Ulinastatin zmniejsza pooperacyjne powikłania płucne w chirurgii serca

Krok Ⅰ: Retrospektywne badanie kohortowe dotyczące stosowania ulinastatyny śródoperacyjnej i ryzyka PPCs Ta część badania została zaprojektowana jako retrospektywne, wieloośrodkowe badanie obserwacyjne, obejmujące dorosłych pacjentów poddanych planowej operacji kardiochirurgicznej w trzech ośrodkach medycznych – szpitalu Tongji Guanggu, szpitalu Tongji Zhongfa oraz szpitalu Tongji Hankou, wszystkie zlokalizowane w Wuhan w Chinach – w okresie od stycznia 2014 do grudnia 2022. Ze względu na retrospektywny charakter badania, wielkość próby została ustalona z góry[14].

Uczestnicy Dorośli pacjenci poddawani planowej operacji kardiochirurgicznej, w tym naprawie zastawki serca na otwartym sercu, wymianie zastawki z użyciem krążenia pozaustrojowego oraz pomostowaniu aortalno-wieńcowemu bez użycia krążenia pozaustrojowego, byli kolejno kwalifikowani do badania. Kryteria wykluczenia były następujące: (1) wiek < 18 lat; (2) kobiety w ciąży; (3) wywiad wcześniejszej operacji kardiochirurgicznej przed obecną hospitalizacją; (4) obecność ostrych chorób układu oddechowego przed operacją, takich jak infekcje dróg oddechowych, niewydolność oddechowa, płyn w opłucnej, niedodma, odma opłucnowa, skurcz oskrzeli i zapalenie płuc; (5) podanie terapii ulinastatyną przed operacją kardiochirurgiczną podczas obecnej hospitalizacji; (6) Lek ulinastatyna był stosowany podczas operacji, z całkowitą dawką śródoperacyjną mniejszą niż 50 000 U; (7) wywiad choroby nowotworowej lub przeszczepu szpiku kostnego.

Zmienne Główną ekspozycją było śródoperacyjne podanie ulinastatyny, zdefiniowane przez: (1) dawkę: całkowita dawka śródoperacyjna (≥50 000 U); (2) czas: pierwsze podanie przy indukcji znieczulenia vs podczas krążenia pozaustrojowego; (3) droga podania: wlew dożylny.

Charakterystyki demograficzne obejmowały wiek, płeć i status palenia tytoniu, wszystkie ustalone przy przyjęciu. Współistniejące schorzenia kliniczne były dokumentowane na podstawie rozpoznań klinicznych w dokumentacji medycznej, w tym nadciśnienie tętnicze, cukrzyca, przewlekłe choroby płuc (przewlekła obturacyjna choroba płuc, astma, przewlekłe zapalenie oskrzeli, rozstrzenie oskrzeli) oraz przewlekła niewydolność nerek. Przedoperacyjne wskaźniki laboratoryjne dla pacjentów obejmowały wyniki badań krwi żylnej pobranej w ciągu 24 godzin od przyjęcia, w tym liczbę białych krwinek i stężenie hemoglobiny.

Na podstawie wcześniejszej literatury i wiarygodności biologicznej, mierzone czynniki zakłócające obejmowały zmienne znane lub hipotetycznie wpływające na ryzyko PPCs. Te kowarianty obejmowały wiek, płeć, wskaźnik masy ciała (BMI), poziom hemoglobiny przed operacją, liczbę białych krwinek przed operacją, ciśnienie krwi przed operacją oraz choroby współistniejące. Wszystkie kowarianty były z góry określone i włączone do wielowymiarowego modelu korygującego w celu rozwiązania problemu nierównowagi wyjściowej i złagodzenia błędu zakłócającego w ocenie wyników klinicznych.

Wyniki Głównym wynikiem było wystąpienie PPCs w ciągu 7 dni po operacji lub przed wypisem ze szpitala. Kryteria diagnostyczne PPCs opierały się na definicjach zawartych w europejskich definicjach wyniku klinicznego okołooperacyjnego, opublikowanych wspólnie przez Europejskie Towarzystwo Anestezjologiczne i Europejskie Towarzystwo Intensywnej Terapii w 2015 roku. W niniejszym badaniu PPCs obejmowały infekcje dróg oddechowych, niewydolność oddechową, płyn w opłucnej, niedodmę, skurcz oskrzeli i zachłystowe zapalenie płuc. Warto zauważyć, że ponieważ torakotomia jest standardowym elementem operacji kardiochirurgicznej, a pooperacyjna odma opłucnowa jest zatem powszechnym następstwem proceduralnym, pooperacyjna odma opłucnowa została wykluczona z definicji PPCs w tym badaniu.

Wyniki drugorzędowe obejmowały pooperacyjną majaczenie i śmiertelność ogólną w szpitalu. Do diagnozy pooperacyjnego majaczenia zastosowano dwa kryteria: (1) udokumentowane rozpoznanie pooperacyjnego majaczenia uznawano za potwierdzone i ważne; (2) w przypadku braku wstępnego rozpoznania pooperacyjnego majaczenia, osoby wyciągające dane retrospektywnie przeglądały dokumentację kliniczną pod kątem objawów majaczenia. Kryteria retrospektywnej diagnozy pooperacyjnego majaczenia były zgodne z zaadaptowanymi uzupełniającymi kryteriami diagnostycznymi z Podręcznika diagnostyki i statystyki zaburzeń psychicznych, wydanie 5 (DSM-5) dla majaczenia[7]. Śmiertelność ogólna w szpitalu została zdefiniowana jako zgon w szpitalu z jakiejkolwiek przyczyny po operacji.

Błąd W trakcie badania wdrożono wiele strategii w celu złagodzenia potencjalnych błędów. Ekstrakcja danych klinicznych została przeprowadzona niezależnie przez dwóch przeszkolonych badaczy zgodnie ze standaryzowanym protokołem, wykorzystując informacje pozyskane z elektronicznej dokumentacji medycznej. Rozbieżności były rozstrzygane przez trzeciego starszego recenzenta w celu zapewnienia spójności i dokładności danych. Wyniki kliniczne były ustalane przez niezależny zespół badawczy, zaślepiony na dane dotyczące ekspozycji, co dodatkowo redukowało błąd informacyjny. Z góry zdefiniowane zmienne zakłócające, zidentyfikowane na podstawie wiarygodności biologicznej i wcześniejszych dowodów, zostały włączone do modeli wielowymiarowych w celu kontroli błędu zakłócającego.

Krok Ⅱ: Predykcja oparta na farmakologii sieciowej i symulacje dokowania molekularnego Aby zbadać molekularne mechanizmy leżące u podstaw redukcji PPCs przez ulinastatynę u pacjentów poddawanych operacjom kardiochirurgicznym, ta część przyjmuje zintegrowane podejście łączące farmakologię sieciową i dokowanie molekularne.

Zbiór i standaryzacja celów choroby

Te cele obejmowały sześć kluczowych stanów klinicznych związanych z PPCs, z odpowiednimi liczbami celów jak następuje: Infekcje dróg oddechowych (n = 14 411); Zachłystowe zapalenie płuc (n = 4033); Niedodma płuc (n = 1107); Płyn w opłucnej (n = 2282); Skurcz oskrzeli (n = 7293); oraz Niewydolność oddechowa (n = 12 467). Aby zapewnić spójność nazw celów, wszystkie nazwy genów docelowych zostały ustandaryzowane przy użyciu bazy danych UniProt. Poprzez przesiewanie pod kątem nakładających się genów w wyżej wymienionych zestawach danych, zidentyfikowano geny współeksprymowane, które uznano za molekularne mediatory łączące ulinastatynę z potencjalnymi mechanizmami patofizjologicznymi PPCs.

Analiza wzbogacenia funkcjonalnego Aby wyjaśnić funkcje biologiczne genów współeksprymowanych i ich udział w kaskadach sygnałowych, równolegle przeprowadzono analizę wzbogacenia Gene Ontology (GO) i analizę ścieżek Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)[17, 18]. Zastosowano statystyczny próg skorygowanej wartości P < 0,05, aby zapewnić solidność i funkcjonalną relewantność wyników wzbogacenia.

Lokalizacja potencjalnych białek docelowych Wybrano zewnątrzkomórkowe białka wydzielnicze, ponieważ ulinastatyna, jako szerokospektralny inhibitor proteaz, wykazuje swoje efekty biologiczne głównie w przestrzeni zewnątrzkomórkowej; zatem, tylko cele zewnątrzkomórkowe były brane pod uwagę, aby zapewnić wiarygodność biologiczną między ulinastatyną a jej celami. Zestaw danych białek wydzielniczych zewnątrzkomórkowych uzyskano z Human Proteome Atlas, a cele związane z operacjami kardiochirurgicznymi uzyskano z bazy danych GeneCards (Procedury chirurgiczne kardiochirurgiczne, n = 5931). Potencjalne białka docelowe zostały precyzyjnie zidentyfikowane poprzez wzięcie przecięcia celów związanych z pooperacyjnymi powikłaniami płucnymi, celów związanych z operacjami kardiochirurgicznymi oraz zestawu danych białek wydzielniczych zewnątrzkomórkowych.

Konstrukcja sieci interakcji białko-biało Równolegle z analizą funkcjonalną, zbudowano sieć interakcji białko-biało (PPI) przy użyciu bazy danych STRING, z zakresem analizy ograniczonym do nakładających się celów zidentyfikowanych na diagramie Venna. Aby zapewnić wysoką wiarygodność interakcji, gatunek został określony jako Homo sapiens, i zastosowano rygorystyczny próg punktowy interakcji (≥0,9).

Identyfikacja kluczowych genów docelowych ulinastatyny Zastosowano systematyczne podejście do identyfikacji kluczowych molekularnych celów ulinastatyny: najpierw, dokładną nazwę i wzór cząsteczkowy związku pobrano z bazy danych PubChem i zaimportowano do platformy Swiss-Target Prediction w celu przewidzenia i pobrania potencjalnych cząsteczek docelowych. Następnie przeprowadzono analizę przecięcia w celu zintegrowania cząsteczek docelowych ulinastatyny z wyżej wymienionym zestawem danych genów współeksprymowanych, przesiewając pod kątem cząsteczek, które jednocześnie spełniają kryteria "regulowane przez ulinastatynę", "wydzielane zewnątrzkomórkowo w odpowiednich kontekstach biologicznych" i "współeksprymowane". Następnie zbudowano sieć interakcji genów przy użyciu analizy Friends w celu dalszej optymalizacji, z oceną ważności każdego genu na podstawie metryk topologicznych sieci, takich jak łączność i centralność. Wreszcie, zidentyfikowano kluczowe geny węzłowe pośredniczące w potencjalnych efektach biologicznych ulinastatyny.

Dokowanie molekularne i symulacje dynamiki Trójwymiarową strukturę małocząsteczkowego ligandu ulinastatyny pobrano z bazy danych PubChem (PubChem CID: 105102), podczas gdy strukturę białka MMP3 (PDB ID: 4g9l) uzyskano z bazy danych RCSB PDB. Priorytetowano konformację białka ludzkiego z najwyższą dokładnością strukturalną do dalszych analiz. Wstępne przetwarzanie białka docelowego przed dokowaniem wykonano przy użyciu oprogramowania PyMOL: najpierw, zbędne cząsteczki wody i endogenne ligandy zostały usunięte ze struktury w celu wyeliminowania zakłóceń od niespecyficznych interakcji; następnie, dodano atomy wodoru do szkieletu białka i łańcuchów bocznych, aby zapewnić kompletność stanu protonacji w miejscu wiązania, poprawiając tym samym dokładność obliczeń dokowania. Symulacje dokowania molekularnego przeprowadzono przy użyciu platformy online CB-Dock2 (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/index.php). Po dokowaniu, wykorzystano oprogramowanie LIGPLOT do wygenerowania schematów interakcji białko-ligand, które wizualnie ilustrują kluczowe reszty wiążące i siły międzycząsteczkowe (w tym wiązania wodorowe, interakcje hydrofobowe i siły van der Waalsa). Ten proces wyjaśnia specyficzny tryb wiązania między ligandem a białkiem docelowym.

Krok III: Walidacja w próbkach klinicznych Projekt badania kohorty walidacyjnej klinicznej i podmioty Jest to prospektywne badanie obserwacyjne. Próbki osocza z kohorty walidacyjnej klinicznej pobrano od dorosłych pacjentów poddanych planowej operacji kardiochirurgicznej między kwietniem 2023 a wrześniem 2024, w tym naprawie zastawki serca na otwartym sercu, wymianie zastawki wspomaganej krążeniem pozaustrojowym oraz pomostowaniu aortalno-wieńcowemu bez użycia krążenia pozaustrojowego. Zastosowano te same kryteria wykluczenia, co w pierwszej części tego badania. Głównym wynikiem tego badania jest wystąpienie PPCs w ciągu 7 dni po operacji lub przed wypisem.

Wielkość próby Minimalną wielkość próby obliczono na podstawie częstości występowania PPCs w grupie z ulinastatyną i bez ulinastatyny. Jak wynika z pierwszej części badania, częstości występowania PPCs wynosiły 22,8% w grupie z ulinastatyną i 2,7% w grupie bez ulinastatyny. Obliczenia wielkości próby wykonano przy użyciu oprogramowania PASS z parametrami ustawionymi następująco: poziom istotności (α) = 0,05 i moc statystyczna (1-β) = 0,80. Wielkość próby początkowo składała się z 168 przypadków, z dodatkowym uwzględnieniem 15% wskaźnika utraty, co prowadzi do minimalnej wymaganej wielkości próby wynoszącej 193 przypadki.

Pobieranie i badanie próbek krwi Próbki krwi żylnej pobierano od pacjentów w trzech z góry określonych punktach czasowych okołooperacyjnych: (1) przedoperacyjnie (przed nacięciem chirurgicznym); (2) bezpośrednio po operacji (przy przyjęciu na oddział intensywnej terapii); oraz (3) 24 godziny po operacji. Procedura przetwarzania próbek: Krew pobierano do probówek z antykoagulantem EDTA, delikatnie mieszano przez odwracanie i transportowano na lodzie. Osocze oddzielano poprzez szybką wirowanie w następujących warunkach: [3000 × g, 4℃, 10 min]. Porcjowane próbki osocza były natychmiast przechowywane w temperaturze -80°C w dedykowanym biobanku do późniejszego testowania partiami. Ilościowo oznaczano przy użyciu testu immunoenzymatycznego (ELISA) z zestawem HM10736 (Bio-swamp Company, Wuhan, Chiny), ściśle według protokołów producenta.

Metody statystyczne Test Shapiro-Wilka został użyty do oceny normalności zmiennych ciągłych. Zmienne o rozkładzie normalnym wyrażono jako średnia ± odchylenie standardowe (x̄ ± s), z porównaniami międzygrupowymi przeprowadzonymi przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA). Jeśli test Levene'a wskazywał na nierówne wariancje, zamiast tego stosowano ANOVA Welcha. Skośne zmienne ciągłe przedstawiono jako mediana (zakres międzykwartylowy) [M (P25, P75)], a porównania międzygrupowe przeprowadzono przy użyciu testu Kruskala-Wallisa. Zmienne kategoryczne wyrażono jako liczby (procenty) [n (%)], z porównaniami międzygrupowymi przy użyciu testu chi-kwadrat lub dokładnego testu Fishera, w zależności od wielkości próby i oczekiwanego rozkładu częstości.

Biorąc pod uwagę, że PPCs występują głównie w ciągu 7 dni po operacji i wszyscy pacjenci byli obserwowani do wypisu, zastosowano regresję logistyczną. Wielowymiarowe modele regresji logistycznej zostały zastosowane do zbadania związku między zmianami stężenia MMP3 w osoczu a wynikami klinicznymi. Z góry zdefiniowane kowarianty, wybrane na podstawie relewantności klinicznej i wcześniejszej literatury, zostały uwzględnione w modelach w celu korekty. Wyniki przedstawiono jako ilorazy szans (OR) z 95% przedziałami ufności (95% CI), odzwierciedlające siłę związku i precyzję statystyczną. Dwustronne P < 0,05 ustawiono jako próg istotności statystycznej.

Terminy interakcji zostały włączone do modeli regresji logistycznej w celu zbadania modyfikujących efektów czynników takich jak płeć i choroby współistniejące na główny związek. Test ilorazu wiarygodności został użyty do porównania modeli z terminami interakcji i bez nich, a wartości P interakcji zostały obliczone w celu oceny statystycznej istotności tych efektów. Dodatkowo przeprowadzono analizy podgrup na podstawie wyżej wymienionych czynników w celu zidentyfikowania zróżnicowanych efektów związku w podgrupach.