Cytokiny w zespole Papillona-Lefèvre'a

MATERIAŁ I METODY Materiały Lipopolisacharyd (LPS; Escherichia coli, serotyp R515) zakupiono od firmy Alexis (Lausen, Szwajcaria), a trójfosforan adenozyny (ATP) od firmy Sigma (Deisenhofen, Niemcy). Czynnik martwicy nowotworu α (TNF-α) został dostarczony dzięki uprzejmości firmy Knoll AG (Ludwigshafen, Niemcy). IL-1β pochodziła z firmy Invitrogen/Biosource (Karlsruhe, Niemcy).

Pacjenci i zdrowi dawcy Pięciu pacjentów z rozpoznaniem PLS jest leczonych periodontologicznie w Klinice Periodontologii Centrum Medycyny Stomatologicznej, Jamy Ustnej i Szczękowo-Twarzowej (Carolinum) Uniwersytetu im. Johanna Wolfganga Goethego we Frankfurcie nad Menem. U wszystkich zastosowano leczenie przeciwinfekcyjne antybiotykami wspomagającymi i są oni objęci regularną i częstą terapią wspomagającą. Oddział Periodontologii ma kontakt z dodatkowymi 5 pacjentami PLS bezzębnymi lub leczonymi periodontologicznie gdzie indziej. U wszystkich pacjentów wykonano pełne badanie jamy ustnej oraz oględziny skóry dłoni i stóp. Każdy dorosły pacjent lub jego rodzice otrzymali poradę kliniczną i genetyczną oraz podpisali formularz zgody, zatwierdzony przez komisje etyczne uniwersytetów w Dreźnie i Frankfurcie nad Menem. Dane kliniczne i mutacje wszystkich pacjentów zostały zgłoszone wcześniej. Wszystkich tych pacjentów zaproszono do wzięcia udziału w tym badaniu. Zdrowi dawcy powstrzymywali się od przyjmowania narkotyków przez dwa tygodnie przed badaniem. Ze względu na powszechne stosowanie doustnych środków antykoncepcyjnych wybrano tylko probantów płci męskiej. Badanie było zgodne z zasadami Deklaracji Helsińskiej i zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board for Human Studies na Wydziale Lekarskim Uniwersytetu im. Johanna Wolfganga Goethego we Frankfurcie nad Menem (wniosek nr 31/05). Wszystkie osoby uczestniczące zostały poinformowane o ryzyku i korzyściach oraz procedurach badania i wyraziły pisemną świadomą zgodę.

Hodowla krwi pełnej Heparynizowaną krew mieszano z równą objętością pożywki hodowlanej (RPMI 1640 z dodatkiem 25 mM HEPES (kwas 2-[4-(2-hydroksyetylo)piperazyn-1-ylo]etanosulfonowy), 100 U/ml penicyliny, 100 µg/ml streptomycyny) i 1 ml porcje przeniesiono do luźno zamkniętych okrągłodennych probówek polipropylenowych (Greiner, Niemcy). Hodowle krwi pełnej utrzymywano w temperaturze 37 oC i 5% CO2 przez wskazane okresy czasu. Następnie próbki osocza bez komórek/RPMI uzyskano przez odwirowanie i przechowywano w temperaturze -70oC do czasu oceny stężeń cytokin za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA). Eksperymenty rozpoczęto w ciągu 60 minut od pobrania krwi. Tak więc posiewy pełnej krwi obejmowały cały szereg białych krwinek, jak również erytrocyty. Z wyjątkiem oznaczania uwalniania IL-1β, hodowle utrzymywano jako niestymulowaną kontrolę lub stymulowano LPS (10 lub 100 ng/ml) lub kombinacją IL-1β plus TNF-α (po 50 ng/ml) przez 24 godziny . W celu określenia uwalniania IL-1β komórki trzymano jako niestymulowaną kontrolę lub stymulowano ligandem receptora Toll-podobnego 4 LPS (100 ng/ml) łącznie przez 5 godzin. W celu skutecznego uwalniania IL-1β z aktywowanych hodowli, LPS połączono z ATP (2 mM), który dodano podczas ostatnich 2 godzin 5-godzinnego okresu stymulacji w celu uzyskania aktywacji receptora purynowego P2X7.

Analiza uwalniania cytokin za pomocą analizy ELISA Stężenia IL-8, IL-6, białka indukowanego interferonem (IP)-10, interferonu (IFN) gamma (Pharmingen/BD Biosciences) i IL-1β, (R&D Systems), w próbki osocza/RPMI oznaczano metodą ELISA zgodnie z instrukcjami producenta.

Statystyka Indywidualny pacjent lub proband został zdefiniowany jako jednostka statystyczna. Dane przedstawiono jako medianę z rozstępem międzykwartylowym i przedstawiono jako pg/ml (IL-1β, IL-6, IP-10) lub jako ng/ml (IL-8). Mediany porównano między pacjentami z PLS i zdrowymi ochotnikami za pomocą nieparametrycznego testu U Manna Whitneya. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą programu komputerowego (Systat dla Windows wersja 10.0, Systat Inc., Evanston, IL, USA).