울리나스타틴은 심장 수술 후 폐 합병증을 감소시킵니다

단계 Ⅰ: 수술 중 울리나스타틴과 PPCs 위험에 대한 후향적 코호트 연구 이 연구 단계는 후향적, 다기관 관찰 연구로 설계되었으며, 2014년 1월부터 2022년 12월까지 중국 우한에 위치한 3개 의료기관(통지 광구 병원, 통지 중파 병원, 통지 한커우 병원)에서 선택적 심장 수술을 받은 성인 환자를 포함합니다. 연구의 후향적 설계로 인해 표본 크기는 사전에 결정되었습니다[14].

참가자 개심판막 수리, 체외순환을 이용한 판막 치환술, 무체외순환 관상동맥우회로이식술을 포함한 선택적 심장 수술을 받는 성인 환자를 연속적으로 선별하여 자격을 평가했습니다. 제외 기준은 다음과 같습니다: (1) 연령 < 18세; (2) 임산부; (3) 현재 입원 전 심장 수술 이력; (4) 수술 전 급성 호흡기 질환(호흡기 감염, 호흡 부전, 흉수, 무기폐, 기흉, 기관지경련, 폐렴 등) 존재; (5) 현재 입원 중 심장 수술 전 울리나스타틴 치료 투여; (6) 수술 중 울리나스타틴 사용, 총 수술 중 투여 용량이 50,000 U 미만; (7) 악성 종양 또는 골수 이식 이력.

변수 주요 노출 변수는 수술 중 울리나스타틴 투여로, 다음과 같이 정의되었습니다: (1) 용량: 총 수술 중 투여 용량(≥50,000 U); (2) 시기: 마취 유도 시 첫 투여 vs 체외순환 중 투여; (3) 경로: 정주 점적.

인구통계학적 특성으로는 연령, 성별, 흡연 상태가 포함되었으며, 모두 입원 시 확인되었습니다. 임상 동반질환은 의무기록의 임상 진단을 기반으로 문서화되었으며, 고혈압, 당뇨병, 만성 폐질환(만성 폐쇄성 폐질환, 천식, 만성 기관지염, 기관지확장증), 만성 신부전이 포함되었습니다. 환자의 수술 전 실험실 지표는 입원 24시간 이내에 채취한 정맥혈 검사 결과로, 백혈구 수와 헤모글로빈 농도를 포함했습니다.

선행 문헌과 생물학적 타당성을 바탕으로 측정된 교란 변수에는 PPCs 위험에 영향을 미치는 것으로 알려졌거나 가설화된 변수들이 포함되었습니다. 이 공변량들은 연령, 성별, 체질량지수(BMI), 수술 전 헤모글로빈 수치, 수술 전 백혈구 수, 수술 전 혈압, 동반질환을 포함했습니다. 모든 공변량은 사전에 지정되었으며, 다변량 조정 모델에 통합되어 기저 불균형을 해결하고 임상 결과 평가에서 교란 편향을 완화했습니다.

결과 주요 결과는 수술 후 7일 이내 또는 퇴원 전 PPCs 발생이었습니다. PPCs의 진단 기준은 2015년 유럽 마취학회와 유럽 중환자의학회가 공동으로 발표한 유럽 수술기 임상결과 정의에 명시된 정의를 기반으로 했습니다. 본 연구에서 PPCs는 호흡기 감염, 호흡 부전, 흉수, 무기폐, 기관지경련, 흡인성 폐렴을 포함했습니다. 특히, 흉부 절개가 심장 수술의 표준 구성 요소이며 수술 후 기흉이 일반적인 수술적 후유증이므로, 본 연구에서는 수술 후 기흉을 PPCs 정의에서 제외했습니다.

2차 결과는 수술 후 섬망과 재원 중 전원인 사망이었습니다. 수술 후 섬망 진단을 위해 두 가지 기준이 적용되었습니다: (1) 문서화된 수술 후 섬망 진단은 확인된 것으로 간주되고 유효하게 수용됨; (2) 초기 수술 후 섬망 진단이 없는 경우, 데이터 추출자가 임상 기록을 후향적으로 검토하여 섬망 징후를 확인했습니다. 후향적 수술 후 섬망 진단 기준은 정신질환 진단 및 통계 편람 제5판(DSM-5)의 적응된 보충 진단 기준과 일치하도록 조정되었습니다[7]. 재원 중 전원인 사망은 수술 후 어떤 원인으로든 병원 내에서 사망한 것으로 정의되었습니다.

편향 연구 전반에 걸쳐 잠재적 편향을 완화하기 위해 여러 전략이 시행되었습니다. 임상 데이터 추출은 표준화된 프로토콜에 따라 훈련된 두 명의 연구원이 전자의무기록에서 검색된 정보를 활용하여 독립적으로 수행되었습니다. 불일치는 제3의 선임 검토자가 중재하여 데이터 일관성과 정확성을 보장했습니다. 임상 결과는 노출 데이터에 대해 맹검 처리된 독립적인 임상 연구팀에 의해 확인되어 정보 편향을 추가로 감소시켰습니다. 생물학적 타당성과 선행 증거를 바탕으로 확인된 사전 정의된 교란 변수들은 다변량 모델에 통합되어 교란 편향을 통제했습니다.

단계 Ⅱ: 네트워크 약리학 기반 예측 및 분자 도킹 시뮬레이션 심장 수술 환자에서 울리나스타틴의 PPCs 감소 분자 기전을 조사하기 위해, 이 단계는 네트워크 약리학과 분자 도킹을 결합한 통합적 접근법을 채택합니다.

질병 표적 수집 및 표준화

이 표적들은 6가지 주요 PPCs 관련 임상 상태를 포함하며, 각각의 표적 수는 다음과 같습니다: 호흡기 감염(n = 14,411); 흡인성 폐렴(n = 4,033); 폐 무기폐(n = 1,107); 흉수(n = 2,282); 기관지 경련(n = 7,293); 호흡 부전(n = 12,467). 표적 이름의 일관성을 보장하기 위해 모든 표적 유전자 이름은 UniProt 데이터베이스를 사용하여 표준화되었습니다. 앞서 언급한 데이터셋에서 중복 유전자를 선별함으로써 공발현 유전자가 확인되었으며, 이는 울리나스타틴과 PPCs의 잠재적 병태생리학적 기전을 연결하는 분자 매개체로 간주되었습니다.

기능 풍부성 분석 공발현 유전자의 생물학적 기능과 신호 전달 연쇄 반응 참여를 명확히 하기 위해, Gene Ontology(GO) 풍부성 분석과 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG) 경로 분석이 병행 수행되었습니다[17, 18]. 풍부성 결과의 강건성과 기능적 관련성을 보장하기 위해 조정된 P값 < 0.05의 통계적 임계값이 적용되었습니다.

잠재적 표적 단백질 위치 세포 외 분비 단백질이 선택되었는데, 이는 울리나스타틴이 광범위 스펙트럼 프로테아제 억제제로서 주로 세포 외 공간에서 생물학적 효과를 발휘하기 때문입니다. 따라서 울리나스타틴과 그 표적 간의 생물학적 타당성을 보장하기 위해 세포 외 표적만 고려되었습니다. 세포 외 분비 단백질 데이터셋은 Human Proteome Atlas에서 얻었으며, 심장 수술 관련 표적은 GeneCards 데이터베이스(심장 수술 절차, n = 5,931)에서 얻었습니다. 잠재적 표적 단백질은 수술 후 폐합병증 관련 표적, 심장 수술 관련 표적, 세포 외 분비 단백질 데이터셋의 교집합을 취하여 정확하게 확인되었습니다.

단백질-단백질 상호작용 네트워크 구축 기능 분석과 동시에, STRING 데이터베이스를 사용하여 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크가 구축되었으며, 분석 범위는 벤 다이어그램에서 확인된 중복 표적으로 제한되었습니다. 상호작용에 대한 높은 신뢰도를 보장하기 위해 종은 Homo sapiens로 지정되었으며, 엄격한 상호작용 점수 임계값(≥0.9)이 적용되었습니다.

울리나스타틴의 주요 표적 유전자 확인 울리나스타틴의 주요 분자 표적을 확인하기 위해 체계적인 접근법이 사용되었습니다: 먼저, 화합물의 정확한 이름과 분자식을 PubChem 데이터베이스에서 검색하여 Swiss-Target Prediction 플랫폼으로 가져와 잠재적 표적 분자를 예측하고 검색했습니다. 이후, 울리나스타틴 표적 분자와 앞서 언급한 공발현 유전자 데이터셋을 통합하기 위해 교집합 분석을 수행하여, "울리나스타틴에 의해 조절됨", "관련 생물학적 맥락에서 세포 외로 분비됨", "공발현됨" 기준을 동시에 충족하는 분자를 선별했습니다. 그런 다음 Friends' 분석을 사용하여 유전자 상호작용 네트워크를 구축하여 추가 최적화를 수행했으며, 각 유전자의 중요성은 연결성 및 중심성과 같은 네트워크 위상 측정 기준을 기반으로 평가되었습니다. 마지막으로, 울리나스타틴의 잠재적 생물학적 효과를 매개하는 주요 노드 유전자들이 확인되었습니다.

분자 도킹 및 동역학 시뮬레이션 저분자 리간드 울리나스타틴의 3차원 구조는 PubChem 데이터베이스(PubChem CID: 105102)에서 검색되었으며, 단백질 MMP3 구조(PDB ID: 4g9l)는 RCSB PDB 데이터베이스에서 얻었습니다. 후속 분석을 위해 구조적 정확도가 가장 높은 인간 단백질 형태가 선호되었습니다. 표적 단백질의 도킹 전 전처리는 PyMOL 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다: 먼저, 비특이적 상호작용의 간섭을 제거하기 위해 구조에서 중복된 물 분자와 내인성 리간드를 제거했습니다. 이후, 결합 부위의 양성자화 상태 완전성을 보장하고 도킹 계산의 정확성을 향상시키기 위해 단백질 주사슬과 측사슬에 수소 원자를 추가했습니다. 분자 도킹 시뮬레이션은 CB-Dock2 온라인 플랫폼(https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/index.php)을 사용하여 수행되었습니다. 도킹 후, LIGPLOT 소프트웨어를 활용하여 단백질-리간드 상호작용 개략도를 생성했으며, 이는 주요 결합 잔기와 분자 간 힘(수소 결합, 소수성 상호작용, 판데르발스 힘 포함)을 시각적으로 설명합니다. 이 과정은 리간드와 표적 단백질 간의 특정 결합 모드를 명확히 합니다.

단계 Ⅲ: 임상 표본에서의 검증 임상 검증 코호트 연구 설계 및 대상 이는 전향적 관찰 연구입니다. 임상 검증 코호트의 혈장 샘플은 2023년 4월부터 2024년 9월 사이에 선택적 심장 수술(개심판막 수리, 체외순환 보조 판막 치환술, 무체외순환 관상동맥우회로이식술 포함)을 받은 성인 환자로부터 채취되었습니다. 본 연구의 첫 번째 부분에서 사용된 것과 동일한 제외 기준을 적용합니다. 이 연구의 주요 결과는 수술 후 7일 이내 또는 퇴원 전 PPCs 발생입니다.

표본 크기 최소 표본 크기는 울리나스타틴 군과 비-울리나스타틴 군의 PPCs 발병률을 기반으로 계산되었습니다. 연구의 첫 번째 부분에서 도출된 바와 같이, PPCs 발병률은 울리나스타틴 군에서 22.8%, 비-울리나스타틴 군에서 2.7%였습니다. 표본 크기 계산은 PASS 소프트웨어를 사용하여 수행되었으며, 매개변수는 유의 수준(α) = 0.05, 통계적 검정력(1-β) = 0.80으로 설정되었습니다. 표본 크기는 초기에 168건으로 구성되었으며, 추가 15%의 탈락률을 고려하여 최소 필요 표본 크기는 193건이었습니다.

혈액 샘플 채취 및 검사 정맥혈 샘플은 환자로부터 사전에 정의된 세 가지 수술 주기 시간점에서 채취되었습니다: (1) 수술 전(수술 절개 전); (2) 수술 직후(중환자실 입실 시); (3) 수술 후 24시간. 샘플 처리 절차: 혈액은 EDTA 항응고관에 채취되어 부드럽게 뒤집어 혼합한 후 얼음 위에서 운반되었습니다. 혈장은 다음과 같은 조건에서 급속 원심분리로 분리되었습니다: [3000 × g, 4℃, 10분]. 알리쿼트 처리된 혈장 샘플은 이후 일괄 검사를 위해 전용 바이오뱅크에서 -80°C에 즉시 보관되었습니다. 제조사의 프로토콜을 엄격히 따라 키트 HM10736(Bio-swamp Company, Wuhan, China)을 사용한 효소연결면역흡착분석법(ELISA)으로 정량 분석되었습니다.

통계 방법 Shapiro-Wilk 검정은 연속 변수의 정규성을 평가하는 데 사용되었습니다. 정규 분포를 따르는 변수는 평균 ± 표준 편차(x̄ ± s)로 표현되었으며, 군간 비교는 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 수행되었습니다. Levene 검정이 분산 불등을 나타낸 경우, Welch의 ANOVA가 대신 적용되었습니다. 왜곡된 연속 변수는 중앙값(사분위 범위) [M (P25, P75)]로 제시되었으며, 군간 비교는 Kruskal-Wallis 검정을 사용하여 수행되었습니다. 범주형 변수는 빈도(백분율) [n (%)]로 표현되었으며, 군간 비교는 표본 크기와 기대 빈도 분포에 따라 카이제곱 검정 또는 Fisher의 정확 검정을 사용했습니다.

PPCs가 주로 수술 후 7일 이내에 발생하며 모든 환자가 퇴원 시까지 추적 관찰되었기 때문에, 로지스틱 회귀 분석이 사용되었습니다. 다변량 로지스틱 회귀 모델은 혈장 MMP3 농도 변화와 임상 결과 간의 연관성을 조사하는 데 사용되었습니다. 임상적 관련성과 선행 문헌을 바탕으로 선택된 사전 정의된 공변량들이 모델에 포함되어 조정되었습니다. 결과는 교차비(OR)와 95% 신뢰 구간(95% CI)으로 보고되어 연관성의 강도와 통계적 정밀도를 반영했습니다. 양측 P < 0.05가 통계적 유의성 임계값으로 설정되었습니다.

주요 연관성에 대한 성별 및 동반질환과 같은 인자의 수정 효과를 탐색하기 위해 로지스틱 회귀 모델에 상호작용 항이 포함되었습니다. 상호작용 항이 포함된 모델과 포함되지 않은 모델을 비교하기 위해 가능도비 검정이 사용되었으며, 이러한 효과의 통계적 유의성을 평가하기 위해 상호작용 P-값이 계산되었습니다. 이러한 인자를 기반으로 추가 하위 그룹 분석이 수행되어 하위 그룹 간 차등 연관 효과를 확인했습니다.