Cytokiner i Papillon-Lefèvre syndrom

MATERIALE OG METODER Materialer Lipopolysakkarid (LPS; Escherichia coli, serotype R515) ble kjøpt fra Alexis (Lausen, Sveits) og adenosintrifosfat (ATP) fra Sigma (Deisenhofen, Tyskland). Tumornekrosefaktor α (TNF-α) ble vennlig levert av Knoll AG (Ludwigshafen, Tyskland). IL-1β var fra Invitrogen/Biosource (Karlsruhe, Tyskland).

Pasienter og friske givere Fem pasienter med etablert diagnose PLS er under periodontal behandling ved avdeling for periodontologi, senter for tann-, oral- og kjevemedisin (Carolinum) ved Johann Wolfgang Goethe-Universitetet Frankfurt am Main. Antiinfeksjonsbehandling med tilleggsantibiotika har blitt gitt til dem alle, og de er under regelmessig og hyppig støttebehandling. Avdeling for periodontologi har kontakt med ytterligere 5 PLS-pasienter som er tannløse eller under periodontalbehandling andre steder. Alle pasientene gjennomgikk komplette muntlige undersøkelser samt inspeksjon av huden på håndflatene og sålene. Hver voksen pasient eller foreldre mottok klinisk og genetisk veiledning, og signerte et samtykkeskjema, godkjent av de etiske komiteene ved universitetene i Dresden og Frankfurt/Main. Kliniske data og mutasjoner fra alle pasienter er rapportert tidligere. Alle disse pasientene ble invitert til å delta i denne studien. Friske givere hadde avstått fra å ta medikamenter i to uker før studien. På grunn av utbredt bruk av p-piller ble kun mannlige probander valgt. Studien var i samsvar med reglene i Helsinki-erklæringen og ble godkjent av Institutional Review Board for Human Studies ved det medisinske fakultetet ved Johann Wolfgang Goethe-University Frankfurt/Main (Søknad nr. 31/05). Alle deltakende individer ble informert om risikoer og fordeler samt prosedyrene for studien og ga skriftlig informert samtykke.

Helblodskultur Heparinisert blod ble blandet med et likt volum kulturmedium (RPMI 1640 supplert med 25 mM HEPES (2-[4-(2-hydroksyetyl)piperazin-1-yl]etansulfonsyre), 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin) og 1 ml alikvoter ble overført til løst forseglede rundbunnede polypropylenrør (Greiner, Tyskland). Helblodskulturer ble holdt ved 37 oC og 5 % CO2 i de angitte tidsperiodene. Deretter ble cellefrie plasma/RPMI-prøver oppnådd ved sentrifugering og lagret ved -70oC inntil vurdering av cytokinkonsentrasjoner ved enzymkoblet immunosorbent-essay (ELISA). Eksperimenter ble startet innen 60 minutter etter bloduttak. Dermed bestod helblodskulturene av hele spekteret av hvite blodlegemer samt erytrocytter. Bortsett fra bestemmelse av IL-1β-frigjøring, ble kulturer enten holdt som ustimulert kontroll eller stimulert med LPS (10 eller 100 ng/ml), eller med kombinasjonen av IL-1β pluss TNF-α (50 ng/ml hver) i 24 timer . For bestemmelse av IL-1β-frigjøring ble cellene holdt som ustimulert kontroll eller ble stimulert med Toll-lignende reseptor 4-ligand LPS (100 ng/ml) i totalt 5 timer. For effektiv frigjøring av IL-1β fra aktiverte kulturer ble LPS kombinert med ATP (2 mM) som ble tilsatt i løpet av de siste 2 timene av 5 timers stimuleringsperioden for å oppnå aktivering av purinoreseptoren P2X7.

Analyse av cytokinfrigjøring ved ELISA-analyse Konsentrasjoner av IL-8, IL-6, interferon-induserbart protein (IP)-10, interferon (IFN) gamma (Pharmingen/BD Biosciences), og IL-1β, (FoU-systemer), i plasma/RPMI-prøver ble bestemt ved ELISA i henhold til produsentens instruksjoner.

Statistikk Den enkelte pasient eller proband ble definert som statistisk enhet. Data er vist som median med interkvartilt område og presenteres som pg/ml (IL-1β, IL-6, IP-10) eller som ng/ml (IL-8). Medianer ble sammenlignet mellom PLS-pasienter og friske frivillige ved bruk av den ikke-parametriske Mann Whitney U-testen. Statistisk analyse ble utført ved bruk av et dataprogram (Systat for Windows versjon 10.0, Systat Inc., Evanston, IL, USA).