A Ulinastatina Reduz as Complicações Pulmonares Pós-Operatórias em Cirurgia Cardíaca

Passo Ⅰ: Estudo de Coorte Retrospetiva da Ulinastatina Intraoperatória e Risco de CPPP Este segmento do estudo foi concebido como uma investigação observacional retrospetiva e multicêntrica, abrangendo doentes adultos submetidos a cirurgia cardíaca eletiva em três centros médios - especificamente o Hospital Tongji Guanggu, o Hospital Tongji Zhongfa e o Hospital Tongji Hankou, todos localizados em Wuhan, China - entre janeiro de 2014 e dezembro de 2022. Devido ao desenho retrospetivo do estudo, o tamanho da amostra foi pré-determinado[14].

Participantes Doentes adultos submetidos a cirurgia cardíaca eletiva, incluindo reparação valvular cardíaca aberta, substituição valvular com circulação extracorporal e cirurgia de revascularização miocárdica sem circulação extracorporal, foram rastreados consecutivamente para elegibilidade. Os critérios de exclusão foram os seguintes: (1) idade < 18 anos; (2) grávidas; (3) historial de cirurgia cardíaca prévia antes da hospitalização atual; (4) presença de doenças respiratórias agudas antes da cirurgia, tais como infeções do trato respiratório, insuficiência respiratória, derrame pleural, atelectasia, pneumotórax, broncoespasmo e pneumonia; (5) administração de terapia com ulinastatina antes da cirurgia cardíaca durante a hospitalização atual; (6) O fármaco ulinastatina foi utilizado durante a cirurgia, com uma dose intraoperatória total inferior a 50.000 U; (7) historial de neoplasia maligna ou transplante de medula óssea.

Variáveis A exposição principal foi a administração intraoperatória de ulinastatina, definida por: (1) dosagem: dose intraoperatória total (≥50.000 U); (2) momento: primeira administração na indução anestésica vs durante a circulação extracorporal; (3) via: perfusão intravenosa.

Características demográficas incluíram idade, género e estado de tabagismo, todas averiguadas na admissão. Comorbilidades clínicas foram documentadas com base em diagnósticos clínicos nos registos médicos, incluindo hipertensão, diabetes, doenças pulmonares crónicas (doença pulmonar obstrutiva crónica, asma, bronquite crónica, bronquiectasias) e insuficiência renal crónica. Indicadores laboratoriais pré-operatórios para os doentes consistiram em resultados de análises ao sangue venoso obtidos até 24 horas após a admissão, incluindo contagem de leucócitos e concentração de hemoglobina.

Com base em literatura prévia e plausibilidade biológica, os fatores de confusão medidos incluíram variáveis conhecidas ou hipotetizadas como influenciadoras do risco de CPPP. Estas covariáveis compreenderam idade, género, índice de massa corporal (IMC), nível de hemoglobina pré-operatório, contagem de leucócitos pré-operatória, pressão arterial pré-operatória e comorbilidades. Todas as covariáveis foram pré-especificadas e incorporadas num modelo de ajuste multivariado para abordar desequilíbrios basais e mitigar viés de confusão na avaliação dos resultados clínicos.

Resultados O resultado primário foi o desenvolvimento de CPPP dentro de 7 dias pós-operatórios ou antes da alta hospitalar. Os critérios de diagnóstico para CPPP basearam-se nas definições delineadas nas definições de Resultado Clínico Perioperatório Europeu, publicadas em conjunto pela Sociedade Europeia de Anestesiologia e pela Sociedade Europeia de Medicina Intensiva em 2015. No presente estudo, as CPPP incluíram infeções do trato respiratório, insuficiência respiratória, derrame pleural, atelectasia, broncoespasmo e pneumonia por aspiração. Notavelmente, dado que a toracotomia é um componente padrão da cirurgia cardíaca e o pneumotórax pós-operatório é, portanto, uma sequela procedural comum, o pneumotórax pós-operatório foi excluído da definição de CPPP neste estudo.

Resultados secundários incluíram delirium pós-operatório e mortalidade por todas as causas intra-hospitalar. Para o diagnóstico de delirium pós-operatório, aplicaram-se dois critérios: (1) um diagnóstico de delirium pós-operatório documentado foi considerado confirmado e aceite como válido; (2) na ausência de um diagnóstico inicial de delirium pós-operatório, os extratores de dados reviram retrospetivamente os registos clínicos para sinais de delirium. Os critérios para o diagnóstico retrospetivo de delirium pós-operatório foram alinhados com os critérios de diagnóstico suplementares adaptados do Manual de Diagnóstico e Estatística de Perturbações Mentais, 5ª Edição (DSM-5) para delirium[7]. A mortalidade por todas as causas intra-hospitalar foi definida como morte intra-hospitalar por qualquer causa após a cirurgia.

Viés Múltiplas estratégias foram implementadas ao longo do estudo para mitigar viés potencial. A extração de dados clínicos foi realizada independentemente por dois investigadores treinados de acordo com um protocolo padronizado, utilizando informação recuperada de registos médicos eletrónicos. Discrepâncias foram adjudicadas por um terceiro revisor sénior para garantir consistência e precisão dos dados. Os resultados clínicos foram averiguados por uma equipa de investigação clínica independente cega aos dados de exposição, reduzindo assim ainda mais o viés de informação. Variáveis de confusão pré-definidas, identificadas com base em plausibilidade biológica e evidência prévia, foram incorporadas em modelos multivariados para controlar o viés de confusão.

Passo Ⅱ: Predição Baseada em Farmacologia de Rede e Simulações de Acoplamento Molecular Para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à redução de CPPP pela ulinastatina em doentes de cirurgia cardíaca, este segmento adota uma abordagem integrada combinando farmacologia de rede e acoplamento molecular.

Recolha e Padronização de Alvos da Doença

Estes alvos englobaram seis condições clínicas-chave relacionadas com CPPP, com contagens de alvos respetivas conforme segue: Infeções do trato respiratório (n = 14.411); Pneumonia por aspiração (n = 4.033); Atelectasia pulmonar (n = 1.107); Derrame pleural (n = 2.282); Espasmo brônquico (n = 7.293); e Insuficiência respiratória (n = 12.467). Para garantir consistência nos nomes dos alvos, todos os nomes dos genes alvo foram padronizados utilizando a base de dados UniProt. Ao rastrear genes sobrepostos nos conjuntos de dados acima mencionados, foram identificados genes co-expressos, que foram considerados mediadores moleculares ligando a ulinastatina a potenciais mecanismos fisiopatológicos de CPPP.

Análise de enriquecimento funcional Para clarificar as funções biológicas dos genes co-expressos e a sua participação em cascatas de sinalização, a análise de enriquecimento da Ontologia Genética (GO) e a análise de vias da Enciclopédia de Genes e Genomas de Quioto (KEGG) foram realizadas em paralelo[17, 18]. Um limiar estatístico de valor de P ajustado < 0,05 foi aplicado para garantir a robustez e relevância funcional dos resultados de enriquecimento.

Localização de proteínas alvo potenciais Proteínas secretadas extracelulares foram selecionadas porque a ulinastatina, enquanto inibidor de protease de largo espetro, exerce os seus efeitos biológicos principalmente no espaço extracelular; assim, apenas alvos extracelulares foram considerados para garantir plausibilidade biológica entre a ulinastatina e os seus alvos. O conjunto de dados de proteínas secretadas extracelulares foi obtido do Atlas do Proteoma Humano, e os alvos relacionados com cirurgia cardíaca foram obtidos da base de dados GeneCards (Procedimentos Cirúrgicos Cardíacos, n = 5.931). As proteínas alvo potenciais foram identificadas com precisão através da interseção dos alvos relacionados com complicações pulmonares pós-operatórias, alvos relacionados com cirurgia cardíaca e o conjunto de dados de proteínas secretadas extracelulares.

Construção da Rede de Interação Proteína-Proteína Em simultâneo com a análise funcional, uma rede de interação proteína-proteína (PPI) foi construída utilizando a base de dados STRING, com o âmbito analítico restrito aos alvos sobrepostos identificados no diagrama de Venn. Para garantir alta confiança nas interações, a espécie foi especificada como Homo sapiens, e um limiar de pontuação de interação rigoroso (≥0,9) foi aplicado.

Identificação de genes alvo-chave da ulinastatina Uma abordagem sistemática foi empregue para identificar os alvos moleculares-chave da ulinastatina: primeiro, o nome preciso e a fórmula molecular do composto foram recuperados da base de dados PubChem e importados para a plataforma Swiss-Target Prediction para prever e recuperar moléculas alvo potenciais. Posteriormente, foi realizada uma análise de interseção para integrar as moléculas alvo da ulinastatina com o conjunto de dados de genes de co-expressão acima mencionado, rastreando moléculas que satisfazem simultaneamente os critérios de "reguladas pela ulinastatina", "secretadas extracelularmente em contextos biológicos relevantes" e "co-expressas". Uma rede de interação genética foi então construída utilizando a análise Friends para otimização posterior, com a importância de cada gene avaliada com base em métricas topológicas de rede, como conectividade e centralidade. Finalmente, os genes nodais-chave mediando os potenciais efeitos biológicos da ulinastatina foram identificados.

Simulações de Acoplamento Molecular e Dinâmica A estrutura tridimensional do ligando de pequena molécula ulinastatina foi recuperada da base de dados PubChem (PubChem CID: 105102), enquanto a estrutura da proteína MMP3 (ID PDB: 4g9l) foi obtida da base de dados RCSB PDB. Foi dada preferência à conformação proteica humana com a maior precisão estrutural para análises subsequentes. Pré-processamento pré-acoplamento da proteína alvo foi realizado utilizando o software PyMOL: primeiro, moléculas de água redundantes e ligantes endógenos foram removidos da estrutura para eliminar interferência de interações não específicas; subsequentemente, átomos de hidrogénio foram adicionados à cadeia principal e cadeias laterais da proteína para garantir a completude do estado de protonação no local de ligação, melhorando assim a precisão dos cálculos de acoplamento. Simulações de acoplamento molecular foram conduzidas utilizando a plataforma online CB-Dock2 (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/index.php). Após o acoplamento, o software LIGPLOT foi utilizado para gerar esquemas de interação proteína-ligando, que ilustram visualmente resíduos de ligação-chave e forças intermoleculares (incluindo ligações de hidrogénio, interações hidrofóbicas e forças de van der Waals). Este processo clarifica o modo de ligação específico entre o ligando e a proteína alvo.

Passo III: Validação em amostras clínicas Desenho do estudo de coorte de validação clínica e sujeitos Este é um estudo observacional prospetivo. Amostras de plasma da coorte de validação clínica foram recolhidas de doentes adultos submetidos a cirurgia cardíaca eletiva entre abril de 2023 e setembro de 2024, incluindo reparação valvular cardíaca aberta, substituição valvular assistida por circulação extracorporal e cirurgia de revascularização miocárdica sem circulação extracorporal. Aplicar os mesmos critérios de exclusão utilizados na primeira parte deste estudo. O resultado primário deste estudo é a ocorrência de CPPP dentro de 7 dias pós-operatórios ou antes da alta.

Tamanho da Amostra O tamanho mínimo da amostra foi calculado com base nas taxas de incidência de CPPP nos grupos com e sem ulinastatina. Conforme derivado da primeira parte do estudo, as taxas de incidência de CPPP foram de 22,8% no grupo com ulinastatina e 2,7% no grupo sem ulinastatina. O cálculo do tamanho da amostra foi realizado utilizando o software PASS com parâmetros definidos como segue: nível de significância (α) = 0,05 e poder estatístico (1-β) = 0,80. O tamanho da amostra consistiu inicialmente em 168 casos, com uma taxa de desistência adicional de 15% contabilizada, levando a um tamanho de amostra mínimo necessário de 193 casos.

Recolha e Testagem de Amostras de Sangue Amostras de sangue venoso foram recolhidas dos doentes em três momentos perioperatórios pré-definidos: (1) pré-operatório (antes da incisão cirúrgica); (2) imediatamente pós-operatório (na admissão à unidade de cuidados intensivos); e (3) 24 horas pós-operatórias. Procedimento de processamento de amostras: O sangue foi recolhido em tubos com anticoagulante EDTA, invertido suavemente para mistura e transportado no gelo. O plasma foi separado via centrifugação rápida nas seguintes condições: [3000 × g, 4℃, 10 min]. Alíquotas de amostras de plasma foram imediatamente armazenadas a -80°C num biobanco dedicado para teste posterior em lote. Quantificado utilizando um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) com o kit HM10736 (Bio-swamp Company, Wuhan, China), seguindo estritamente os protocolos do fabricante.

Métodos Estatísticos O teste de Shapiro-Wilk foi utilizado para avaliar a normalidade das variáveis contínuas. Variáveis distribuídas normalmente foram expressas como média ± desvio padrão (x̄ ± s), com comparações intergrupo realizadas utilizando análise de variância unidirecional (ANOVA). Se o teste de Levene indicou variâncias desiguais, a ANOVA de Welch foi aplicada em seu lugar. Variáveis contínuas assimétricas foram apresentadas como mediana (intervalo interquartil) [M (P25, P75)], e comparações intergrupo foram conduzidas utilizando o teste de Kruskal-Wallis. Variáveis categóricas foram expressas como contagens (percentagens) [n (%)], com comparações intergrupo utilizando o teste do qui-quadrado ou teste exato de Fisher, dependendo do tamanho da amostra e distribuição de frequência esperada.

Dado que as CPPP ocorrem predominantemente dentro de 7 dias pós-operatórios e todos os doentes foram acompanhados até à alta, foi empregue regressão logística. Modelos de regressão logística multivariada foram empregues para examinar a associação entre alterações na concentração plasmática de MMP3 e resultados clínicos. Covariáveis pré-definidas, selecionadas com base na relevância clínica e literatura prévia, foram incluídas nos modelos para ajuste. Os resultados foram reportados como razões de probabilidades (OR) com intervalos de confiança de 95% (IC 95%), refletindo a força da associação e precisão estatística. Um P bicaudal < 0,05 foi definido como o limiar para significância estatística.

Termos de interação foram incorporados nos modelos de regressão logística para explorar os efeitos modificadores de fatores como sexo e comorbilidades na associação primária. O teste da razão de verosimilhança foi utilizado para comparar modelos com e sem termos de interação, e valores de P de interação foram calculados para avaliar a significância estatística desses efeitos. Análises de subgrupo adicionais foram realizadas com base nos fatores acima mencionados para identificar efeitos de associação diferenciais entre subgrupos.