Citochine nella sindrome di Papillon-Lefèvre

MATERIALI E METODI Materiali Il lipopolisaccaride (LPS; Escherichia coli, sierotipo R515) è stato acquistato da Alexis (Lausen, Svizzera) e l'adenosina trifosfato (ATP) da Sigma (Deisenhofen, Germania). Il fattore di necrosi tumorale α (TNF-α) è stato gentilmente fornito dalla Knoll AG (Ludwigshafen, Germania). IL-1β proveniva da Invitrogen/Biosource (Karlsruhe, Germania).

Pazienti e donatori sani Cinque pazienti con diagnosi accertata di PLS sono in trattamento parodontale presso il Dipartimento di Parodontologia, Centro di Medicina Dentale, Orale e Maxillofacciale (Carolinum) dell'Università Johann Wolfgang Goethe di Francoforte sul Meno. A tutti è stata somministrata terapia antinfettiva con antibiotici aggiuntivi e sono sottoposti a regolare e frequente terapia di supporto. Il Dipartimento di Parodontologia ha contatti con altri 5 pazienti PLS che sono edentuli o in terapia parodontale altrove. Tutti i pazienti sono stati sottoposti a esami orali completi e all'ispezione della pelle dei palmi delle mani e delle piante dei piedi. Ogni paziente adulto o genitore ha ricevuto consulenza clinica e genetica e ha firmato un modulo di consenso, approvato dai comitati etici delle Università di Dresda e Francoforte sul Meno. I dati clinici e le mutazioni di tutti i pazienti sono stati riportati in precedenza. Tutti questi pazienti sono stati invitati a prendere parte a questo studio. I donatori sani si erano astenuti dall'assumere droghe per due settimane prima dello studio. A causa dell'ampio uso di contraccettivi orali, sono stati scelti solo probandi maschi. Lo studio ha rispettato le regole della Dichiarazione di Helsinki ed è stato approvato dall'Institutional Review Board for Human Studies della Facoltà di Medicina dell'Università Johann Wolfgang Goethe di Francoforte sul Meno (Application# 31/05). Tutti i soggetti partecipanti sono stati informati sui rischi e sui benefici, nonché sulle procedure dello studio e hanno fornito il consenso informato scritto.

Coltura di sangue intero Il sangue eparinizzato è stato miscelato con un volume uguale di terreno di coltura (RPMI 1640 integrato con 25 mM HEPES (acido 2-[4-(2-idrossietil)piperazin-1-il]etansolfonico), 100 U/ml di penicillina, 100 µg/ml di streptomicina) e aliquote da 1 ml sono state trasferite in provette di polipropilene a fondo tondo sigillate (Greiner, Germania). Le colture di sangue intero sono state mantenute a 37 oC e 5% CO2 per i periodi di tempo indicati. Successivamente, i campioni di plasma/RPMI privi di cellule sono stati ottenuti mediante centrifugazione e conservati a -70°C fino alla valutazione delle concentrazioni di citochine mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). Gli esperimenti sono stati avviati entro 60 minuti dal prelievo del sangue. Pertanto, le colture di sangue intero consistevano nell'intera gamma di globuli bianchi e di eritrociti. Fatta eccezione per la determinazione del rilascio di IL-1β, le colture sono state mantenute come controllo non stimolato o stimolate con LPS (10 o 100 ng/ml) o con la combinazione di IL-1β più TNF-α (50 ng/ml ciascuna) per 24 ore . Per la determinazione del rilascio di IL-1β, le cellule sono state mantenute come controllo non stimolato o sono state stimolate con il ligando del recettore Toll-like 4 LPS (100 ng/ml) per un totale di 5 ore. Per un rilascio efficiente di IL-1β da colture attivate, LPS è stato combinato con ATP (2 mM) che è stato aggiunto durante le ultime 2 ore del periodo di stimolazione di 5 ore per ottenere l'attivazione del purinorecettore P2X7.

Analisi del rilascio di citochine mediante analisi ELISA Concentrazioni di IL-8, IL-6, proteina inducibile dall'interferone (IP)-10, interferone (IFN) gamma (Pharmingen/BD Biosciences) e IL-1β, (R&D Systems), in i campioni di plasma/RPMI sono stati determinati mediante ELISA secondo le istruzioni del produttore.

Statistiche Il singolo paziente o probando è stato definito come unità statistica. I dati sono mostrati come mediana con intervallo interquartile e sono presentati come pg/ml (IL-1β, IL-6, IP-10) o come ng/ml (IL-8). Le mediane sono state confrontate tra pazienti con PLS e volontari sani utilizzando il test U di Mann Whitney non parametrico. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando un programma per computer (Systat per Windows versione 10.0, Systat Inc., Evanston, IL, USA).