ウリナスタチンは心臓手術後の肺合併症を減少させる

ステップⅠ：術中ウリナスタチン投与とPPCsリスクに関する後ろ向きコホート研究 本研究のこのセクションは、中国武漢市にある3つの医療機関（具体的には、同济光谷病院、同济中法病院、同济漢口病院）において、2014年1月から2022年12月までの間に選択的心臓手術を受けた成人患者を対象とした、後ろ向き多施設共同観察研究としてデザインされています。 研究が後ろ向きデザインであるため、サンプルサイズは事前に決定されました[14]。

参加者 選択的心臓手術（開心弁修復術、体外循環下弁置換術、非体外循環下冠動脈バイパス術を含む）を受ける成人患者を連続的にスクリーニングし、適格性を評価しました。 除外基準は以下の通りです：(1) 年齢18歳未満；(2) 妊婦；(3) 今回の入院以前の心臓手術の既往歴；(4) 術前の急性呼吸器疾患（気道感染症、呼吸不全、胸水、無気肺、気胸、気管支痙攣、肺炎など）の存在；(5) 今回の入院中、心臓手術前にウリナスタチン療法の実施；(6) 術中にウリナスタチンが使用され、総術中投与量が50,000単位未満であった場合；(7) 悪性腫瘍または骨髄移植の既往歴。

変数 主な曝露要因は術中ウリナスタチン投与とし、以下のように定義しました：(1) 投与量：総術中投与量（≥50,000単位）；(2) 投与タイミング：麻酔導入時初回投与 対 体外循環中投与；(3) 投与経路：静脈内点滴。

人口統計学的特性には、年齢、性別、喫煙状況が含まれ、これらは全て入院時に確認されました。 臨床的併存疾患は、医療記録の臨床診断に基づき記録され、高血圧、糖尿病、慢性肺疾患（慢性閉塞性肺疾患、喘息、慢性気管支炎、気管支拡張症）、慢性腎不全が含まれます。 患者の術前検査指標は、入院24時間以内に得られた静脈血検査結果から成り、白血球数とヘモグロビン濃度が含まれます。

先行文献と生物学的妥当性に基づき、測定された交絡因子には、PPCsリスクに影響を与えることが知られている、または仮説されている変数が含まれます。 これらの共変量は、年齢、性別、体格指数（BMI）、術前ヘモグロビン値、術前白血球数、術前血圧、併存疾患で構成されます。 全ての共変量は事前に指定され、多変量調整モデルに組み込まれ、ベースラインの不均衡に対処し、臨床アウトカム評価における交絡バイアスを軽減するために用いられました。

アウトカム 主要評価項目は、術後7日以内または退院前までのPPCsの発症としました。 PPCsの診断基準は、2015年に欧洲麻酔学会と欧洲集中治療医学会が共同で発表した欧洲周術期臨床アウトカム定義に概説された定義に基づいています。 本研究では、PPCsには気道感染症、呼吸不全、胸水、無気肺、気管支痙攣、吸引性肺炎が含まれます。 特に、開胸術が心臓手術の標準的構成要素であり、術後気胸はその常見する手技的後遺症であることから、本研究におけるPPCsの定義から術後気胸は除外されました。

副次評価項目には、術後せん妄と院内全死亡が含まれます。 術後せん妄の診断には、2つの基準が適用されました：(1) 文書化された術後せん妄の診断は確定されたものとみなされ、有効として受理されました；(2) 初期の術後せん妄診断がない場合、データ抽出者が臨床記録を後ろ向きにレビューし、せん妄の兆候を調査しました。 後ろ向き術後せん妄診断の基準は、精神疾患の診断・統計マニュアル第5版（DSM-5）のせん妄に関する適応補足診断基準に沿って設定されました[7]。 院内全死亡は、術後のあらゆる原因による院内死亡と定義されました。

バイアス 潜在的なバイアスを軽減するため、研究全体を通じて複数の戦略が実施されました。 臨床データ抽出は、標準化されたプロトコルに従い、電子医療記録から検索された情報を利用して、2名の訓練を受けた研究者が独立して行いました。 不一致は第3者の上級レビューアーによって裁定され、データの一貫性と正確性が確保されました。 臨床アウトカムは、曝露データを知らされていない独立した臨床研究チームによって確認され、情報バイアスがさらに低減されました。 生物学的妥当性と先行エビデンスに基づき同定された事前定義済み交絡変数は、多変量モデルに組み込まれ、交絡バイアスを制御するために用いられました。

ステップⅡ：ネットワーク薬理学に基づく予測と分子ドッキングシミュレーション 心臓手術患者におけるウリナスタチンによるPPCs低減の分子メカニズムを調査するため、このセクションではネットワーク薬理学と分子ドッキングを統合したアプローチを採用します。

疾患標的の収集と標準化

これらの標的は、6つの主要なPPCs関連臨床病態を含み、それぞれの標的数は以下の通りです：気道感染症（n = 14,411）；吸引性肺炎（n = 4,033）；肺無気肺（n = 1,107）；胸水（n = 2,282）；気管支痙攣（n = 7,293）；呼吸不全（n = 12,467）。 標的名称の一貫性を確保するため、全ての標的遺伝子名はUniProtデータベースを用いて標準化されました。 前述のデータセットにおける重複遺伝子をスクリーニングすることにより、共発現遺伝子が同定され、これらはウリナスタチンとPPCsの潜在的病態生理学的メカニズムを結ぶ分子媒介因子と見なされました。

機能エンリッチメント解析 共発現遺伝子の生物学的機能とシグナルカスケードへの参加を明らかにするため、Gene Ontology（GO）エンリッチメント解析とKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）経路解析が並行して実施されました[17, 18]。 エンリッチメント結果の頑健性と機能的相关性を確保するため、調整済みP値 < 0.05の統計的閾値が適用されました。

潜在的な標的タンパク質の局在 細胞外分泌タンパク質が選択されました。これは、ウリナスタチンが広域プロテアーゼ阻害剤として、その生物学的効果を主に細胞外空間で発揮するためであり、ウリナスタチンとその標的間の生物学的妥当性を確保するために、細胞外標的のみが考慮されました。 細胞外分泌タンパク質データセットはHuman Proteome Atlasから取得され、心臓手術関連標的はGeneCardsデータベース（心臓外科手術手順、n = 5,931）から取得されました。 潜在的な標的タンパク質は、術後肺合併症関連標的、心臓手術関連標的、細胞外分泌タンパク質データセットの積集合を取ることにより、正確に同定されました。

タンパク質-タンパク質相互作用ネットワーク構築 機能解析と並行して、STRINGデータベースを用いてタンパク質-タンパク質相互作用（PPI）ネットワークが構築され、解析範囲はベン図で同定された重複標的に限定されました。 相互作用の信頼性を高めるため、種はヒト（Homo sapiens）に指定され、厳格な相互作用スコア閾値（≥0.9）が適用されました。

ウリナスタチンの主要標的遺伝子の同定 ウリナスタチンの主要な分子標的を同定するため、体系的なアプローチが採用されました：まず、化合物の正確な名称と分子式をPubChemデータベースから検索し、Swiss-Target Predictionプラットフォームにインポートして潜在的な標的分子を予測・取得しました。 続いて、ウリナスタチン標的分子と前述の共発現遺伝子データセットを統合するため積集合解析が行われ、「ウリナスタチンにより調節される」、「関連する生物学的文脈において細胞外分泌される」、「共発現する」という基準を同時に満たす分子をスクリーニングしました。 その後、遺伝子相互作用ネットワークをFriends'解析を用いて構築し、さらに最適化を図り、各遺伝子の重要性は、接続性や中心性などのネットワークトポロジカル指標に基づき評価されました。 最終的に、ウリナスタチンの潜在的生物学的効果を媒介する主要なノード遺伝子が同定されました。

分子ドッキングと動的シミュレーション 低分子リガンドであるウリナスタチンの三次元構造はPubChemデータベース（PubChem CID: 105102）から、タンパク質MMP3の構造（PDB ID: 4g9l）はRCSB PDBデータベースから取得されました。 その後の解析には、構造精度が最も高いヒトタンパク質コンフォメーションが優先されました。 標的タンパク質のドッキング前前処理はPyMOLソフトウェアを用いて実施されました：まず、非特異的相互作用からの干渉を排除するため、構造から余分な水分子と内因性リガンドを除去しました；その後、結合部位のプロトン化状態の完全性を確保し、ドッキング計算の精度を向上させるため、タンパク質主鎖と側鎖に水素原子を付加しました。 分子ドッキングシミュレーションは、CB-Dock2オンラインプラットフォーム（https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/index.php）を用いて実施されました。 ドッキング後、LIGPLOTソフトウェアを用いてタンパク質-リガンド相互作用図を生成し、主要な結合残基と分子間力（水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力を含む）を視覚的に示しました。 このプロセスにより、リガンドと標的タンパク質間の特異的な結合様式が明らかになりました。

ステップⅢ：臨床サンプルにおける検証 臨床検証コホート研究のデザインと対象 これは前向き観察研究です。 臨床検証コホートの血漿サンプルは、2023年4月から2024年9月までの間に選択的心臓手術（開心弁修復術、体外循環支援下弁置換術、非体外循環下冠動脈バイパス術を含む）を受けた成人患者から収集されました。 本研究の第一部で使用されたものと同じ除外基準を適用します。 本研究の主要評価項目は、術後7日以内または退院前までのPPCsの発症です。

サンプルサイズ 最小サンプルサイズは、ウリナスタチン群と非ウリナスタチン群におけるPPCs発生率に基づき計算されました。 研究第一部から導出されたように、PPCs発生率はウリナスタチン群で22.8%、非ウリナスタチン群で2.7%でした。 サンプルサイズ計算はPASSソフトウェアを用いて実施され、パラメータは以下のように設定されました：有意水準（α）= 0.05、検出力（1-β）= 0.80。 サンプルサイズは当初168症例で構成され、さらに15%の脱落率を考慮し、最小必要サンプルサイズは193症例となりました。

血液サンプル採取と検査 静脈血サンプルは、患者から3つの事前定義された周術期時点で採取されました：(1) 術前（手術切開前）；(2) 直後術後（集中治療室入室時）；(3) 術後24時間。 サンプル処理手順：血液はEDTA抗凝固管に採取され、静かに転倒混和され、氷上で輸送されました。 血漿は以下の条件で迅速遠心分離により分離されました：[3000 × g, 4℃, 10分]。 分注された血漿サンプルは、直ちに-80℃の専用バイオバンクに保存され、後の一括検査に備えました。 定量は、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を用い、キットHM10736（Bio-swamp Company、中国武漢）で製造業者のプロトコルに厳密に従って実施されました。

統計手法 連続変数の正規性はShapiro-Wilk検定を用いて評価されました。 正規分布に従う変数は平均±標準偏差（x̄ ± s）で表され、群間比較は一元配置分散分析（ANOVA）を用いて実施されました。 Levene検定で等分散性が認められない場合、WelchのANOVAが代わりに適用されました。 歪んだ連続変数は中央値（四分位範囲）[M（P25, P75）]で提示され、群間比較はクラスカル・ワリス検定を用いて実施されました。 カテゴリ変数は度数（パーセンテージ）[n（%）]で表され、群間比較はサンプルサイズと期待度数分布に応じて、カイ二乗検定またはフィッシャーの正確確率検定が用いられました。

PPCsが主に術後7日以内に発生し、全ての患者が退院まで追跡されたことから、ロジスティック回帰が採用されました。 多変量ロジスティック回帰モデルを用いて、血漿MMP3濃度の変化と臨床アウトカムとの関連を検討しました。 臨床的相关性と先行文献に基づき選択された事前定義済み共変量が、調整のためモデルに含まれました。 結果はオッズ比（OR）と95%信頼区間（95% CI）で報告され、関連の強さと統計的精度を反映しました。 両側P < 0.05が統計的有意性の閾値として設定されました。

ロジスティック回帰モデルには交互作用項が組み込まれ、性別や併存疾患などの因子が主要な関連に及ぼす修飾効果を探索しました。 交互作用項を含むモデルと含まないモデルの比較には尤度比検定が用いられ、これらの効果の統計的有意性を評価するため交互作用P値が計算されました。 前述の因子に基づきさらにサブグループ解析が実施され、サブグループ間での差異的な関連効果を同定しました。