Zytokine beim Papillon-Lefèvre-Syndrom

MATERIAL UND METHODEN Materialien Lipopolysaccharid (LPS; Escherichia coli, Serotyp R515) wurde von Alexis (Lausen, Schweiz) und Adenosintriphosphat (ATP) von Sigma (Deisenhofen, Deutschland) gekauft. Tumornekrosefaktor α (TNF-α) wurde freundlicherweise von der Knoll AG (Ludwigshafen, Deutschland) zur Verfügung gestellt. IL-1β war von Invitrogen/Biosource (Karlsruhe, Deutschland).

Patienten und gesunde Spender Fünf Patienten mit gesicherter PLS-Diagnose befinden sich in parodontaler Behandlung an der Klinik für Parodontologie, Zentrum für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde (Carolinum) der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main. Allen wurde eine antiinfektiöse Therapie mit begleitenden Antibiotika zuteil, und sie stehen unter regelmäßiger und häufiger unterstützender Therapie. Die Abteilung für Parodontologie hat Kontakt zu weiteren 5 PLS-Patienten, die zahnlos sind oder sich anderweitig in Parodontaltherapie befinden. Alle Patienten wurden einer vollständigen mündlichen Untersuchung sowie einer Inspektion der Haut der Handflächen und Fußsohlen unterzogen. Jeder erwachsene Patient oder Elternteil erhielt eine klinische und genetische Beratung und unterzeichnete eine Einverständniserklärung, die von den Ethikkommissionen der Universitäten Dresden und Frankfurt/Main genehmigt wurde. Klinische Daten und Mutationen aller Patienten wurden zuvor berichtet. Alle diese Patienten wurden eingeladen, an dieser Studie teilzunehmen. Gesunde Spender hatten vor der Studie zwei Wochen lang auf die Einnahme von Medikamenten verzichtet. Aufgrund der weit verbreiteten Anwendung von oralen Kontrazeptiva wurden nur männliche Probanden ausgewählt. Die Studie entsprach den Regeln der Deklaration von Helsinki und wurde vom Institutional Review Board for Human Studies der Medizinischen Fakultät der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt/Main genehmigt (Application# 31/05). Alle teilnehmenden Personen wurden über Risiken und Nutzen sowie den Ablauf der Studie aufgeklärt und gaben ihr schriftliches Einverständnis.

Vollblutkultur Heparinisiertes Blut wurde mit einem gleichen Volumen Kulturmedium (RPMI 1640 ergänzt mit 25 mM HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethansulfonsäure), 100 U/ml Penicillin, 100 gemischt µg/ml Streptomycin) und 1 ml-Aliquots wurden in locker verschlossene Rundboden-Polypropylenröhrchen (Greiner, Deutschland) überführt. Vollblutkulturen wurden für die angegebenen Zeiträume bei 37 oC und 5 % CO2 aufbewahrt. Danach wurden zellfreies Plasma/RPMI-Proben durch Zentrifugation gewonnen und bei -70 °C gelagert, bis die Zytokinkonzentrationen durch einen ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Essay) bestimmt wurden. Die Experimente wurden innerhalb von 60 Minuten nach der Blutentnahme begonnen. Somit bestanden die Vollblutkulturen aus dem gesamten Bereich weißer Blutkörperchen sowie Erythrozyten. Außer zur Bestimmung der IL-1β-Freisetzung wurden die Kulturen entweder als unstimulierte Kontrolle gehalten oder mit LPS (10 oder 100 ng/ml) oder mit der Kombination von IL-1β plus TNF-α (jeweils 50 ng/ml) für 24 h stimuliert . Zur Bestimmung der IL-1β-Freisetzung wurden die Zellen als unstimulierte Kontrolle gehalten oder mit Toll-like-Rezeptor-4-Ligand LPS (100 ng/ml) für insgesamt 5 h stimuliert. Zur effizienten Freisetzung von IL-1β aus aktivierten Kulturen wurde LPS mit ATP (2 mM) kombiniert, das während der letzten 2 h der 5-stündigen Stimulationsperiode zugegeben wurde, um eine Aktivierung des Purinorezeptors P2X7 zu erreichen.

Analyse der Zytokinfreisetzung durch ELISA-Analyse Konzentrationen von IL-8, IL-6, Interferon-induzierbarem Protein (IP)-10, Interferon (IFN) Gamma (Pharmingen/BD Biosciences) und IL-1β, (R&D Systems), in Plasma/RPMI-Proben wurden durch ELISA gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt.

Statistik Als statistische Einheit wurde der einzelne Patient bzw. Proband definiert. Die Daten werden als Median mit Interquartilbereich und als pg/ml (IL-1β, IL-6, IP-10) oder als ng/ml (IL-8) dargestellt. Mittelwerte wurden zwischen PLS-Patienten und gesunden Probanden unter Verwendung des nichtparametrischen Mann-Whitney-U-Tests verglichen. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung eines Computerprogramms (Systat für Windows Version 10.0, Systat Inc., Evanston, IL, USA) durchgeführt.