Cytokiner i Papillon-Lefèvres syndrom

MATERIAL OCH METODER Material Lipopolysackarid (LPS; Escherichia coli, serotyp R515) köptes från Alexis (Lausen, Schweiz) och adenosintrifosfat (ATP) från Sigma (Deisenhofen, Tyskland). Tumörnekrosfaktor a (TNF-a) tillhandahölls vänligt av Knoll AG (Ludwigshafen, Tyskland). IL-ip var från Invitrogen/Biosource (Karlsruhe, Tyskland).

Patienter och friska donatorer Fem patienter med fastställd diagnos av PLS är under periodontal behandling vid avdelningen för parodontologi, Centrum för tand-, oral- och käkmedicin (Carolinum) vid Johann Wolfgang Goethe-universitetet i Frankfurt am Main. Antiinfektionsbehandling med tilläggsantibiotika har givits till dem alla och de är under regelbunden och frekvent stödbehandling. Parodontologiska avdelningen har kontakt med ytterligare 5 PLS-patienter som är tandlösa eller under parodontitbehandling på annat håll. Alla patienter genomgick fullständiga muntliga undersökningar samt inspektion av huden på handflatorna och fotsulorna. Varje vuxen patient eller föräldrar fick klinisk och genetisk rådgivning och undertecknade ett samtyckesformulär, godkänt av de etiska kommittéerna vid universiteten i Dresden och Frankfurt/Main. Kliniska data och mutationer från alla patienter har rapporterats tidigare. Alla dessa patienter inbjöds att delta i denna studie. Friska donatorer hade avstått från att ta droger i två veckor före studien. På grund av utbredd användning av orala preventivmedel valdes endast manliga proband. Studien överensstämde med reglerna i Helsingforsdeklarationen och godkändes av Institutional Review Board for Human Studies vid den medicinska fakulteten vid Johann Wolfgang Goethe-universitetet Frankfurt/Main (ansökan nr 31/05). Alla deltagande individer informerades om risker och fördelar samt procedurerna för studien och gav skriftligt informerat samtycke.

Helblodsodling Hepariniserat blod blandades med en lika stor volym odlingsmedium (RPMI 1640 kompletterat med 25 mM HEPES (2-[4-(2-hydroxietyl)piperazin-1-yl]etansulfonsyra), 100 U/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin) och 1 ml alikvoter överfördes till löst förseglade rundbottnade polypropenrör (Greiner, Tyskland). Helblodskulturer hölls vid 37 oC och 5 % CO2 under de angivna tidsperioderna. Därefter erhölls cellfria plasma/RPMI-prover genom centrifugering och lagrades vid -70oC tills bedömning av cytokinkoncentrationer genom enzymkopplad immunosorbentuppsats (ELISA). Experiment påbörjades inom 60 minuter efter blodavdrag. Således bestod helblodsodlingarna av hela skalan av vita blodkroppar samt erytrocyter. Förutom bestämning av IL-1β-frisättning, hölls kulturer antingen som ostimulerad kontroll eller stimulerades med LPS (10 eller 100 ng/ml), eller med kombinationen av IL-1β plus TNF-α (50 ng/ml vardera) under 24 timmar . För bestämning av IL-ip-frisättning hölls celler som ostimulerad kontroll eller stimulerades med Toll-liknande receptor 4-ligand LPS (100 ng/ml) under totalt 5 timmar. För effektiv frisättning av IL-1β från aktiverade kulturer kombinerades LPS med ATP (2 mM) som tillsattes under de sista 2 timmarna av den 5 timmar långa stimuleringsperioden för att uppnå aktivering av purinoreceptorn P2X7.

Analys av cytokinfrisättning genom ELISA-analys Koncentrationer av IL-8, IL-6, interferon-inducerbart protein (IP)-10, interferon (IFN) gamma (Pharmingen/BD Biosciences) och IL-1β, (FoU-system), i plasma/RPMI-prover bestämdes med ELISA enligt tillverkarens instruktioner.

Statistik Den enskilda patienten eller proband definierades som statistisk enhet. Data visas som median med interkvartilt intervall och presenteras som pg/ml (IL-1β, IL-6, IP-10) eller som ng/ml (IL-8). Medianer jämfördes mellan PLS-patienter och friska frivilliga med det icke-parametriska Mann Whitney U-testet. Statistisk analys utfördes med användning av ett datorprogram (Systat för Windows version 10.0, Systat Inc., Evanston, IL, USA).