Ulinastatine vermindert postoperatieve pulmonale complicaties bij hartchirurgie

Stap Ⅰ: Retrospectieve Cohortstudie van Intraoperatieve Ulinastatine en Risico op Postoperatieve Pulmonale Complicaties Dit deel van de studie is ontworpen als een retrospectief, multicentrisch observationeel onderzoek, waarbij volwassen patiënten zijn betrokken die een electieve hartoperatie ondergingen in drie medische centra - specifiek Tongji Guanggu Ziekenhuis, Tongji Zhongfa Ziekenhuis en Tongji Hankou Ziekenhuis, alle gevestigd in Wuhan, China - tussen januari 2014 en december 2022. Vanwege het retrospectieve ontwerp van de studie was de steekproefomvang vooraf bepaald[14].

Deelnemers Volwassen patiënten die een electieve hartoperatie ondergingen, inclusief openhartklepreparatie, klepvervanging met cardiopulmonale bypass en off-pump coronairarterie-bypass-transplantatie, werden opeenvolgend gescreend op geschiktheid. Uitsluitingscriteria waren als volgt: (1) leeftijd < 18 jaar; (2) zwangere vrouwen; (3) geschiedenis van eerdere hartchirurgie vóór de huidige ziekenhuisopname; (4) aanwezigheid van acute luchtwegaandoeningen vóór de operatie, zoals luchtweginfecties, respiratoir falen, pleuravocht, atelectase, pneumothorax, bronchospasme en pneumonie; (5) toediening van ulinastatine-therapie vóór hartchirurgie tijdens de huidige ziekenhuisopname; (6) Het geneesmiddel ulinastatine werd gebruikt tijdens de operatie, met een totale intraoperatieve dosis van minder dan 50.000 E; (7) geschiedenis van maligniteit of beenmergtransplantatie.

Variabelen De primaire blootstelling was intraoperatieve toediening van ulinastatine, gedefinieerd door: (1) dosering: totale intraoperatieve dosis (≥50.000 E); (2) timing: eerste toediening bij anesthesie-inductie versus tijdens cardiopulmonale bypass; (3) toedieningsweg: intraveneuze infusie.

Demografische kenmerken omvatten leeftijd, geslacht en rookstatus, allemaal vastgesteld bij opname. Klinische comorbiditeiten werden gedocumenteerd op basis van klinische diagnoses in medische dossiers, inclusief hypertensie, diabetes, chronische longaandoeningen (chronische obstructieve longziekte, astma, chronische bronchitis, bronchiëctasieën) en chronisch nierfalen. Preoperatieve laboratoriumindicatoren voor patiënten bestonden uit veneuze bloedtestresultaten verkregen binnen 24 uur na opname, inclusief witte bloedceltelling en hemoglobineconcentratie.

Op basis van eerdere literatuur en biologische plausibiliteit omvatten gemeten verstorende factoren variabelen waarvan bekend is of wordt verondersteld dat ze het risico op postoperatieve pulmonale complicaties beïnvloeden. Deze covariabelen omvatten leeftijd, geslacht, body mass index (BMI), preoperatief hemoglobinegehalte, preoperatieve witte bloedceltelling, preoperatieve bloeddruk en comorbiditeiten. Alle covariabelen waren vooraf gespecificeerd en opgenomen in een multivariate aanpassingsmodel om baseline-onevenwichtigheden aan te pakken en verstorende bias in de beoordeling van klinische uitkomsten te verminderen.

Uitkomsten De primaire uitkomst was de ontwikkeling van postoperatieve pulmonale complicaties binnen 7 dagen postoperatief of vóór ziekenhuisontslag. De diagnostische criteria voor postoperatieve pulmonale complicaties waren gebaseerd op de definities uiteengezet in de Europese Perioperatieve Klinische Uitkomstdefinities, gezamenlijk gepubliceerd door de Europese Vereniging voor Anesthesiologie en de Europese Vereniging voor Intensive Care Geneeskunde in 2015. In de huidige studie omvatten postoperatieve pulmonale complicaties luchtweginfecties, respiratoir falen, pleuravocht, atelectase, bronchospasme en aspiratiepneumonie. Opmerkelijk is dat, aangezien thoracotomie een standaardonderdeel is van hartchirurgie en postoperatieve pneumothorax dus een veelvoorkomende procedurele sequela is, postoperatieve pneumothorax werd uitgesloten van de definitie van postoperatieve pulmonale complicaties in deze studie.

Secundaire uitkomsten omvatten postoperatieve delirium en ziekenhuissterfte door alle oorzaken. Voor postoperatieve deliriumdiagnose werden twee criteria toegepast: (1) een gedocumenteerde postoperatieve deliriumdiagnose werd als bevestigd beschouwd en geaccepteerd als geldig; (2) bij afwezigheid van een initiële postoperatieve deliriumdiagnose, beoordeelden data-abstracteurs retrospectief klinische dossiers op tekenen van delirium. De criteria voor retrospectieve postoperatieve deliriumdiagnose waren afgestemd op de aangepaste aanvullende diagnostische criteria uit de Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 5th Edition (DSM-5) voor delirium[7]. Ziekenhuissterfte door alle oorzaken werd gedefinieerd als ziekenhuissterfte door welke oorzaak dan ook na de operatie.

Bias Meerdere strategieën werden gedurende de studie geïmplementeerd om mogelijke bias te verminderen. Klinische data-extractie werd onafhankelijk uitgevoerd door twee getrainde onderzoekers in overeenstemming met een gestandaardiseerd protocol, gebruikmakend van informatie verkregen uit elektronische medische dossiers. Tegenstrijdigheden werden beoordeeld door een derde senior beoordelaar om data-consistentie en -nauwkeurigheid te waarborgen. Klinische uitkomsten werden vastgesteld door een onafhankelijk klinisch onderzoeksteam dat geblindeerd was voor blootstellingsdata, waardoor informatiebias verder werd verminderd. Vooraf gedefinieerde verstorende variabelen, geïdentificeerd op basis van biologische plausibiliteit en eerder bewijs, werden opgenomen in multivariate modellen om verstorende bias te controleren.

Stap Ⅱ: Netwerkfarmacologie-gebaseerde Voorspelling en Moleculaire Docking Simulaties Om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de vermindering van postoperatieve pulmonale complicaties door ulinastatine bij hartchirurgiepatiënten te onderzoeken, neemt dit deel een geïntegreerde benadering aan die netwerkfarmacologie en moleculaire docking combineert.

Verzameling en Standaardisatie van Ziektedoelwitten

Deze doelwitten omvatten zes belangrijke postoperatieve pulmonale complicaties-gerelateerde klinische aandoeningen, met respectievelijke aantallen doelwitten als volgt: Luchtweginfecties (n = 14.411); Aspiratiepneumonie (n = 4.033); Pulmonale atelectase (n = 1.107); Pleuravocht (n = 2.282); Bronchospasme (n = 7.293); en Respiratoir falen (n = 12.467). Om consistentie in doelwitnamen te waarborgen, werden alle doelwitgennamen gestandaardiseerd met behulp van de UniProt-database. Door te screenen op overlappende genen in de bovengenoemde datasets, werden co-gereguleerde genen geïdentificeerd, die werden beschouwd als moleculaire mediatoren die ulinastatine verbinden met potentiële pathofysiologische mechanismen van postoperatieve pulmonale complicaties.

Functionele verrijkingsanalyse Om de biologische functies van co-gereguleerde genen en hun deelname aan signaalcascades te verduidelijken, werden Gene Ontology (GO) verrijkingsanalyse en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) padanalyse parallel uitgevoerd[17, 18]. Een statistische drempel van aangepaste P-waarde < 0,05 werd toegepast om de robuustheid en functionele relevantie van de verrijkingsresultaten te waarborgen.

Lokalisatie van potentiële doelwiteiwitten Extracellulaire uitgescheiden eiwitten werden geselecteerd omdat ulinastatine, als een breedspectrum protease-remmer, zijn biologische effecten voornamelijk in de extracellulaire ruimte uitoefent; dus werden alleen extracellulaire doelwitten overwogen om biologische plausibiliteit tussen ulinastatine en zijn doelwitten te waarborgen. De extracellulaire uitgescheiden eiwitdataset werd verkregen uit de Human Proteome Atlas, en hartchirurgie-gerelateerde doelwitten werden verkregen uit de GeneCards-database (Cardiac Surgical Procedures, n = 5.931). Potentiële doelwiteiwitten werden precies geïdentificeerd door de intersectie te nemen van postoperatieve pulmonale complicatie-gerelateerde doelwitten, hartchirurgie-gerelateerde doelwitten en de extracellulaire uitgescheiden eiwitdataset.

Constructie van Eiwit-Eiwit Interactienetwerk Gelijktijdig met functionele analyse werd een eiwit-eiwit interactie (PPI) netwerk geconstrueerd met behulp van de STRING-database, waarbij de analytische scope beperkt was tot de overlappende doelwitten geïdentificeerd in het Venndiagram. Om hoge betrouwbaarheid in de interacties te waarborgen, werd de soort gespecificeerd als Homo sapiens, en werd een strikte interactiescore-drempel (≥0,9) toegepast.

Identificatie van sleuteldoelwitgenen van ulinastatine Een systematische aanpak werd gebruikt om de belangrijkste moleculaire doelwitten van ulinastatine te identificeren: eerst werden de precieze naam en molecuulformule van de verbinding opgehaald uit de PubChem-database en geïmporteerd in het Swiss-Target Prediction-platform om potentiële doelwitmoleculen te voorspellen en op te halen. Vervolgens werd intersectie-analyse uitgevoerd om ulinastatinedoelwitmoleculen te integreren met de bovengenoemde co-expressie gen dataset, screenend voor moleculen die gelijktijdig voldoen aan de criteria van "gereguleerd door ulinastatine", "extracellulair uitgescheiden in relevante biologische contexten" en "co-gereguleerd". Een geninteractienetwerk werd vervolgens geconstrueerd met behulp van Friends' analyse voor verdere optimalisatie, waarbij het belang van elk gen werd geëvalueerd op basis van netwerktopologische metrieken zoals connectiviteit en centraliteit. Ten slotte werden de belangrijkste knooppuntgenen die de potentiële biologische effecten van ulinastatine mediëren geïdentificeerd.

Moleculaire Docking en Dynamica Simulaties De driedimensionale structuur van de kleine molecuul ligand ulinastatine werd opgehaald uit de PubChem-database (PubChem CID: 105102), terwijl de eiwit MMP3-structuur (PDB ID: 4g9l) werd verkregen uit de RCSB PDB-database. Voorkeur werd gegeven aan de humane eiwitconformatie met de hoogste structurele nauwkeurigheid voor vervolganalyses. Pre-docking voorbewerking van het doelwiteiwit werd uitgevoerd met behulp van PyMOL-software: eerst werden redundante watermoleculen en endogene liganden verwijderd uit de structuur om interferentie van niet-specifieke interacties te elimineren; vervolgens werden waterstofatomen toegevoegd aan de eiwitbackbone en zijketens om de volledigheid van de protonatietoestand op de bindingsplaats te waarborgen, waardoor de nauwkeurigheid van dockingberekeningen werd verbeterd. Moleculaire docking-simulaties werden uitgevoerd met behulp van het CB-Dock2 online platform (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/index.php). Na docking werd LIGPLOT-software gebruikt om eiwit-ligand interactieschema's te genereren, die visueel belangrijke bindingsresiduen en intermoleculaire krachten illustreren (inclusief waterstofbruggen, hydrofobe interacties en van der Waals-krachten). Dit proces verduidelijkt de specifieke bindingsmodus tussen de ligand en het doelwiteiwit.

Stap III: Validatie in klinische monsters Ontwerp en proefpersonen van klinische validatiecohortstudie Dit is een prospectieve observationele studie. Plasmonsters van de klinische validatiecohort werden verzameld van volwassen patiënten die een electieve hartoperatie ondergingen tussen april 2023 en september 2024, inclusief openhartklepreparatie, cardiopulmonale bypass-ondersteunde klepvervanging en off-pump coronairarterie-bypass-transplantatie. Pas dezelfde uitsluitingscriteria toe als gebruikt in het eerste deel van deze studie. De primaire uitkomst van deze studie is het optreden van postoperatieve pulmonale complicaties binnen 7 dagen postoperatief of vóór ontslag.

Steekproefomvang De minimale steekproefomvang werd berekend op basis van de incidentiecijfers van postoperatieve pulmonale complicaties in de ulinastatine- en non-ulinastatinegroepen. Zoals afgeleid uit het eerste deel van de studie, waren de incidentiecijfers van postoperatieve pulmonale complicaties 22,8% in de ulinastatinegroep en 2,7% in de non-ulinastatinegroep. Steekproefomvangberekening werd uitgevoerd met behulp van PASS-software met parameters ingesteld als volgt: significantieniveau (α) = 0,05 en statistische power (1-β) = 0,80. De steekproefomvang bestond initieel uit 168 gevallen, met een extra 15% uitvalpercentage inbegrepen, wat leidde tot een minimaal vereiste steekproefomvang van 193 gevallen.

Bloedmonster Verzameling en Testen Veneuze bloedmonsters werden verzameld van patiënten op drie vooraf bepaalde perioperatieve tijdstippen: (1) preoperatief (vóór chirurgische incisie); (2) direct postoperatief (bij opname op de intensive care); en (3) 24 uur postoperatief. Monsterverwerkingsprocedure: Bloed werd verzameld in EDTA-antistollingsbuizen, voorzichtig omgekeerd voor mengen, en getransporteerd op ijs. Plasma werd gescheiden via snelle centrifugatie onder de volgende condities: [3000 × g, 4℃, 10 min]. Gealiquoteerde plasmamonsters werden onmiddellijk opgeslagen bij -80°C in een toegewijde biobank voor latere batch-testing. Gekwantificeerd met behulp van een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) met kit HM10736 (Bio-swamp Company, Wuhan, China), strikt volgens de protocollen van de fabrikant.

Statistische Methoden De Shapiro-Wilk-test werd gebruikt om de normaliteit van continue variabelen te evalueren. Normaal verdeelde variabelen werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (x̄ ± s), met tussen-groep vergelijkingen uitgevoerd met behulp van one-way variantieanalyse (ANOVA). Als de Levene-test ongelijke varianties aangaf, werd Welch's ANOVA toegepast in plaats daarvan. Scheef verdeelde continue variabelen werden gepresenteerd als mediaan (interkwartielbereik) [M (P25, P75)], en intergroepvergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van de Kruskal-Wallis-test. Categorische variabelen werden uitgedrukt als aantallen (percentages) [n (%)], met tussen-groep vergelijkingen met behulp van de chi-kwadraat-test of Fisher's exacte test, afhankelijk van steekproefomvang en verwachte frequentieverdeling.

Aangezien postoperatieve pulmonale complicaties voornamelijk optreden binnen 7 dagen postoperatief en alle patiënten werden gevolgd tot ontslag, werd logistische regressie gebruikt. Multivariate logistische regressiemodellen werden gebruikt om de associatie tussen veranderingen in plasma MMP3-concentratie en klinische uitkomsten te onderzoeken. Vooraf gedefinieerde covariabelen, geselecteerd op basis van klinische relevantie en eerdere literatuur, werden opgenomen in de modellen voor aanpassing. Resultaten werden gerapporteerd als odds ratio's (OR) met 95% betrouwbaarheidsintervallen (95% BI), wat de sterkte van associatie en statistische precisie weerspiegelt. Een tweezijdige P < 0,05 werd ingesteld als de drempel voor statistische significantie.

Interactietermen werden opgenomen in de logistische regressiemodellen om de modificerende effecten van factoren zoals geslacht en comorbiditeiten op de primaire associatie te onderzoeken. De likelihood ratio-test werd gebruikt om modellen met en zonder interactietermen te vergelijken, en interactie P-waarden werden berekend om de statistische significantie van deze effecten te beoordelen. Verdere subgroepanalyses werden uitgevoerd op basis van de bovengenoemde factoren om differentiële associatie-effecten over subgroepen te identificeren.