Ulinastatin snižuje pooperační plicní komplikace při kardiochirurgických zákrocích

Krok Ⅰ: Retrospektivní kohortová studie intraoperačního podávání ulinastatinu a rizika PPC Tato část studie je navržena jako retrospektivní, multicentrická observační studie, zahrnující dospělé pacienty, kteří podstoupili plánovanou srdeční operaci ve třech zdravotnických zařízeních - konkrétně v nemocnici Tongji Guanggu, nemocnici Tongji Zhongfa a nemocnici Tongji Hankou, všechny nacházející se ve Wu-chanu v Číně - mezi lednem 2014 a prosincem 2022. Kvůli retrospektivnímu designu studie byla velikost vzorku předem stanovena[14].

Účastníci Dospělí pacienti podstupující plánovanou srdeční operaci, včetně otevřené opravy srdeční chlopně, výměny chlopně s mimotělním oběhem a koronárního bypassu bez mimotělního oběhu, byli postupně vyšetřováni pro zařazení do studie. Vylučovací kritéria byla následující: (1) věk < 18 let; (2) těhotné ženy; (3) anamnéza předchozí srdeční operace před současnou hospitalizací; (4) přítomnost akutních respiračních onemocnění před operací, jako jsou infekce dýchacích cest, respirační selhání, pleurální výpotek, atelektáza, pneumotorax, bronchospasmus a pneumonie; (5) podání terapie ulinastatinem před srdeční operací během současné hospitalizace; (6) Lék ulinastatin byl použit během operace, s celkovou intraoperační dávkou menší než 50 000 U; (7) anamnéza malignity nebo transplantace kostní dřeně.

Proměnné Primární expozicí bylo intraoperační podávání ulinastatinu, definované: (1) dávkování: celková intraoperační dávka (≥50 000 U); (2) načasování: první podání při indukci anestezie vs. během mimotělního oběhu; (3) cesta: intravenózní kapání.

Demografické charakteristiky zahrnovaly věk, pohlaví a kuřácký status, všechny zjištěné při přijetí. Klinické komorbidity byly dokumentovány na základě klinických diagnóz v lékařských záznamech, včetně hypertenze, diabetu, chronických plicních onemocnění (chronická obstrukční plicní nemoc, astma, chronická bronchitida, bronchiektázie) a chronického selhání ledvin. Předoperační laboratorní ukazatele pacientů sestávaly z výsledků testů žilní krve získaných do 24 hodin od přijetí, včetně počtu bílých krvinek a koncentrace hemoglobinu.

Na základě předchozí literatury a biologické plausibility zahrnovaly měřené rušivé faktory proměnné známé nebo předpokládané, že ovlivňují riziko PPC. Tyto kovariáty zahrnovaly věk, pohlaví, index tělesné hmotnosti (BMI), předoperační hladinu hemoglobinu, předoperační počet bílých krvinek, předoperační krevní tlak a komorbidity. Všechny kovariáty byly předem specifikovány a začleněny do multivariačního adjustačního modelu, aby se řešila bazální nerovnováha a zmírnil se rušivý bias při hodnocení klinických výsledků.

Výsledky Primárním výsledkem byl vývoj PPC do 7 dnů po operaci nebo před propuštěním z nemocnice. Diagnostická kritéria pro PPC byla založena na definicích uvedených v evropských definicích perioperačních klinických výsledků, publikovaných společně Evropskou společností anesteziologie a Evropskou společností intenzivní medicíny v roce 2015. V této studii PPC zahrnovaly infekce dýchacích cest, respirační selhání, pleurální výpotek, atelektázu, bronchospasmus a aspirační pneumonii. Je důležité poznamenat, že vzhledem k tomu, že torakotomie je standardní součástí srdeční operace a pooperační pneumotorax je tedy běžným následkem procedury, byl pooperační pneumotorax z definice PPC v této studii vyloučen.

Sekundární výsledky zahrnovaly pooperační delirium a celkovou úmrtnost v nemocnici. Pro diagnostiku pooperačního deliria byla použita dvě kritéria: (1) dokumentovaná diagnóza pooperačního deliria byla považována za potvrzenou a přijatou jako platnou; (2) při absenci počáteční diagnózy pooperačního deliria přehledáři dat retrospektivně prošli klinické záznamy pro příznaky deliria. Kritéria pro retrospektivní diagnostiku pooperačního deliria byla sladěna s adaptovanými doplňkovými diagnostickými kritérii z Diagnostického a statistického manuálu duševních poruch, 5. vydání (DSM-5) pro delirium[7]. Celková úmrtnost v nemocnici byla definována jako úmrtí v nemocnici z jakékoli příčiny po operaci.

Bias Během studie bylo implementováno více strategií ke zmírnění potenciálního zkreslení. Extrakce klinických dat byla provedena nezávisle dvěma vyškoleními výzkumníky v souladu se standardizovaným protokolem, s využitím informací získaných z elektronických zdravotních záznamů. Neshody byly rozhodnuty třetím zkušeným přehledářem, aby byla zajištěna konzistence a přesnost dat. Klinické výsledky byly stanoveny nezávislým klinickým výzkumným týmem zaslepeným k expozičním datům, čímž se dále snížil informační bias. Předem definované rušivé proměnné, identifikované na základě biologické plausibility a předchozích důkazů, byly začleněny do multivariačních modelů pro kontrolu rušivého zkreslení.

Krok Ⅱ: Predikce založená na síťové farmakologii a molekulární dockingové simulace Pro vyšetření molekulárních mechanismů, které stojí za snížením PPC ulinastatinem u pacientů po srdeční operaci, tato část přijímá integrovaný přístup kombinující síťovou farmakologii a molekulární docking.

Sběr a standardizace cílových onemocnění

Tyto cíle zahrnovaly šest klíčových klinických stavů souvisejících s PPC, s příslušnými počty cílů následovně: Infekce dýchacích cest (n = 14 411); Aspirační pneumonie (n = 4 033); Plicní atelektáza (n = 1 107); Pleurální výpotek (n = 2 282); Bronchiální spasmus (n = 7 293); a Respirační selhání (n = 12 467). Pro zajištění konzistence v názvech cílů byly všechny názvy cílových genů standardizovány pomocí databáze UniProt. Screeningem pro překrývající se geny ve výše uvedených datových souborech byly identifikovány koexprimované geny, které byly považovány za molekulární mediátory spojující ulinastatin s potenciálními patofyziologickými mechanismy PPC.

Funkční obohacovací analýza Pro objasnění biologických funkcí koexprimovaných genů a jejich účasti v signalizačních kaskádách byla paralelně provedena Gene Ontology (GO) obohacovací analýza a Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway analýza[17, 18]. Byl aplikován statistický práh upravené P-hodnoty < 0,05, aby byla zajištěna robustnost a funkční relevance výsledků obohacení.

Lokalizace potenciálních cílových proteinů Byly vybrány extracelulární sekretované proteiny, protože ulinastatin, jako širokospektrý inhibitor proteáz, vyvíjí své biologické účinky primárně v extracelulárním prostoru; tedy pouze extracelulární cíle byly uvažovány, aby byla zajištěna biologická plausibilita mezi ulinastatinem a jeho cíli. Datový soubor extracelulárních sekretovaných proteinů byl získán z Human Proteome Atlas a cíle související se srdeční operací byly získány z databáze GeneCards (Srdeční chirurgické výkony, n = 5 931). Potenciální cílové proteiny byly přesně identifikovány průnikem cílů souvisejících s pooperačními plicními komplikacemi, cílů souvisejících se srdeční operací a datového souboru extracelulárních sekretovaných proteinů.

Konstrukce protein-protein interakční sítě Souběžně s funkční analýzou byla konstruována protein-protein interakční (PPI) síť pomocí databáze STRING, s analytickým rozsahem omezeným na překrývající se cíle identifikované ve Vennově diagramu. Pro zajištění vysoké spolehlivosti interakcí byl druh specifikován jako Homo sapiens a byl aplikován přísný práh interakčního skóre (≥0,9).

Identifikace klíčových cílových genů ulinastatinu Byl použit systematický přístup k identifikaci klíčových molekulárních cílů ulinastatinu: nejprve byl získán přesný název a molekulární vzorec sloučeniny z databáze PubChem a importován do platformy Swiss-Target Prediction pro predikci a získání potenciálních cílových molekul. Následně byla provedena průniková analýza pro integraci cílových molekul ulinastatinu s výše uvedeným datovým souborem koexprimovaných genů, screening pro molekuly, které současně splňují kritéria "regulováno ulinastatinem", "extracelulárně sekretováno v relevantních biologických kontextech" a "koexprimováno". Poté byla konstruována genová interakční síť pomocí Friends' analýzy pro další optimalizaci, s důležitostí každého genu hodnocenou na základě síťových topologických metrik, jako je konektivita a centralita. Nakonec byly identifikovány klíčové uzlové geny mediující potenciální biologické účinky ulinastatinu.

Molekulární dockingové a dynamické simulace Třírozměrná struktura malé molekuly ligandu ulinastatinu byla získána z databáze PubChem (PubChem CID: 105102), zatímco struktura proteinu MMP3 (PDB ID: 4g9l) byla získána z databáze RCSB PDB. Přednost byla dána lidské proteinové konformaci s nejvyšší strukturální přesností pro následné analýzy. Před-dockingové předzpracování cílového proteinu bylo provedeno pomocí softwaru PyMOL: nejprve byly ze struktury odstraněny redundantní molekuly vody a endogenní ligandy, aby se eliminovalo rušení z nespecifických interakcí; následně byly přidány vodíkové atomy k proteinovému skeletu a postranním řetězcům, aby byla zajištěna úplnost protonačního stavu vázacího místa, čímž se zlepšila přesnost dockingových výpočtů. Molekulární dockingové simulace byly provedeny pomocí online platformy CB-Dock2 (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/index.php). Po dockingu bylo využito softwaru LIGPLOT ke generování schémat protein-ligandových interakcí, které vizuálně ilustrují klíčové vázající se zbytky a mezimolekulární síly (včetně vodíkových vazeb, hydrofobních interakcí a van der Waalsových sil). Tento proces objasňuje specifický vázací mód mezi ligandem a cílovým proteinem.

Krok III: Validace v klinických vzorcích Design klinické validační kohortové studie a subjekty Toto je prospektivní observační studie. Plazmatické vzorky z klinické validační kohorty byly sbírány od dospělých pacientů, kteří podstoupili plánovanou srdeční operaci mezi dubnem 2023 a zářím 2024, včetně otevřené opravy srdeční chlopně, výměny chlopně asistované mimotělním oběhem a koronárního bypassu bez mimotělního oběhu. Aplikována jsou stejná vylučovací kritéria jako v první části této studie. Primárním výsledkem této studie je výskyt PPC do 7 dnů po operaci nebo před propuštěním.

Velikost vzorku Minimální velikost vzorku byla vypočítána na základě incidencí PPC ve skupině s ulinastatinem a bez ulinastatinu. Jak vyplývá z první části studie, incidence PPC byla 22,8% ve skupině s ulinastatinem a 2,7% ve skupině bez ulinastatinu. Výpočet velikosti vzorku byl proveden pomocí softwaru PASS s parametry nastavenými následovně: hladina významnosti (α) = 0,05 a statistická síla (1-β) = 0,80. Velikost vzorku původně sestávala z 168 případů, s dodatečnou 15% mírou vypadnutí zahrnutou, vedoucí k minimální požadované velikosti vzorku 193 případů.

Odběr a testování krevních vzorků Žilní krevní vzorky byly odebírány od pacientů ve třech předem definovaných perioperačních časových bodech: (1) před operací (před chirurgickým řezem); (2) bezprostředně po operaci (při přijetí na jednotku intenzivní péče); a (3) 24 hodin po operaci. Postup zpracování vzorku: Krev byla odebrána do EDTA antikoagulačních zkumavek, jemně převrácena pro promíchání a transportována na ledu. Plazma byla separována rychlou centrifugací za následujících podmínek: [3000 × g, 4℃, 10 min]. Naalikvotované vzorky plazmy byly okamžitě uloženy při -80°C v určené biobance pro následné dávkové testování. Kvantifikováno pomocí enzymově vázaného imunosorbentního testu (ELISA) s soupravou HM10736 (Bio-swamp Company, Wu-chan, Čína), přísně podle protokolů výrobce.

Statistické metody Test Shapiro-Wilk byl použit k vyhodnocení normality spojitých proměnných. Normálně distribuované proměnné byly vyjádřeny jako průměr ± směrodatná odchylka (x̄ ± s), s meziskupinovými srovnáními provedenými pomocí jednosměrné analýzy rozptylu (ANOVA). Pokud Leveneův test indikoval nestejné rozptyly, byla místo toho aplikována Welchova ANOVA. Zešikmené spojité proměnné byly prezentovány jako medián (interkvartilové rozpětí) [M (P25, P75)] a meziskupinová srovnání byla provedena pomocí Kruskal-Wallisova testu. Kategorické proměnné byly vyjádřeny jako počty (procenta) [n (%)], s meziskupinovými srovnáními pomocí chí-kvadrát testu nebo Fisherova exaktního testu, v závislosti na velikosti vzorku a očekávaném frekvenčním rozdělení.

Vzhledem k tomu, že PPC se vyskytují převážně do 7 dnů po operaci a všichni pacienti byli sledováni až do propuštění, byla použita logistická regrese. Multivariační logistické regresní modely byly použity ke zkoumání asociace mezi změnami koncentrace plazmatického MMP3 a klinickými výsledky. Předem definované kovariáty, vybrané na základě klinické relevance a předchozí literatury, byly zahrnuty do modelů pro adjustaci. Výsledky byly hlášeny jako poměry šancí (OR) s 95% intervaly spolehlivosti (95% CI), odrážející sílu asociace a statistickou přesnost. Oboustranné P < 0,05 bylo nastaveno jako práh statistické významnosti.

Interakční členy byly začleněny do logistických regresních modelů pro zkoumání modifikačních účinků faktorů, jako je pohlaví a komorbidity, na primární asociaci. Poměrový test věrohodnosti byl použit pro srovnání modelů s a bez interakčních členů a interakční P-hodnoty byly vypočítány pro posouzení statistické významnosti těchto účinků. Další podskupinové analýzy byly provedeny na základě výše uvedených faktorů k identifikaci diferenciálních asociačních účinků napříč podskupinami.