Az ulinastatin csökkenti a szívsebészeti műtétek utáni tüdőszövődmények kockázatát

1. lépés: Intraoperatív ulinasztatin és PPC-k kockázatának retrospektív kohorszvizsgálata A vizsgálat ezen szakasza retrospektív, multicentrikus megfigyeléses kutatásként készült, amely magában foglalja a felnőtt betegeket, akik választott szívműtéten estek át három egészségügyi központban – nevezetesen a Tongji Guanggu Kórházban, a Tongji Zhongfa Kórházban és a Tongji Hankou Kórházban, mindegyik Vuhanban, Kínában található – 2014 januárja és 2022 decembere között. A vizsgálat retrospektív jellege miatt a minta nagysága előre meghatározott volt[14].

Résztvevők A választott szívműtéten átesett felnőtt betegeket, beleértve a nyitott szívbillentyű-rekonstrukciót, a kardiopulmonális bypass segítségével végzett billentyűpótlást és a bypass nélküli koszorúér-bypass műtétet, folyamatosan szűrték a jogosultságra. A kizárási kritériumok a következők voltak: (1) életkor < 18 év; (2) terhes nők; (3) korábbi szívműtét előzménye a jelenlegi kórházi kezelés előtt; (4) akut légúti megbetegedések jelenléte a műtét előtt, mint például légúti fertőzések, légzési elégtelenség, mellkasi folyadékgyülem, atelektázis, tüdőbeszűrődés, bronchospasmus és tüdőgyulladás; (5) ulinasztatin kezelés alkalmazása a szívműtét előtt a jelenlegi kórházi kezelés során; (6) Az ulinasztatin gyógyszert a műtét során alkalmazták, a teljes intraoperatív dózis kevesebb mint 50 000 U volt; (7) rosszindulatú daganat vagy csontvelő-átültetés előzménye.

Változók A fő expozíció az intraoperatív ulinasztatin adás volt, amelyet a következők határoztak meg: (1) dózis: teljes intraoperatív dózis (≥50 000 U); (2) időzítés: első adás az anesztézia indukciójakor vs. a kardiopulmonális bypass során; (3) útvonal: intravénás csepegtetés.

Demográfiai jellemzők közé tartozott az életkor, a nem és a dohányzási szokások, mindegyiket a felvételkor állapították meg. Klinikai társbetegségeket a beteglapokon található klinikai diagnózisok alapján dokumentálták, beleértve a magas vérnyomást, cukorbetegséget, krónikus tüdőbetegségeket (krónikus obstruktív tüdőbetegség, asztma, krónikus hörghurut, tágult hörgők) és krónikus veseelégtelenséget. A betegek preoperatív laboratóriumi mutatói a felvételt követő 24 órán belül vett vénás vérvizsgálati eredményekből álltak, beleértve a fehérvérsejtszámot és a hemoglobinkoncentrációt.

Korábbi irodalom és biológiai plauszibilitás alapján a mért zavaró tényezők közé tartoztak azok a változók, amelyekről ismert vagy feltételezett, hogy befolyásolják a PPC-k kockázatát. Ezek a kovariánsok magukban foglalták az életkort, a neme, a testtömegindexet (BMI), a preoperatív hemoglobinszintet, a preoperatív fehérvérsejtszámot, a preoperatív vérnyomást és a társbetegségeket. Minden kovariáns előre meghatározott volt és beépítésre került egy többváltozós korrekciós modellbe, hogy kezeljék az alapvonali egyensúlytalanságokat és enyhítsék a zavaró torzítást a klinikai eredmények értékelésében.

Eredmények A fő eredmény a PPC-k kialakulása volt a műtét utáni 7 napon belül vagy a kórházi elbocsátás előtt. A PPC-k diagnosztikai kritériumai az Európai Perioperatív Klinikai Eredmény definíciókban foglaltakon alapultak, amelyeket az Európai Aneszteziológiai Társaság és az Európai Intenzív Terápiás Társaság közösen publikált 2015-ben. Jelen vizsgálatban a PPC-k közé tartoztak a légúti fertőzések, légzési elégtelenség, mellkasi folyadékgyülem, atelektázis, bronchospasmus és aspirációs tüdőgyulladás. Figyelemre méltó, hogy mivel a mellkasi bemetszés a szívműtét szabványos összetevője és a posztoperatív tüdőbeszűrődés így gyakori eljárási következmény, a posztoperatív tüdőbeszűrődést ebben a vizsgálatban kizárták a PPC-k definíciójából.

Másodlagos eredmények közé tartozott a posztoperatív delírium és a kórházi összes okból bekövetkező halálozás. A posztoperatív delírium diagnózisához két kritériumot alkalmaztak: (1) a dokumentált posztoperatív delírium diagnózist megerősítettnek és érvényesnek tekintették; (2) ha nem állt rendelkezésre kezdeti posztoperatív delírium diagnózis, az adatgyűjtők retrospektíven felülvizsgálták a klinikai leleteket a delírium jelei szempontjából. A retrospektív posztoperatív delírium diagnózis kritériumai összhangban voltak a Mentális Betegségek Diagnosztikai és Statisztikai Kézikönyve, 5. kiadás (DSM-5) delíriumra vonatkozó alkalmazott kiegészítő diagnosztikai kritérumaival[7]. A kórházi összes okból bekövetkező halálozást a műtét utáni bármely okból bekövetkező kórházi halálként definiálták.

Torzítás A vizsgálat során több stratégiát alkalmaztak a lehetséges torzítás enyhítésére. A klinikai adatok kinyerését két képzett kutató végezte függetlenül egy szabványos protokoll szerint, az elektronikus betegnyilvántartásokból nyert információk felhasználásával. Az eltéréseket egy harmadik vezető felülvizsgáló döntötte el, hogy biztosítsa az adatok konzisztenciáját és pontosságát. A klinikai eredményeket egy expozíciós adatoktól vak független klinikai kutatási csapat állapította meg, ezzel tovább csökkentve az információs torzítást. Az előre meghatározott zavaró változókat, amelyeket biológiai plauszibilitás és korábbi bizonyítékok alapján azonosítottak, beépítették a többváltozós modellekbe a zavaró torzítás ellenőrzésére.

2. lépés: Hálózati farmakológiai alapú előrejelzés és molekuláris dokkolási szimulációk A PPC-k ulinasztatin általi csökkentésének molekuláris mechanizmusainak vizsgálata érdekében a szívműtétben részesült betegeknél ez a szakasz integrált megközelítést alkalmaz, amely kombinálja a hálózati farmakológiát és a molekuláris dokkolást.

Betegségcélok gyűjtése és standardizálása

Ezek a célpontok hat kulcsfontosságú PPC-kkel kapcsolatos klinikai állapotot öleltek fel, a megfelelő célpontszámok a következők voltak: Légúti fertőzések (n = 14 411); Aspirációs tüdőgyulladás (n = 4 033); Tüdőatelektázis (n = 1 107); Mellkasi folyadékgyülem (n = 2 282); Hörgőspazmus (n = 7 293); és Légzési elégtelenség (n = 12 467). A célpontnevek konzisztenciájának biztosítása érdekében az összes célgénnevet az UniProt adatbázis segítségével standardizálták. A fenti adathalmazokban átfedő gének szűrésével koexpresszált géneket azonosítottak, amelyeket az ulinasztatin és a PPC-k lehetséges patofiziológiai mechanizmusai közötti kapcsolatot közvetítő molekuláris mediátoroknak tekintettek.

Funkcionális enrichálási elemzés A koexpresszált gének biológiai funkcióinak és jelátviteli kaszkádokban való részvételük tisztázása érdekében párhuzamosan végeztek Gén Ontológia (GO) enrichálási elemzést és Kyoto Enciklopédia Gén és Genom (KEGG) útvonal-elemzést[17, 18]. Egy korrigált P-érték < 0,05 statisztikai küszöbértéket alkalmaztak az enrichálási eredmények robusztusságának és funkcionális relevanciájának biztosítására.

Lehetséges célfehérje lokalizáció Extracelluláris szekretált fehérjéket választottak, mivel az ulinasztatin, mint széles spektrumú proteázgátló, biológiai hatásait elsősorban az extracelluláris térben fejti ki; így csak extracelluláris célpontokat vettek figyelembe, hogy biztosítsák az ulinasztatin és célpontjai közötti biológiai plauszibilitást. Az extracelluláris szekretált fehérje adathalmazt a Humán Proteom Atlaszból nyerték, a szívműtéttel kapcsolatos célpontokat pedig a GeneCards adatbázisból (Szívműtéti Eljárások, n = 5 931). A lehetséges célfehérjéket pontosan azonosították a posztoperatív tüdőszövődményekkel kapcsolatos célpontok, a szívműtéttel kapcsolatos célpontok és az extracelluláris szekretált fehérje adathalmaz metszetének felvételével.

Fehérje-feherje interakciós hálózat felépítése A funkcionális elemzéssel egyidejűleg egy fehérje-feherje interakciós (PPI) hálózatot építettek fel a STRING adatbázis segítségével, az elemzési hatókört a Venn-diagramban azonosított átfedő célpontokra korlátozva. Az interakciók magas megbízhatóságának biztosítására a fajt Homo sapiensként határozták meg, és szigorú interakciós pontküszöböt (≥0,9) alkalmaztak.

Az ulinasztatin kulcscélgénjeinek azonosítása Rendszeres megközelítést alkalmaztak az ulinasztatin kulcsfontosságú molekuláris célpontjainak azonosítására: először a vegyület pontos nevét és molekulaképletét lekérdezték a PubChem adatbázisból és importálták a Swiss-Target Prediction platformba a lehetséges célmolekulák előrejelzésére és lekérésére. Ezután metszet-elemzést végeztek az ulinasztatin célmolekulák integrálására a fenti koexpressziós génadathalmazzal, szűrve azokat a molekulákat, amelyek egyszerre teljesítik az „ulinasztatin által szabályozott”, „releváns biológiai kontextusokban extracellulárisan szekretált” és „koexpresszált” kritériumokat. Ezután egy géninterakciós hálózatot építettek fel Friends' elemzés segítségével további optimalizálás céljából, minden gén fontosságát hálózati topológiai mutatók, például kapcsolati és központi érték alapján értékelve. Végül azonosították az ulinasztatin potenciális biológiai hatásait közvetítő kulcscsomóponti géneket.

Molekuláris dokkolás és dinamikai szimulációk A kis molekulás ligand ulinasztatin háromdimenziós szerkezetét a PubChem adatbázisból (PubChem CID: 105102) kérdezték le, míg a MMP3 fehérjeszerkezetet (PDB ID: 4g9l) az RCSB PDB adatbázisból nyerték. Előnyben részesítették a legmagasabb szerkezeti pontosságú humán fehérje konformációt a további elemzésekhez. A célfehérje elődokkolásos előfeldolgozását a PyMOL szoftverrel végezték: először a szerkezetből eltávolították a redundáns vízmolekulákat és endogén ligandusokat, hogy megszüntessék a nem specifikus interakciók interferenciáját; ezután hidrogénatomokat adtak a fehérje gerinchöz és oldalláncokhoz, hogy biztosítsák a kötési hely protonációs állapotának teljességét, ezzel javítva a dokkolási számítások pontosságát. A molekuláris dokkolási szimulációkat a CB-Dock2 online platformon (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/index.php) végezték. A dokkolást követően a LIGPLOT szoftvert használták fehérje-ligand interakciós sematikus ábrák generálására, amelyek vizuálisan szemléltetik a kulcsfontosságú kötési maradványokat és intermolekuláris erőket (beleértve a hidrogénkötéseket, hidrofób interakciókat és van der Waals-erőket). Ez a folyamat tisztázza a ligand és a célfehérje közötti specifikus kötési módot.

3. lépés: Validáció klinikai mintákban Klinikai validációs kohorszvizsgálat tervezése és alanyok Ez egy prospektív megfigyeléses vizsgálat. A klinikai validációs kohorsz plazmamintáit 2023 áprilisa és 2024 szeptembere között választott szívműtéten átesett felnőtt betegektől gyűjtötték, beleértve a nyitott szívbillentyű-rekonstrukciót, a kardiopulmonális bypass-asszisztált billentyűpótlást és a bypass nélküli koszorúér-bypass műtétet. Alkalmazzák ugyanazokat a kizárási kritériumokat, mint amelyeket a vizsgálat első részében használtak. A vizsgálat elsődleges eredménye a PPC-k előfordulása a műtét utáni 7 napon belül vagy a elbocsátás előtt.

Mintanagyság A minimális mintanagyságot az ulinasztatin és nem ulinasztatin csoportok PPC-k előfordulási arányai alapján számították ki. Ahogy a vizsgálat első részéből kiderült, a PPC-k előfordulási aránya 22,8% volt az ulinasztatin csoportban és 2,7% a nem ulinasztatin csoportban. A mintanagyság számítását PASS szoftverrel végezték a következő paraméterekkel: szignifikancia szint (α) = 0,05 és statisztikai erő (1-β) = 0,80. A mintanagyság kezdetben 168 esetből állt, további 15% esetkiesési rátával számolva, ami 193 eset minimálisan szükséges mintanagyságához vezetett.

Vérmintagyűjtés és vizsgálat Vénás vérmintákat gyűjtöttek a betegektől három előre meghatározott perioperatív időpontban: (1) preoperatívan (műtéti bemetszés előtt); (2) azonnal posztoperatívan (az intenzív osztályra kerüléskor); és (3) 24 órával posztoperatívan. Mintafeldolgozási eljárás: A vért EDTA antikoaguláns csőbe gyűjtötték, finoman megfordították a keverés érdekében, és jégen szállították. A plazmát gyors centrifugálással választották el a következő körülmények között: [3000 × g, 4°C, 10 perc]. Aliquotált plazmamintákat azonnal -80°C-on tároltak egy dedikált biobankban a későbbi tételes tesztelésre. Kvantifikálás enzimimmunassay (ELISA) segítségével történt a HM10736 készlettel (Bio-swamp Company, Vuhan, Kína), szigorúan a gyártói protokollok szerint.

Statisztikai módszerek A Shapiro-Wilk tesztet használták a folytonos változók normalitásának értékelésére. A normális eloszlású változókat átlag ± szórás (x̄ ± s) formában fejezték ki, a csoportközi összehasonlításokat egytényezős varianciaanalízissel (ANOVA) végezték. Ha a Levene teszt egyenlőtlen varianciákat jelez, Welch ANOVA-t alkalmaztak helyette. A ferde folytonos változókat medián (interkvartilis tartomány) [M (P25, P75)] formában mutatták be, és a csoportközi összehasonlításokat Kruskal-Wallis teszttel végezték. A kategorikus változókat szám (százalék) [n (%)] formában fejezték ki, a csoportközi összehasonlításokat khi-négyzet teszt vagy Fisher exact teszt segítségével végezték, a mintanagyságtól és a várható gyakorisági eloszlástól függően.

Tekintettel arra, hogy a PPC-k főleg a műtét utáni 7 napon belül fordulnak elő és minden beteget követték nyomon a elbocsátásig, logisztikus regressziót alkalmaztak. Többváltozós logisztikus regressziós modelleket alkalmaztak a plazma MMP3 koncentráció változásai és a klinikai eredmények közötti kapcsolat vizsgálatára. Előre meghatározott kovariánsokat, amelyeket klinikai relevancia és korábbi irodalom alapján választottak, beépítettek a modellekbe korrekció céljából. Az eredményeket odds arányok (OR) formájában jelentették 95%-os konfidenciaintervallumokkal (95% CI), tükrözve a kapcsolat erősségét és statisztikai pontosságát. Egy kétoldali P < 0,05-öt állítottak be a statisztikai szignifikancia küszöbértékeként.

Interakciós tagokat építettek be a logisztikus regressziós modellekbe olyan tényezők, mint a nem és társbetegségek módosító hatásainak feltárására a fő kapcsolatban. A likelihood arány tesztet használták az interakciós tagokat tartalmazó és nem tartalmazó modellek összehasonlítására, és interakciós P-értékeket számoltak ezeknek a hatásoknak a statisztikai szignifikanciájának értékelésére. További szubcsoport-elemzéseket végeztek a fenti tényezők alapján a különböző kapcsolati hatások azonosítására a szubcsoportok között.