Cytokiner i Papillon-Lefèvre syndrom

MATERIALE OG METODER Materialer Lipopolysaccharid (LPS; Escherichia coli, serotype R515) blev købt fra Alexis (Lausen, Schweiz) og adenosintriphosphat (ATP) fra Sigma (Deisenhofen, Tyskland). Tumornekrosefaktor α (TNF-α) blev venligst leveret af Knoll AG (Ludwigshafen, Tyskland). IL-1β var fra Invitrogen/Biosource (Karlsruhe, Tyskland).

Patienter og raske donorer Fem patienter med etableret diagnose PLS er under parodontal behandling på afdelingen for parodontologi, Center for Dental, Oral og Maxillofacial Medicine (Carolinum) ved Johann Wolfgang Goethe-Universitetet Frankfurt am Main. Antiinfektiv terapi med supplerende antibiotika er blevet givet til dem alle, og de er under regelmæssig og hyppig understøttende terapi. Paradentologisk Afdeling har kontakt til yderligere 5 PLS-patienter, der er tandløse eller i paradentosebehandling andetsteds. Alle patienter gennemgik komplette mundtlige undersøgelser samt inspektion af huden på håndflader og såler. Hver voksen patient eller forældre modtog klinisk og genetisk rådgivning og underskrev en samtykkeerklæring, godkendt af de etiske komiteer ved universiteterne i Dresden og Frankfurt/Main. Kliniske data og mutationer for alle patienter er blevet rapporteret tidligere. Alle disse patienter blev inviteret til at deltage i denne undersøgelse. Raske donorer havde afholdt sig fra at tage medicin i to uger før undersøgelsen. På grund af udbredt brug af orale præventionsmidler blev kun mandlige probander valgt. Undersøgelsen var i overensstemmelse med reglerne i Helsinki-erklæringen og blev godkendt af Institutional Review Board for Human Studies ved det medicinske fakultet ved Johann Wolfgang Goethe-Universitetet Frankfurt/Main (ansøgning nr. 31/05). Alle deltagende personer blev informeret om risici og fordele samt procedurerne for undersøgelsen og gav skriftligt informeret samtykke.

Helblodskultur Hepariniseret blod blev blandet med et lige så stort volumen dyrkningsmedium (RPMI 1640 suppleret med 25 mM HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethansulfonsyre), 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin) og 1 ml alikvoter blev overført til løst forseglede rundbundede polypropylenrør (Greiner, Tyskland). Fuldblodskulturer blev holdt ved 37 oC og 5 % CO2 i de angivne tidsperioder. Derefter blev cellefri plasma/RPMI-prøver opnået ved centrifugering og opbevaret ved -70oC indtil vurdering af cytokinkoncentrationer ved enzymforbundet immunosorbent-essay (ELISA). Eksperimenter blev startet inden for 60 minutter efter blodudtagning. Fuldblodskulturerne bestod således af hele rækken af ​​hvide blodlegemer samt erytrocytter. Bortset fra bestemmelse af IL-1β-frigivelse blev kulturer enten holdt som ustimuleret kontrol eller stimuleret med LPS (10 eller 100 ng/ml) eller med kombinationen af ​​IL-1β plus TNF-α (50 ng/ml hver) i 24 timer . Til bestemmelse af IL-1β-frigivelse blev celler holdt som ustimuleret kontrol eller blev stimuleret med Toll-lignende receptor 4-ligand LPS (100 ng/ml) i i alt 5 timer. For effektiv frigivelse af IL-1β fra aktiverede kulturer blev LPS kombineret med ATP (2 mM), som blev tilsat i løbet af de sidste 2 timer af stimuleringsperioden på 5 timer for at opnå aktivering af purinoreceptoren P2X7.

Analyse af cytokinfrigivelse ved ELISA-analyse Koncentrationer af IL-8, IL-6, interferon-inducerbart protein (IP)-10, interferon (IFN) gamma (Pharmingen/BD Biosciences) og IL-1β, (F&U-systemer), i plasma/RPMI-prøver blev bestemt ved ELISA i henhold til producentens instruktioner.

Statistik Den enkelte patient eller proband blev defineret som statistisk enhed. Data er vist som median med interkvartilområde og præsenteres som pg/ml (IL-1β, IL-6, IP-10) eller som ng/ml (IL-8). Medianer blev sammenlignet mellem PLS-patienter og raske frivillige ved hjælp af den ikke-parametriske Mann Whitney U-test. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af et computerprogram (Systat for Windows version 10.0, Systat Inc., Evanston, IL, USA).