L'Ulinastatina riduce le complicanze polmonari postoperatorie nella chirurgia cardiaca

Fase Ⅰ: Studio di coorte retrospettivo su Ulinastatina intraoperatoria e rischio di PPC Questa parte dello studio è progettata come un'indagine osservazionale retrospettiva e multicentrica, che include pazienti adulti sottoposti a chirurgia cardiaca elettiva in tre centri medici - nello specifico l'Ospedale Tongji Guanggu, l'Ospedale Tongji Zhongfa e l'Ospedale Tongji Hankou, tutti situati a Wuhan, in Cina - tra gennaio 2014 e dicembre 2022. A causa del disegno retrospettivo dello studio, la dimensione del campione era predeterminata[14].

Partecipanti Pazienti adulti sottoposti a chirurgia cardiaca elettiva, inclusa riparazione valvolare a cuore aperto, sostituzione valvolare con bypass cardiopolmonare e bypass coronarico a cuore battente, sono stati sottoposti a screening consecutivo per l'idoneità. I criteri di esclusione erano i seguenti: (1) età < 18 anni; (2) donne in gravidanza; (3) anamnesi di precedente chirurgia cardiaca prima del ricovero attuale; (4) presenza di malattie respiratorie acute prima dell'intervento, come infezioni delle vie respiratorie, insufficienza respiratoria, versamento pleurico, atelettasia, pneumotorace, broncospasmo e polmonite; (5) somministrazione di terapia con ulinastatina prima della chirurgia cardiaca durante il ricovero attuale; (6) Il farmaco ulinastatina è stato utilizzato durante l'intervento, con una dose intraoperatoria totale inferiore a 50.000 U; (7) anamnesi di neoplasia maligna o trapianto di midollo osseo.

Variabili L'esposizione primaria era la somministrazione intraoperatoria di ulinastatina, definita da: (1) dosaggio: dose intraoperatoria totale (≥50.000 U); (2) tempistica: prima somministrazione all'induzione dell'anestesia vs durante il bypass cardiopolmonare; (3) via: fleboclisi.

Le caratteristiche demografiche includevano età, genere e stato di fumo, tutti accertati al momento del ricovero. Le comorbidità cliniche sono state documentate sulla base delle diagnosi cliniche nelle cartelle cliniche, inclusi ipertensione, diabete, malattie polmonari croniche (broncopneumopatia cronica ostruttiva, asma, bronchite cronica, bronchiectasie) e insufficienza renale cronica. Gli indicatori di laboratorio preoperatori per i pazienti consistevano nei risultati degli esami ematici venosi ottenuti entro 24 ore dal ricovero, inclusi conta dei globuli bianchi e concentrazione di emoglobina.

Sulla base della letteratura precedente e della plausibilità biologica, i fattori confondenti misurati includevano variabili note o ipotizzate influenzare il rischio di PPC. Queste covariate comprendevano età, genere, indice di massa corporea (BMI), livello di emoglobina preoperatorio, conta dei globuli bianchi preoperatoria, pressione arteriosa preoperatoria e comorbidità. Tutte le covariate erano pre-specificate e incorporate in un modello di aggiustamento multivariato per affrontare gli squilibri basali e mitigare il bias di confondimento nella valutazione degli esiti clinici.

Esiti L'esito primario era lo sviluppo di PPC entro 7 giorni postoperatori o prima della dimissione ospedaliera. I criteri diagnostici per le PPC erano basati sulle definizioni delineate nelle definizioni degli Esiti Clinici Perioperatori Europei, pubblicate congiuntamente dalla Società Europea di Anestesiologia e dalla Società Europea di Medicina Intensiva nel 2015. Nel presente studio, le PPC includevano infezioni delle vie respiratorie, insufficienza respiratoria, versamento pleurico, atelettasia, broncospasmo e polmonite ab ingestis. Da notare che, poiché la toracotomia è un componente standard della chirurgia cardiaca e lo pneumotorace postoperatorio è quindi una sequela procedurale comune, lo pneumotorace postoperatorio è stato escluso dalla definizione di PPC in questo studio.

Gli esiti secondari includevano delirium postoperatorio e mortalità per tutte le cause in ospedale. Per la diagnosi di delirium postoperatorio, sono stati applicati due criteri: (1) una diagnosi documentata di delirium postoperatorio era considerata confermata e accettata come valida; (2) in assenza di una diagnosi iniziale di delirium postoperatorio, gli estrattori di dati hanno rivisto retrospettivamente le cartelle cliniche per segni di delirium. I criteri per la diagnosi retrospettiva di delirium postoperatorio erano allineati con i criteri diagnostici supplementari adattati dal Manuale Diagnostico e Statistico dei Disturbi Mentali, 5° Edizione (DSM-5) per il delirium[7]. La mortalità per tutte le cause in ospedale è stata definita come morte in ospedale per qualsiasi causa successiva all'intervento.

Bias Multiple strategie sono state implementate durante lo studio per mitigare potenziali bias. L'estrazione dei dati clinici è stata eseguita indipendentemente da due ricercatori formati in accordo con un protocollo standardizzato, utilizzando informazioni recuperate dalle cartelle cliniche elettroniche. Le discrepanze sono state risolte da un terzo revisore senior per garantire la coerenza e l'accuratezza dei dati. Gli esiti clinici sono stati accertati da un team di ricerca clinica indipendente in cieco rispetto ai dati di esposizione, riducendo ulteriormente il bias di informazione. Variabili confondenti predefinite, identificate sulla base della plausibilità biologica e di evidenze precedenti, sono state incorporate in modelli multivariati per controllare il bias di confondimento.

Fase Ⅱ: Predizione basata su Farmacologia di Rete e Simulazioni di Docking Molecolare Per investigare i meccanismi molecolari alla base della riduzione delle PPC da parte dell'ulinastatina in pazienti di chirurgia cardiaca, questa parte adotta un approccio integrato che combina farmacologia di rete e docking molecolare.

Raccolta e Standardizzazione dei Target di Malattia

Questi target comprendevano sei condizioni cliniche chiave correlate alle PPC, con rispettivi conteggi di target come segue: Infezioni delle vie respiratorie (n = 14.411); Polmonite ab ingestis (n = 4.033); Atelettasia polmonare (n = 1.107); Versamento pleurico (n = 2.282); Broncospasmo (n = 7.293); e Insufficienza respiratoria (n = 12.467). Per garantire la coerenza nei nomi dei target, tutti i nomi dei geni target sono stati standardizzati utilizzando il database UniProt. Scremando i geni sovrapposti nei suddetti dataset, sono stati identificati geni co-espressi, che sono stati considerati mediatori molecolari che collegano l'ulinastatina a potenziali meccanismi fisiopatologici delle PPC.

Analisi di arricchimento funzionale Per chiarire le funzioni biologiche dei geni co-espressi e la loro partecipazione in cascate di segnalazione, l'analisi di arricchimento Gene Ontology (GO) e l'analisi del pathway Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) sono state eseguite in parallelo[17, 18]. Una soglia statistica di P-value corretto < 0,05 è stata applicata per garantire la robustezza e la rilevanza funzionale dei risultati di arricchimento.

Localizzazione delle proteine target potenziali Le proteine secrete extracellulari sono state selezionate perché l'ulinastatina, come inibitore delle proteasi ad ampio spettro, esercita i suoi effetti biologici principalmente nello spazio extracellulare; pertanto, solo i target extracellulari sono stati considerati per garantire la plausibilità biologica tra ulinastatina e i suoi target. Il dataset delle proteine secrete extracellulari è stato ottenuto dall'Human Proteome Atlas, e i target correlati alla chirurgia cardiaca sono stati ottenuti dal database GeneCards (Procedure Chirurgiche Cardiache, n = 5.931). Le proteine target potenziali sono state identificate precisamente prendendo l'intersezione dei target correlati alle complicanze polmonari postoperatorie, dei target correlati alla chirurgia cardiaca e del dataset delle proteine secrete extracellulari.

Costruzione della Rete di Interazione Proteina-Proteina Contemporaneamente all'analisi funzionale, è stata costruita una rete di interazione proteina-proteina (PPI) utilizzando il database STRING, con l'ambito analitico limitato ai target sovrapposti identificati nel diagramma di Venn. Per garantire un'elevata confidenza nelle interazioni, la specie è stata specificata come Homo sapiens, ed è stata applicata una soglia stringente del punteggio di interazione (≥0,9).

Identificazione dei geni target chiave dell'ulinastatina È stato impiegato un approccio sistematico per identificare i target molecolari chiave dell'ulinastatina: primo, il nome preciso e la formula molecolare del composto sono stati recuperati dal database PubChem e importati nella piattaforma Swiss-Target Prediction per predire e recuperare le molecole target potenziali. Successivamente, è stata eseguita un'analisi di intersezione per integrare le molecole target dell'ulinastatina con il suddetto dataset di geni co-espressi, scremando per molecole che soddisfano simultaneamente i criteri di "regolate da ulinastatina", "secrete extracellularmente in contesti biologici rilevanti" e "co-espresse". È stata quindi costruita una rete di interazione genica utilizzando l'analisi Friends per un'ulteriore ottimizzazione, con l'importanza di ciascun gene valutata in base a metriche topologiche di rete come connettività e centralità. Infine, sono stati identificati i geni nodo chiave che mediano i potenziali effetti biologici dell'ulinastatina.

Simulazioni di Docking Molecolare e Dinamiche La struttura tridimensionale del ligando a piccola molecola ulinastatina è stata recuperata dal database PubChem (PubChem CID: 105102), mentre la struttura della proteina MMP3 (PDB ID: 4g9l) è stata ottenuta dal database RCSB PDB. È stata data preferenza alla conformazione proteica umana con la massima accuratezza strutturale per le analisi successive. La pre-elaborazione pre-docking della proteina target è stata eseguita utilizzando il software PyMOL: primo, le molecole d'acqua ridondanti e i ligandi endogeni sono stati rimossi dalla struttura per eliminare l'interferenza da interazioni aspecifiche; successivamente, gli atomi di idrogeno sono stati aggiunti allo scheletro proteico e alle catene laterali per garantire la completezza dello stato di protonazione nel sito di legame, migliorando così l'accuratezza dei calcoli di docking. Le simulazioni di docking molecolare sono state condotte utilizzando la piattaforma online CB-Dock2 (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/index.php). Dopo il docking, il software LIGPLOT è stato utilizzato per generare schemi di interazione proteina-ligando, che illustrano visivamente i residui di legame chiave e le forze intermolecolari (inclusi legami idrogeno, interazioni idrofobiche e forze di van der Waals). Questo processo chiarisce la modalità di legame specifica tra il ligando e la proteina target.

Fase III: Validazione in campioni clinici Disegno dello studio di coorte di validazione clinica e soggetti Questo è uno studio osservazionale prospettico. I campioni di plasma dalla coorte di validazione clinica sono stati raccolti da pazienti adulti sottoposti a chirurgia cardiaca elettiva tra aprile 2023 e settembre 2024, inclusa riparazione valvolare a cuore aperto, sostituzione valvolare assistita da bypass cardiopolmonare e bypass coronarico a cuore battente. Applicare gli stessi criteri di esclusione utilizzati nella prima parte di questo studio. L'esito primario di questo studio è l'occorrenza di PPC entro 7 giorni postoperatori o prima della dimissione.

Dimensione del Campione La dimensione minima del campione è stata calcolata sulla base dei tassi di incidenza delle PPC nei gruppi con ulinastatina e senza ulinastatina. Come derivato dalla prima parte dello studio, i tassi di incidenza delle PPC erano del 22,8% nel gruppo ulinastatina e del 2,7% nel gruppo senza ulinastatina. Il calcolo della dimensione del campione è stato eseguito utilizzando il software PASS con parametri impostati come segue: livello di significatività (α) = 0,05 e potenza statistica (1-β) = 0,80. La dimensione del campione inizialmente consisteva di 168 casi, con un ulteriore tasso di abbandono del 15% considerato, portando a una dimensione minima richiesta del campione di 193 casi.

Raccolta e Test dei Campioni Ematici I campioni di sangue venoso sono stati raccolti dai pazienti in tre punti temporali perioperatori predefiniti: (1) preoperatorio (prima dell'incisione chirurgica); (2) immediatamente postoperatorio (al momento del ricovero in unità di terapia intensiva); e (3) 24 ore postoperatorie. Procedura di elaborazione del campione: Il sangue è stato raccolto in tubi anticoagulanti EDTA, delicatamente invertito per la miscelazione e trasportato su ghiaccio. Il plasma è stato separato mediante centrifugazione rapida nelle seguenti condizioni: [3000 × g, 4℃, 10 min]. I campioni di plasma aliquottati sono stati immediatamente conservati a -80°C in una biobanca dedicata per test successivi in batch. Quantificato utilizzando un saggio immunoassorbente legato all'enzima (ELISA) con kit HM10736 (Bio-swamp Company, Wuhan, Cina), seguendo rigorosamente i protocolli del produttore.

Metodi Statistici Il test di Shapiro-Wilk è stato utilizzato per valutare la normalità delle variabili continue. Le variabili distribuite normalmente sono state espresse come media ± deviazione standard (x̄ ± s), con confronti tra gruppi eseguiti utilizzando l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA). Se il test di Levene indicava variazioni disuguali, veniva applicata l'ANOVA di Welch. Le variabili continue asimmetriche sono state presentate come mediana (intervallo interquartile) [M (P25, P75)], e i confronti intergruppo sono stati condotti utilizzando il test di Kruskal-Wallis. Le variabili categoriche sono state espresse come conteggi (percentuali) [n (%)], con confronti tra gruppi utilizzando il test del chi-quadrato o il test esatto di Fisher, a seconda della dimensione del campione e della distribuzione di frequenza attesa.

Poiché le PPC si verificano prevalentemente entro 7 giorni postoperatori e tutti i pazienti sono stati seguiti fino alla dimissione, è stata impiegata la regressione logistica. Modelli di regressione logistica multivariata sono stati impiegati per esaminare l'associazione tra cambiamenti nella concentrazione plasmatica di MMP3 e gli esiti clinici. Covariate predefinite, selezionate in base alla rilevanza clinica e alla letteratura precedente, sono state incluse nei modelli per l'aggiustamento. I risultati sono stati riportati come odds ratio (OR) con intervalli di confidenza al 95% (95% CI), riflettendo la forza dell'associazione e la precisione statistica. Un P a due code < 0,05 è stato impostato come soglia per la significatività statistica.

Termini di interazione sono stati incorporati nei modelli di regressione logistica per esplorare gli effetti modificatori di fattori come sesso e comorbidità sull'associazione primaria. Il test del rapporto di verosimiglianza è stato utilizzato per confrontare modelli con e senza termini di interazione, e i P-value di interazione sono stati calcolati per valutare la significatività statistica di questi effetti. Ulteriori analisi di sottogruppo sono state eseguite in base ai suddetti fattori per identificare effetti di associazione differenziali tra i sottogruppi.