Valore prognostico del rilevamento di PIF nella correlazione dei mezzi di coltura embrionale con l'esito della gravidanza (PIF-SET1)

Lo scopo del progetto proposto è quello di studiare un biomarcatore non invasivo, PIF (PreImplantation Factor), un peptide di 15 amminoacidi (MVRIKPGSANKPSDD) secreto solo da embrioni vitali e placenta (Stamakin et al. RBE 2011).

Gli embrioni PIF positivi saranno in grado di crescere fino allo stadio di blastocisti e i livelli di PIF potrebbero essere un marker di gravidanza progressiva. Misureremo i livelli di PIF nei terreni di coltura IVF prima del trasferimento dell'embrione per correlare la gravidanza IVF con i livelli di PIF. Il nostro obiettivo sarà definire il PIF come un biomarcatore per embrioni vitali al fine di aumentare i tassi di successo della fecondazione in vitro dopo SET. I livelli di PIF saranno valutati retrospettivamente dopo 500 SET.

I nostri quattro centri riproduttivi eseguono circa 200 SET all'anno e più di 500 fecondazioni in vitro.

Per le donne selezionate per un SET, i livelli di PIF saranno valutati in tutti i terreni di coltura degli embrioni e successivamente a una e due settimane dopo ogni trasferimento di embrioni freschi o congelati nel siero materno. I trasferimenti di embrioni verranno eseguiti in cieco rispetto ai risultati del PIF. SET o MET si baseranno sulla valutazione clinica e sui criteri embrionali convenzionali. Per queste donne sarà valutato anche il PIF e confrontato con il livello di βhCG nel siero materno.

La valutazione del PIF verrà eseguita utilizzando un anticorpo specifico contrassegnato con un colorante fluorescente, nel lettore Luminex.

Obiettivo Specifico Uno ci permetterà di valutare:

• Valore predittivo PIF sul tasso di impianto
• Valore predittivo del PIF sulla gravidanza Metodologia Tutte le donne saranno pienamente informate e sarà debitamente ottenuto un consenso scritto alla partecipazione allo studio.

Procedura in vitro Gli ovociti sono stati recuperati dopo il ciclo naturale o dopo l'iperstimolazione ovarica che verrà eseguita utilizzando il protocollo lungo modificato. Gli ovociti raccolti saranno fecondati mediante fecondazione in vitro classica o ICSI. La fecondazione sarà confermata dall'osservazione di 2 pronuclei e di due corpi polari, dopo 16-18 ore. Gli ovociti fecondati saranno coltivati ​​in 60μl di terreno di coltura sott'olio. Il trasferimento dell'embrione verrà eseguito 72 ore dopo la procedura di fecondazione in vitro o ICSI (al giorno D3) senza risultato PIF. Prima del trasferimento, la qualità dell'embrione sarà valutata in base al numero di cellule, alla cinetica di scissione e al tasso di frammentazione. Per le donne che avranno un SET, in base a criteri clinici (età, livello di FSH, ecc...) gli embrioni rimanenti di buona qualità saranno congelati e scongelati dopo la preparazione uterina in ulteriori tentativi. Tutti i surnatanti di coltura rimanenti (50-60 μl) verranno raccolti, trasferiti in provette da 8 strisce da 0,2 ml e conservati a -80 ° C fino a quando non testeranno per PIF (M) Recupero del siero materno

Il siero materno sarà raccolto:

• prima del prelievo degli ovociti nel corso di un controllo sierico dell'iperstimolazione ovarica (S0)
• una settimana dopo il trasferimento (S1)
• due settimane dopo il trasferimento durante misurazioni seriali della gonadotropina β-corionica umana (S2) Valutazione del livello di PIF I livelli di PIF nei surnatanti di coltura e nel siero materno saranno misurati retrospettivamente, utilizzando un test competitivo basato su microsfere per l'uso nel sistema Luminex 200 IS. Risultati presentati come intensità di fluorescenza mediana (MFI). I livelli PIF sono stati derivati ​​dalla curva standard utilizzando una curva logistica a 5 parametri. La soglia di rilevazione è stata stabilita misurando il background dai terreni di coltura o dal solo siero materno, utilizzando la media+2 DS come valore limite (18,7 ng/ml).

Analisi Correlare il rilevamento di PIF nel siero dell'embrione con la vitalità dell'embrione. I risultati della determinazione del PIF nei sopranatanti embrionali saranno correlati con l'esito della gravidanza.

Confronto con la selezione degli embrioni da parte di embrioni PIF+ vs PIF-, utilizzando solo la morfologia e la morfologia combinata con la presenza di PIF.

I confronti tra i gruppi saranno eseguiti utilizzando l'analisi chi-quadrato e p<0.05 sarà considerato statisticamente significativo.

Criteri di inclusione/esclusione

Criterio di inclusione:

Tutte le donne inserite nei nostri centri per FIVET classica o ICSI, che firmeranno il consenso scritto a partecipare allo studio. La valutazione del livello di PIF nei terreni di coltura (M) e la prognosi della gravidanza (S1 e S2) saranno effettuate solo per le donne con SET.

Criteri di esclusione Donne che rifiuteranno di partecipare al programma. Valutazioni pianificate (tabella dei tempi e degli eventi) Il progetto complessivo è pianificato per essere realizzato attraverso un piano di lavoro in cinque fasi in cui studieremo l'uso del PIF come biomarcatore per una migliore selezione degli embrioni (saranno incluse solo donne con SET) e come marker di gravidanza precoce nel siero materno.