Улинастатин снижает послеоперационные легочные осложнения при кардиохирургических операциях

Этап Ⅰ: Ретроспективное когортное исследование интраоперационного применения улинастатина и риска послеоперационных легочных осложнений (ПОЛК) Данный раздел исследования представляет собой ретроспективное многоцентровое наблюдательное исследование, охватывающее взрослых пациентов, перенесших плановую кардиохирургическую операцию в трех медицинских центрах - а именно в Госпитале Тунцзи Гуангу, Госпитале Тунцзи Чжунфа и Госпитале Тунцзи Ханькоу, все расположенные в Ухане, Китай, в период с января 2014 года по декабрь 2022 года. В связи с ретроспективным дизайном исследования размер выборки был предопределен[14].

Участники Взрослые пациенты, перенесшие плановую кардиохирургическую операцию, включая открытую пластику клапанов сердца, протезирование клапанов с искусственным кровообращением и коронарное шунтирование без искусственного кровообращения, последовательно проверялись на соответствие критериям включения. Критерии исключения были следующими: (1) возраст < 18 лет; (2) беременные женщины; (3) история предшествующих кардиохирургических операций до текущей госпитализации; (4) наличие острых респираторных заболеваний до операции, таких как инфекции дыхательных путей, дыхательная недостаточность, плевральный выпот, ателектаз, пневмоторакс, бронхоспазм и пневмония; (5) проведение терапии улинастатином до кардиохирургической операции во время текущей госпитализации; (6) препарат улинастатин применялся во время операции с общей интраоперационной дозой менее 50 000 ЕД; (7) история злокачественных новообразований или трансплантации костного мозга.

Переменные Основным воздействием было интраоперационное введение улинастатина, определяемое по: (1) дозировке: общая интраоперационная доза (≥50 000 ЕД); (2) времени: первое введение при индукции анестезии в сравнении с периодом искусственного кровообращения; (3) пути введения: внутривенная капельная инфузия.

Демографические характеристики включали возраст, пол и статус курения, все установленные при поступлении. Клинические сопутствующие заболевания документировались на основе клинических диагнозов в медицинских записях, включая гипертензию, диабет, хронические легочные заболевания (хроническая обструктивная болезнь легких, астма, хронический бронхит, бронхоэктазы) и хроническую почечную недостаточность. Предоперационные лабораторные показатели пациентов состояли из результатов анализа венозной крови, полученных в течение 24 часов после поступления, включая количество лейкоцитов и концентрацию гемоглобина.

На основе предыдущей литературы и биологической правдоподобности, измеренные факторы смешения включали переменные, известные или предположительно влияющие на риск ПОЛК. Эти ковариаты включали возраст, пол, индекс массы тела (ИМТ), предоперационный уровень гемоглобина, предоперационное количество лейкоцитов, предоперационное артериальное давление и сопутствующие заболевания. Все ковариаты были предварительно определены и включены в модель многомерной корректировки для устранения базового дисбаланса и снижения смещающей погрешности при оценке клинических исходов.

Исходы Первичным исходом было развитие ПОЛК в течение 7 дней после операции или до выписки из стационара. Диагностические критерии ПОЛК были основаны на определениях, изложенных в Европейских определениях периоперационных клинических исходов, опубликованных совместно Европейским обществом анестезиологов и Европейским обществом интенсивной терапии в 2015 году. В настоящем исследовании ПОЛК включали инфекции дыхательных путей, дыхательную недостаточность, плевральный выпот, ателектаз, бронхоспазм и аспирационную пневмонию. Примечательно, что учитывая, что торакотомия является стандартным компонентом кардиохирургической операции и послеоперационный пневмоторакс, таким образом, является обычным procedural sequela, послеоперационный пневмоторакс был исключен из определения ПОЛК в данном исследовании.

Вторичные исходы включали послеоперационный делирий и внутрибольничную смертность от всех причин. Для диагностики послеоперационного делирия применялись два критерия: (1) документированный диагноз послеоперационного делирия рассматривался как подтвержденный и принимался как действительный; (2) при отсутствии первоначального диагноза послеоперационного делирия, сборщики данных ретроспективно просматривали клинические записи на предмет признаков делирия. Критерии ретроспективной диагностики послеоперационного делирия были согласованы с адаптированными дополнительными диагностическими критериями из Диагностического и статистического руководства по психическим расстройствам, 5-е издание (DSM-5) для делирия[7]. Внутрибольничная смертность от всех причин определялась как смерть в стационаре от любой причины после операции.

Смещение На протяжении исследования применялись множественные стратегии для снижения потенциального смещения. Извлечение клинических данных выполнялось независимо двумя обученными исследователями в соответствии со стандартизированным протоколом, с использованием информации, полученной из электронных медицинских карт. Расхождения разрешались третьим старшим рецензентом для обеспечения согласованности и точности данных. Клинические исходы устанавливались независимой клинической исследовательской группой, не осведомленной о данных по воздействию, тем самым дополнительно снижая информационное смещение. Предопределенные смешивающие переменные, идентифицированные на основе биологической правдоподобности и предыдущих доказательств, были включены в многомерные модели для контроля смешивающей погрешности.

Этап Ⅱ: Прогнозирование на основе сетевой фармакологии и молекулярного докинга Для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе снижения ПОЛК улинастатином у пациентов кардиохирургического профиля, данный раздел применяет интегрированный подход, сочетающий сетевую фармакологию и молекулярный докинг.

Сбор и стандартизация мишеней заболевания

Эти мишени охватывали шесть ключевых клинических состояний, связанных с ПОЛК, с соответствующим количеством мишеней следующим образом: Инфекции дыхательных путей (n = 14 411); Аспирационная пневмония (n = 4 033); Легочный ателектаз (n = 1 107); Плевральный выпот (n = 2 282); Бронхоспазм (n = 7 293); и Дыхательная недостаточность (n = 12 467). Для обеспечения согласованности в названиях мишеней все названия генов-мишеней были стандартизированы с использованием базы данных UniProt. Путем скрининга перекрывающихся генов в вышеупомянутых наборах данных были идентифицированы коэкспрессируемые гены, которые рассматривались как молекулярные медиаторы, связывающие улинастатин с потенциальными патофизиологическими механизмами ПОЛК.

Функциональный enrichment анализ Для выяснения биологических функций коэкспрессируемых генов и их участия в сигнальных каскадах параллельно проводились Gene Ontology (GO) enrichment анализ и анализ путей Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)[17, 18]. Статистический порог скорректированного P-значения < 0,05 применялся для обеспечения надежности и функциональной релевантности результатов обогащения.

Локализация потенциальных белков-мишеней Внеклеточные секретируемые белки были выбраны потому, что улинастатин, как ингибитор протеаз широкого спектра, оказывает свои биологические эффекты преимущественно во внеклеточном пространстве; таким образом, рассматривались только внеклеточные мишени для обеспечения биологической правдоподобности между улинастатином и его мишенями. Набор данных внеклеточных секретируемых белков был получен из Human Proteome Atlas, а мишени, связанные с кардиохирургией, были получены из базы данных GeneCards (Кардиохирургические процедуры, n = 5 931). Потенциальные белки-мишени были точно идентифицированы путем пересечения мишеней, связанных с послеоперационными легочными осложнениями, мишеней, связанных с кардиохирургией, и набора данных внеклеточных секретируемых белков.

Построение сети белок-белковых взаимодействий Одновременно с функциональным анализом была построена сеть белок-белковых взаимодействий (PPI) с использованием базы данных STRING, при этом аналитическая область была ограничена перекрывающимися мишенями, идентифицированными на диаграмме Венна. Для обеспечения высокой достоверности взаимодействий вид был указан как Homo sapiens, и применялся строгий порог оценки взаимодействия (≥0,9).

Идентификация ключевых генов-мишеней улинастатина Был применен систематический подход для идентификации ключевых молекулярных мишеней улинастатина: сначала точное название и молекулярная формула соединения были получены из базы данных PubChem и импортированы в платформу Swiss-Target Prediction для прогнозирования и получения потенциальных молекул-мишеней. Впоследствии был выполнен анализ пересечения для интеграции молекул-мишеней улинастатина с вышеупомянутым набором данных коэкспрессируемых генов, скрининг для молекул, одновременно удовлетворяющих критериям "регулируемые улинастатином", "секретируемые внеклеточно в соответствующих биологических контекстах" и "коэкспрессируемые". Затем была построена сеть взаимодействий генов с использованием анализа Friends для дальнейшей оптимизации, при этом важность каждого гена оценивалась на основе сетевых топологических метрик, таких как связность и центральность. Наконец, были идентифицированы ключевые узловые гены, опосредующие потенциальные биологические эффекты улинастатина.

Молекулярный докинг и динамическое моделирование Трехмерная структура низкомолекулярного лиганда улинастатина была получена из базы данных PubChem (PubChem CID: 105102), в то время как структура белка MMP3 (PDB ID: 4g9l) была получена из базы данных RCSB PDB. Предпочтение было отдано конформации человеческого белка с наивысшей структурной точностью для последующих анализов. Преддокинговая предобработка белка-мишени выполнялась с использованием программного обеспечения PyMOL: сначала из структуры были удалены избыточные молекулы воды и эндогенные лиганды для устранения вмешательства неспецифических взаимодействий; впоследствии к белковому остову и боковым цепям были добавлены атомы водорода для обеспечения полноты состояния протонирования в сайте связывания, тем самым улучшая точность докинг-расчетов. Моделирование молекулярного докинга проводилось с использованием онлайн-платформы CB-Dock2 (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/index.php). После докинга программное обеспечение LIGPLOT использовалось для генерации схем взаимодействия белок-лиганд, которые визуально иллюстрируют ключевые остатки связывания и межмолекулярные силы (включая водородные связи, гидрофобные взаимодействия и силы Ван-дер-Ваальса). Этот процесс проясняет специфический режим связывания между лигандом и белком-мишенью.

Этап III: Валидация в клинических образцах Дизайн исследования клинической валидационной когорты и субъекты Это проспективное наблюдательное исследование. Плазменные образцы из клинической валидационной когорты были собраны у взрослых пациентов, перенесших плановую кардиохирургическую операцию в период с апреля 2023 года по сентябрь 2024 года, включая открытую пластику клапанов сердца, протезирование клапанов с искусственным кровообращением и коронарное шунтирование без искусственного кровообращения. Применяются те же критерии исключения, что и в первой части данного исследования. Первичным исходом данного исследования является возникновение ПОЛК в течение 7 дней после операции или до выписки.

Размер выборки Минимальный размер выборки был рассчитан на основе частоты возникновения ПОЛК в группах улинастатина и без улинастатина. Как получено из первой части исследования, частота возникновения ПОЛК составила 22,8% в группе улинастатина и 2,7% в группе без улинастатина. Расчет размера выборки выполнялся с использованием программного обеспечения PASS с параметрами, установленными следующим образом: уровень значимости (α) = 0,05 и статистическая мощность (1-β) = 0,80. Размер выборки изначально состоял из 168 случаев, с дополнительным учетом 15% уровня отсева, что привело к минимально требуемому размеру выборки в 193 случая.

Забор и тестирование образцов крови Венозные образцы крови собирались у пациентов в трех предопределенных периоперационных временных точках: (1) предоперационно (до хирургического разреза); (2) непосредственно после операции (при поступлении в отделение интенсивной терапии); и (3) через 24 часа после операции. Процедура обработки образцов: Кровь собиралась в пробирки с антикоагулянтом ЭДТА, аккуратно переворачивалась для перемешивания и транспортировалась на льду. Плазма отделялась путем быстрого центрифугирования в следующих условиях: [3000 × g, 4℃, 10 мин]. Аликвоты плазменных образцов немедленно хранились при -80°C в специальном биобанке для последующего пакетного тестирования. Количественное определение проводилось с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) с набором HM10736 (Bio-swamp Company, Ухань, Китай), строго следуя протоколам производителя.

Статистические методы Тест Шапиро-Уилка использовался для оценки нормальности непрерывных переменных. Нормально распределенные переменные выражались как среднее ± стандартное отклонение (x̄ ± s), с межгрупповыми сравнениями, выполненными с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Если тест Левена указывал на неравенство дисперсий, вместо этого применялся ANOVA Уэлча. Скошенные непрерывные переменные представлялись как медиана (межквартильный размах) [M (P25, P75)], и межгрупповые сравнения проводились с использованием критерия Крускала-Уоллиса. Категориальные переменные выражались как количество (проценты) [n (%)], с межгрупповыми сравнениями с использованием критерия хи-квадрат или точного критерия Фишера, в зависимости от размера выборки и ожидаемого распределения частот.

Учитывая, что ПОЛК преимущественно возникают в течение 7 дней после операции и все пациенты наблюдались до выписки, применялась логистическая регрессия. Многомерные модели логистической регрессии использовались для изучения связи между изменениями концентрации MMP3 в плазме и клиническими исходами. Предопределенные ковариаты, отобранные на основе клинической релевантности и предыдущей литературы, были включены в модели для корректировки. Результаты сообщались как отношения шансов (OR) с 95% доверительными интервалами (95% ДИ), отражающие силу связи и статистическую точность. Двустороннее P < 0,05 было установлено в качестве порога статистической значимости.

Термины взаимодействия были включены в модели логистической регрессии для исследования модифицирующих эффектов таких факторов, как пол и сопутствующие заболевания, на первичную ассоциацию. Тест отношения правдоподобия использовался для сравнения моделей с терминами взаимодействия и без них, и P-значения взаимодействия рассчитывались для оценки статистической значимости этих эффектов. Дальнейшие подгрупповые анализы проводились на основе вышеупомянутых факторов для выявления дифференциальных эффектов ассоциации в подгруппах.