Cytokiny u Papillon-Lefèvre syndromu

MATERIÁL A METODY Materiály Lipopolysacharid (LPS; Escherichia coli, sérotyp R515) byl zakoupen od Alexis (Lausen, Švýcarsko) a adenosintrifosfát (ATP) od Sigma (Deisenhofen, Německo). Tumor nekrotizující faktor a (TNF-a) laskavě poskytl Knoll AG (Ludwigshafen, Německo). IL-lp byl od Invitrogen/Biosource (Karlsruhe, Německo).

Pacienti a zdraví dárci Pět pacientů se stanovenou diagnózou PLS je v parodontologické léčbě na Klinice parodontologie Centra zubní, ústní a čelistní medicíny (Carolinum) Univerzity Johanna Wolfganga Goetha ve Frankfurtu nad Mohanem. Všem byla poskytnuta antiinfekční léčba přídatnými antibiotiky a jsou v pravidelné a časté podpůrné léčbě. Oddělení parodontologie má kontakt na dalších 5 pacientů s PLS, kteří jsou bezzubí nebo podstupující parodontální terapii jinde. Všichni pacienti podstoupili kompletní ústní vyšetření a také prohlídku kůže dlaní a chodidel. Každý dospělý pacient nebo rodiče obdrželi klinické a genetické poradenství a podepsali formulář souhlasu, schválený etickými komisemi univerzit v Drážďanech a Frankfurtu/Main. Klinické údaje a mutace všech pacientů byly hlášeny již dříve. Všichni tito pacienti byli pozváni k účasti na této studii. Zdraví dárci se dva týdny před studií zdrželi užívání léků. Vzhledem k širokému použití perorální antikoncepce byli vybráni pouze mužští probandi. Studie byla v souladu s pravidly Helsinské deklarace a byla schválena Institucionální revizní komisí pro humánní studia Lékařské fakulty Univerzity Johanna Wolfganga Goetheho ve Frankfurtu nad Mohanem (přihláška č. 31/05). Všichni zúčastnění jedinci byli informováni o rizicích a přínosech a také o postupech studie a dali písemný informovaný souhlas.

Kultura plné krve Heparinizovaná krev byla smíchána se stejným objemem kultivačního média (RPMI 1640 doplněného 25 mM HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethansulfonová kyselina), 100 U/ml penicilinu, 100 ug/ml streptomycinu) a 1 ml alikvoty byly přeneseny do volně uzavřených polypropylenových zkumavek s kulatým dnem (Greiner, Německo). Kultury plné krve byly udržovány při 37 oC a 5 % CO2 po uvedenou dobu. Poté byly vzorky bezbuněčné plazmy/RPMI získány centrifugací a skladovány při -70 °C až do stanovení koncentrací cytokinů pomocí testu ELISA (enzyme linked immunosorbent essay). Experimenty byly zahájeny do 60 minut po odběru krve. Celé hemokultury se tedy skládaly z celé řady bílých krvinek a také erytrocytů. S výjimkou stanovení uvolňování IL-lp byly kultury buď udržovány jako nestimulovaná kontrola nebo stimulovány LPS (10 nebo 100 ng/ml), nebo kombinací IL-1p plus TNF-a (50 ng/ml každý) po dobu 24 hodin. . Pro stanovení uvolňování IL-lp byly buňky udržovány jako nestimulovaná kontrola nebo byly stimulovány ligandem LPS Toll-like receptor 4 (100 ng/ml) po dobu celkem 5 hodin. Pro účinné uvolňování IL-lp z aktivovaných kultur byl LPS kombinován s ATP (2 mM), který byl přidán během posledních 2 hodin 5h stimulačního období, aby se dosáhlo aktivace purinoreceptoru P2X7.

Analýza uvolňování cytokinů analýzou ELISA Koncentrace IL-8, IL-6, interferonem indukovatelného proteinu (IP)-10, interferonu (IFN) gama (Pharmingen/BD Biosciences) a IL-1β, (R&D Systems), v vzorky plazmy/RPMI byly stanoveny metodou ELISA podle pokynů výrobce.

Statistika Jako statistická jednotka byl definován jednotlivý pacient nebo proband. Data jsou uvedena jako medián s interkvartilním rozsahem a jsou prezentována jako pg/ml (IL-lp, IL-6, IP-10) nebo jako ng/ml (IL-8). Mediány byly porovnány mezi pacienty s PLS a zdravými dobrovolníky pomocí neparametrického Mann Whitney U testu. Statistická analýza byla provedena pomocí počítačového programu (Systat pro Windows verze 10.0, Systat Inc., Evanston, IL, USA).