集结果的稳健性和功能相关性。

潜在靶点蛋白定位 选择细胞外分泌蛋白是因为乌司他丁作为广谱蛋白酶抑制剂，其主要在细胞外空间发挥生物学效应；因此，仅考虑细胞外靶点以确保乌司他丁与其靶点间的生物学合理性。 细胞外分泌蛋白数据集获取自人类蛋白质组图谱，心脏手术相关靶点获取自GeneCards数据库（心脏外科手术，n = 5,931）。 通过取术后肺部并发症相关靶点、心脏手术相关靶点与细胞外分泌蛋白数据集的交集，精确识别出潜在靶点蛋白。

蛋白质-蛋白质相互作用网络构建 在功能分析的同时，使用STRING数据库构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，分析范围限于维恩图中识别的重叠靶点。 为确保相互作用的高置信度，物种指定为智人，并应用严格的相互作用得分阈值（≥0.9）。

乌司他丁关键靶点基因识别 采用系统方法识别乌司他丁的关键分子靶点：首先，从PubChem数据库检索化合物的精确名称和分子式，并导入Swiss-Target Prediction平台以预测和检索潜在靶点分子。 随后，进行交集分析以整合乌司他丁靶点分子与上述共表达基因数据集，筛选同时满足“受乌司他丁调控”、“在相关生物学背景下细胞外分泌”和“共表达”标准的分子。 接着使用Friends分析构建基因相互作用网络以进一步优化，基于连通性和中心性等网络拓扑指标评估每个基因的重要性。 最终，识别出介导乌司他丁潜在生物学效应的关键节点基因。

分子对接与动力学模拟 小分子配体乌司他丁的三维结构从PubChem数据库检索（PubChem CID: 105102），而蛋白质MMP3结构（PDB ID: 4g9l）从RCSB PDB数据库获取。 优先选择结构准确性最高的人类蛋白质构象用于后续分析。 使用PyMOL软件对靶蛋白进行对接前预处理：首先，从结构中移除冗余水分子和内源性配体，以消除非特异性相互作用的干扰；随后，向蛋白质主链和侧链添加氢原子，确保结合位点质子化状态的完整性，从而提高对接计算的准确性。 使用CB-Dock2在线平台（https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/index.php）进行分子对接模拟。 对接后，利用LIGPLOT软件生成蛋白质-配体相互作用示意图，直观展示关键结合残基和分子间作用力（包括氢键、疏水相互作用和范德华力）。 此过程阐明了配体与靶蛋白之间的具体结合模式。

步骤Ⅲ：临床样本验证 临床验证队列研究设计与受试者 这是一项前瞻性观察性研究。 临床验证队列的血浆样本采集自2023年4月至2024年9月期间接受择期心脏手术的成年患者，包括体外循环辅助下的心脏瓣膜修复、瓣膜置换术和非体外循环冠状动脉旁路移植术。 应用与本研究第一部分相同的排除标准。 本研究的主要结局是术后7天内或出院前发生PPCs。

样本量 基于乌司他丁组和非乌司他丁组PPCs发生率计算最小样本量。 根据研究第一部分数据，乌司他丁组PPCs发生率为22.8%，非乌司他丁组为2.7%。 使用PASS软件进行样本量计算，参数设置如下：显著性水平（α）= 0.05，统计功效（1-β）= 0.80。 初始样本量为168例，额外计入15%的脱落率，得出最小所需样本量为193例。

血液样本采集与检测 在三个预定的围术期时间点从患者采集静脉血样本：（1）术前（手术切口前）；（2）术后即刻（入住重症监护室时）；（3）术后24小时。 样本处理流程：血液采集至EDTA抗凝管中，轻柔颠倒混匀，冰上运输。 通过快速离心在以下条件下分离血浆：[3000 × g，4℃，10分钟]。 分装的血浆样本立即储存于-80℃专用生物样本库，用于后续批量检测。 使用HM10736试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）严格按照制造商方案，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）进行定量。

统计方法 使用Shapiro-Wilk检验评估连续变量的正态性。 正态分布变量以均数±标准差（x̄ ± s）表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。 若Levene检验提示方差不齐，则改用Welch's ANOVA。 偏态连续变量以中位数（四分位距）[M（P25，P75）]表示，组间比较采用Kruskal-Wallis检验。 分类变量以计数（百分比）[n（%）]表示，组间比较根据样本量和预期频数分布采用卡方检验或Fisher精确检验。

鉴于PPCs主要发生在术后7天内且所有患者均随访至出院，采用逻辑回归分析。 使用多变量逻辑回归模型检验血浆MMP3浓度变化与临床结局之间的关联。 基于临床相关性和既往文献选择的预定协变量被纳入模型进行调整。 结果以优势比（OR）和95%置信区间（95% CI）报告，反映关联强度和统计精确度。 设定双尾P＜0.05为统计学显著性阈值。

在逻辑回归模型中纳入交互项，以探讨性别和合并症等因素对主要关联的修饰效应。 使用似然比检验比较含与不含交互项的模型，并计算交互P值以评估这些效应的统计学显著性。 基于上述因素进行进一步的亚组分析，以识别不同亚组间的差异关联效应。