Prognostická hodnota detekce PIF v kultivačním médiu embrya Korelace s výsledkem těhotenství (PIF-SET1)

Cílem navrhovaného projektu je prozkoumat neinvazivní biomarker, PIF (Preimplantační faktor), 15aminokyselinový peptid (MVRIKPGSANKPSDD) vylučovaný pouze životaschopnými embryi a placentou (Stamakin et al. RBE 2011).

PIF pozitivní embrya budou schopna dorůst do stadia blastocysty a hladiny PIF by mohly být markerem progresivního těhotenství. Budeme měřit hladiny PIF v kultivačním médiu IVF před embryotransferem, abychom korelovali těhotenství IVF s hladinami PIF. Naším cílem bude definovat PIF jako biomarker pro životaschopná embrya s cílem zvýšit míru úspěšnosti IVF po SET. Úrovně PIF budou zpětně vyhodnoceny po 500 SET.

Naše čtyři reprodukční centra provedou ročně asi 200 SET a více než 500 in vitro fertilizací.

U žen vybraných pro SET budou hladiny PIF hodnoceny ve všech kultivačních médiích embryí a později jeden a dva týdny po každém přenosu čerstvých nebo rozmražených zmrazených embryí do mateřského séra. Přenosy embryí budou prováděny naslepo k výsledkům PIF. SET nebo MET budou založeny na klinickém hodnocení a konvenčních kritériích pro embryo. U těchto žen bude také hodnocen PIF a porovnán s hladinou βhCG v mateřském séru.

Hodnocení PIF bude provedeno pomocí specifické protilátky označené fluorescenčním barvivem ve čtečce Luminex.

Specifický cíl 1 nám umožní vyhodnotit:

• Prediktivní hodnota PIF na frekvenci implantace
• Prediktivní hodnota PIF pro těhotenství Metodika Všechny ženy budou plně informovány a bude řádně získán písemný souhlas s účastí ve studii.

Postup in vitro Oocyty byly získány po přirozeném cyklu nebo po ovariální hyperstimulaci, která bude provedena pomocí upraveného dlouhého protokolu. Odebrané oocyty budou oplodněny klasickým IVF nebo ICSI. Oplodnění bude potvrzeno pozorováním 2 pronukleí a dvou polárních tělísek po 16-18 hodinách. Oplodněné oocyty budou kultivovány v 60 μl kultivačního média pod olejem. Transfer embrya bude proveden 72 hodin po IVF nebo ICSI proceduře (v den D3) bez výsledku PIF. Před transferem bude kvalita embrya hodnocena podle počtu buněk, kinetiky štěpení a rychlosti fragmentace. U žen, které budou mít SET, budou podle klinických kritérií (věk, hladina FSH atd.) zbývající kvalitní embrya zmražena a rozmražena po přípravě dělohy v dalších pokusech. Všechny zbývající kultivační supernatanty (50–60 μl) budou odebrány, přeneseny do zkumavek s 8 stripy o objemu 0,2 ml a uloženy při -80 °C, dokud nebudou testovány na PIF (M) Získání mateřského séra

Mateřské sérum bude odebráno:

• před odběrem oocytů v průběhu sérové ​​kontroly ovariální hyperstimulace (S0)
• týden po převodu (S1)
• dva týdny po přenosu během sériových měření lidského β-choriového gonadotropinu (S2) Hodnocení hladiny PIF Hladiny PIF v supernatantech kultur a v mateřském séru budou měřeny retrospektivně pomocí kompetitivního testu na bázi perliček pro použití v systému Luminex 200 IS. Výsledky jsou prezentovány jako střední intenzita fluorescence (MFI). Hladiny PIF byly odvozeny ze standardní křivky pomocí 5parametrové logistické křivky. Práh detekce byl stanoven měřením pozadí z kultivačního média nebo samotného mateřského séra s použitím průměru + 2 SD jako mezní hodnoty (18,7 ng/ml).

Analýza Korelujte detekci PIF v embryonálním séru s životaschopností embrya. Výsledky detekce PIF v embryonálních supernatantech budou korelovány s výsledkem těhotenství.

Srovnání se selekcí embryí pomocí PIF+ vs. PIF- embryí, za použití samotné morfologie a pomocí morfologie kombinované s přítomností PIF.

Srovnání mezi skupinami bude provedeno pomocí chí-kvadrát analýzy a p<0,05 bude považováno za statisticky významné.

Kritéria zařazení/vyloučení

Kritéria pro zařazení:

Všechny ženy zařazené do našich center pro klasické IVF nebo ICSI, které podepíší písemný souhlas s účastí ve studii. Hodnocení hladiny PIF v kultivačních médiích (M) a prognóza těhotenství (S1 a S2) bude provedeno pouze u žen se SET.

Kritéria vyloučení Ženy, které se odmítnou zúčastnit programu. Plánovaná hodnocení (tabulka časů a událostí) Celkový projekt je plánován tak, že bude proveden prostřednictvím pětikrokového pracovního plánu, ve kterém budeme zkoumat použití PIF jako biomarkeru pro lepší selekci embryí (budou zahrnuty pouze ženy se SET) a jako marker časného těhotenství v mateřském séru.