Valor prognóstico da detecção de PIF na correlação do meio de cultura de embriões com o resultado da gravidez (PIF-SET1)

O objetivo do projeto proposto é investigar um biomarcador não invasivo, PIF (Fator de Pré-Implantação), um peptídeo de 15 aminoácidos (MVRIKPGSANKPSDD) secretado apenas por embriões viáveis ​​e placenta (Stamakin et al. RBE 2011).

Os embriões PIF positivos serão capazes de crescer até o estágio de blastocisto e os níveis de PIF podem ser um marcador de gravidez progressiva. Mediremos os níveis de PIF em meios de cultura de fertilização in vitro antes da transferência de embriões para correlacionar a gravidez de fertilização in vitro com os níveis de PIF. Nosso objetivo será definir o PIF como um biomarcador para embriões viáveis, a fim de aumentar as taxas de sucesso da fertilização in vitro após o SET. Os níveis de PIF serão avaliados retrospectivamente após 500 SET.

Nossos quatro centros reprodutivos realizam cerca de 200 SET por ano e mais de 500 fertilizações in vitro.

Para as mulheres selecionadas para um SET, os níveis de PIF serão avaliados em todos os meios de cultura de embriões e, posteriormente, uma e duas semanas após cada transferência de embriões congelados frescos ou descongelados em soro materno. As transferências de embriões serão feitas cegas para os resultados do PIF. SET ou MET será baseado na avaliação clínica e nos critérios embrionários convencionais. Para essas mulheres, o PIF também será avaliado e comparado com o nível de βhCG no soro materno.

A avaliação do PIF será realizada utilizando anticorpo específico marcado com corante fluorescente, em leitor Luminex.

O Objetivo Específico Um nos permitirá avaliar:

• Valor preditivo do PIF na taxa de implantação
• Valor preditivo do FIP na gravidez Metodologia Todas as mulheres serão totalmente informadas e um consentimento por escrito para participar do estudo será devidamente obtido.

Procedimento in vitro Os oócitos foram recuperados após ciclo natural ou após hiperestimulação ovariana que será realizada utilizando o protocolo longo modificado. Os oócitos coletados serão fertilizados por FIV clássica ou ICSI. A fertilização será confirmada pela observação de 2 pró-núcleos e dois corpos polares, após 16-18 horas. Os ovócitos fertilizados serão cultivados em 60μl de meio de cultura sob óleo. A transferência de embriões será realizada 72 horas após o procedimento de FIV ou ICSI (no dia D3) sem resultado de PIF. Antes da transferência, a qualidade do embrião será avaliada de acordo com o número de células, cinética de clivagem e taxa de fragmentação. Para as mulheres que terão um SET, de acordo com critérios clínicos (Idade, nível de FSH, etc…) os embriões remanescentes de boa qualidade serão congelados e descongelados após preparo uterino em tentativas posteriores. Todos os sobrenadantes de cultura restantes (50-60μl) serão coletados, transferidos para tubos de 0,2 ml de 8 tiras e armazenados a -80C até que sejam testados para PIF (M) Recuperação de soro materno

O soro materno será coletado:

• antes da captação de ovócitos durante o sorocontrole da hiperestimulação ovariana (S0)
• uma semana após a transferência (S1)
• duas semanas após a transferência durante medições seriadas de gonadotrofina β-coriônica humana (S2) Avaliação do nível de PIF Os níveis de PIF em sobrenadantes de cultura e no soro materno serão medidos retrospectivamente, usando um ensaio competitivo baseado em esferas para uso no sistema Luminex 200 IS. Resultados apresentados como intensidade de fluorescência mediana (MFI). Os níveis de PIF foram derivados da curva padrão usando uma curva logística de 5 parâmetros. O limiar de detecção foi estabelecido medindo o fundo do meio de cultura ou soro materno sozinho, usando média + 2DP como corte (18,7 ng/ml).

Análise Correlacione a detecção de PIF no soro do embrião com a viabilidade do embrião. Os resultados da detecção de PIF em sobrenadantes de embriões serão correlacionados com o resultado da gravidez.

Comparação com seleção de embriões por embriões PIF+ vs PIF-, usando apenas morfologia, e por morfologia combinada com a presença de PIF.

As comparações entre os grupos serão realizadas por meio da análise qui-quadrado e p<0,05 será considerado estatisticamente significativo.

Critérios de inclusão/exclusão

Critério de inclusão:

Todas as mulheres incluídas em nossos centros de fertilização in vitro clássica ou ICSI, que assinarão o consentimento por escrito para participar do estudo. A avaliação do nível de PIF em meio de cultura (M) e prognóstico de gravidez (S1 e S2) será feita apenas para mulheres com SET.

Critérios de exclusão Mulheres que se recusarão a participar do programa. Avaliações planejadas (tabela de horários e eventos) O projeto geral está planejado para ser realizado por meio de um plano de trabalho de cinco etapas, no qual investigaremos o uso de PIF como biomarcador para melhor seleção de embriões (apenas mulheres com SET serão incluídas) e como um marcador de gravidez precoce no soro materno.