Molekulární chorobný profil hematologických malignit (RELab1)

1. POZADÍ

   Molekulární medicína je oborem vědění, jehož účelem je objasnit genetický základ onemocnění, zlepšit diagnostickou definici a prognostické hodnocení pacientů a přispět k rozvoji inovativních léčebných postupů. Genomické informace se stále více používají v procesu rozhodování o léčbě jednotlivých pacientů. Klinická implementace molekulární medicíny vyžaduje systematické přístupy založené na integraci vědeckých, lékařských a technologických odborných znalostí.

   Mezi hematologické malignity patří leukémie, lymfom a mnohočetný myelom. Molekulární podstata mnoha hematologických novotvarů je stále neznámá. V současnosti vědci vědí, že hematologické malignity jsou většinou dynamická onemocnění, která vznikají z velké řady primárních a sekundárních biologických a genetických událostí (tj. mutace řidiče a spolujezdce). Identifikace klíčových molekulárních změn, které řídí vývoj a progresi nádoru, je nezbytná pro vývoj nových cílených a personalizovaných terapií.

   Hematologické malignity se typicky vyskytují u starších lidí a v důsledku stárnutí populace představují rostoucí kritický problém pro zdravotní politiku. Hematologické malignity jsou ideálním kontextem pro realizaci molekulární medicíny. Paradigmatickým příkladem je chronická myeloidní leukémie, u které se objev molekulárního základu (fúzní gen BCR/ABL1) přenesl do velkého klinického pokroku v diagnostice, léčbě a monitorování onemocnění.

   Klasifikace myeloidních a lymfoidních novotvarů Světové zdravotnické organizace (WHO) publikovaná v roce 2008 zavedla mnoho genetických změn do diagnostické definice rakoviny krve. Od roku 2008 bylo identifikováno mnoho genetických lézí u mnoha hematologických malignit a příští klasifikace WHO bude zahrnovat mnoho z nich.

   K těmto zjištěním nejlépe přispěly techniky sekvenování nové generace (NGS).

   NGS využívá špičkové technologické nástroje, které dokážou sekvenovat v krátkém čase a s relativně nízkými náklady celý genom nebo jeho specifickou část (např. exom nebo cílené geny). Výhoda NGS oproti standardnímu sekvenování spočívá ve vyšší účinnosti (velké množství genů rychle analyzovaných ve velkém množství vzorků) a vyšší citlivosti (kapacita detekce mutací ve velmi malých klonech neoplastických buněk). V posledních letech dostupnost nových technologií pro genomiku umožnila vysoce výkonný screening somatických mutací u hematologických malignit. Očekává se, že výsledky těchto studií významně zlepší management jednotlivých pacientů prostřednictvím implementace inovativních diagnostických/prognostických systémů a rozvoje terapeutických strategií založených na individuálním genomovém profilu.

   Oddělení hematologické onkologie, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo a University of Pavia významně přispěly k definování molekulární podstaty hematologických malignit. V roce 2005 University of Pavia popsala diagnostický a prognostický význam mutace JAK2 V617F u myeloproliferativních novotvarů (MPN): tato mutace byla zařazena do WHO klasifikace MPN a byly vyvinuty inovativní léky proti JAK2. V roce 2010 se University of Pavia připojila k Cancer Genome Project, konsorciu mezinárodních výzkumných center koordinovaných Wellcome Trust Sanger Institute of Cambridge s cílem objasnit molekulární podstatu rakoviny. V tomto kontextu byly pomocí masivního sekvenování genomu popsány rekurentní mutace v genu SF3B1 - který kóduje hlavní složku mechanismu sestřihu RNA - u myelodysplastických syndromů.

   Navíc v posledních letech významně přispěli vědci z University of Pavia k definici molekulární podstaty lymfoidních novotvarů (tj. mutace BRAF V600E u vlasatobuněčné leukémie, mutace MYD88 L265P u Waldenstromovy choroby a mutace SF3B1 u chronické lymfocytární leukémie ). A konečně, v posledních měsících měla Univerzita v Pavii klíčovou roli v identifikaci mutací CALR v JAK2-negativních MPN. To je opět důležitý poznatek v pochopení genetického základu těchto skupin nemocí.

   Kromě implementace technik nové generace (NGS) pro genomickou analýzu je zjevně potřeba vyvinout účinná řešení pro analýzu a integraci molekulárních a klinických dat velkých populací pacientů, aby bylo možné plně porozumět vztahu mezi genotypem a klinický projev nemoci.

   Implementace molekulární medicíny vyžaduje systematické přístupy založené na integraci vědeckých, klinických a technologických odborných znalostí. V Itálii představují ideální kontext pro rozvoj programů molekulární medicíny hematologické regionální sítě. Představují inovativní model organizace a spolupráce, založený na propojování zdravotnických zařízení. The Rete Ematologica Lombarda (REL, www.rel-lombardia.net) sdružuje 11 hematologických referenčních center a nedávno poskytla základ pro systematické studium těchto onemocnění. Strategickým cílem klinické sítě REL je zajistit lepší dostupnost zdravotnických zařízení, vysokou kvalitu služeb a kontinuitu péče o všechny hematologické pacienty.

   Klinická síť REL může zásadním způsobem přispět k translačnímu výzkumu hematologických malignit a nedávno za tímto účelem Regione Lombardia v lednu 2014 financoval biotechnologický klastr pro implementaci genomické analýzy a vývoj nových způsobů léčby hematologických onemocnění. Biotechnologický klastr REL (www.relab-lombardia.net) zahrnuje Klinika hematologické onkologie, Fondazione IRCCS Policlinico S. Matteo, University of Pavia, biotechnologická společnost Clonit (www.clonit.it) a farmaceutická společnost Novartis. Tento klastr si klade za cíl prozkoumat molekulární podstatu hematologických malignit a vyvinout personalizovanou léčbu.

2. OBECNÝ ÚČEL STUDIE

   V této studii oddělení hematologické onkologie, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia ve spolupráci s University of Pavia a IRCCS Fondazione Maugeri, Pavia poskytne systematickou analýzu genových mutací u hematologických malignit pomocí technik NGS.

   Zařazeni budou pacienti s průkaznou diagnózou hematologických malignit podle kritérií WHO odkazující se na klinickou síť REL. Výzkumníci budou analyzovat genomovou DNA a RNA extrahovanou z hematopoetických buněk v různých časových bodech onemocnění pacienta. Studie uvažuje o použití dvou optimalizovaných molekulárních platforem zaměřených na identifikaci rekurentních mutací v myeloidních a lymfoidních novotvarech, v daném pořadí.

   Screening genových mutací pomocí NGS bude prospektivně implementován v kontextu klinické sítě REL. Vzorky pacientů budou analyzovány při diagnóze a následně v průběhu onemocnění ve specifických časových bodech.

   Výzkumníci budou analyzovat korelace mezi somatickými mutacemi, specifickými klinickými fenotypy (podle klasifikace WHO) a vývojem onemocnění. To umožní: 1) identifikovat nové rekurentní genetické mutace zapojené do molekulární patogeneze hematologických malignit; 2) definovat roli mutovaných genů, rozlišovat mezi geny, které indukují klonální proliferaci hematopoetických kmenových buněk, a geny, které určují klinický fenotyp onemocnění; 3) identifikovat mutace, které jsou zodpovědné za vývoj onemocnění; 4) definovat diagnostickou/prognostickou roli identifikovaných mutací a aktualizovat současnou klasifikaci onemocnění a prognostické skóre zahrnutím molekulárních parametrů.

   Bude zajištěna systematická biobanka biologického materiálu.

3. CÍLE

   Obecným cílem studie je provést systematickou analýzu genových mutací spojených s hematologickými malignitami pomocí přístupu cíleného sekvenování NGS.

4. KONCOVÉ BODY:

   • Kumulativní výskyt (%) genových mutací v hlavním klonu a subklonech u každé hematologické malignity
   • Genotyp - fenotypové korelace mezi klinickými charakteristikami a mutačním stavem, hodnocené Fisherovým exaktním testem (pro kategorické proměnné) nebo Mann-Whitney nebo Kruskall-Wallis testem (pro kvantitativní proměnné srovnávané ve dvou nebo více skupinách pacientů, v tomto pořadí) s p-hodnota
   • Celkové přežití a přežití bez onemocnění podle klinických a biologických rizikových faktorů při diagnóze a během vývoje onemocnění, hodnocené metodou Kaplan-Meierova limitu produktu a Coxovým modelem proporcionálního rizika jak pro časově závislé, tak časově nezávislé kovariáty
5. VÝBĚR PACIENTŮ:

Kritéria pro zařazení:

• Jednoznačná diagnóza myeloidního nebo lymfoidního novotvaru podle kritérií WHO z roku 2008
• věk ≥ 18 let. Horní věková hranice není stanovena
• podepsaný písemný informovaný souhlas

Kritéria vyloučení:

• těžká neurologická nebo psychiatrická porucha narušující schopnost dát informovaný souhlas
• žádný písemný informovaný souhlas

• žádný souhlas s biobankovnictvím

  7. DESIGN STUDIE :

Jedná se o multicentrickou, prospektivní, observační studii. Zařazeni jsou všichni pacienti s diagnózou hematologické malignity podle klasifikace WHO provedené v rámci klinické sítě REL.

8. ASPEKTY SPRÁVNÉ KLINICKÉ PRAXE, OCHRANA OSOBNÍCH ÚDAJŮ

Biobanking se řídí obecným regulačním rámcem pro biomedicínský výzkum. Jedná se o mozaiku formálních právních nástrojů a regulačních orgánů zavedených na vnitrostátní a evropské úrovni, jakož i neformálnější typy nástrojů a nástrojů správy a řízení, jako jsou odborné pokyny a osvědčené postupy. Regulaci biomedicínského výzkumu tvoří závazné i nezávazné právní nástroje na národní i evropské úrovni. Je to ve formě zvláštního práva pro lékařský výzkum – například Úmluva Rady Evropy z Ovieda z roku 1997 – a obecnějších právních nástrojů – jako jsou lidská práva a právo na ochranu údajů – z nichž některé mají význam pro biobanking. Odpovědnost za dohled nad výzkumem a zajištění souladu s právními požadavky byla z velké části přenesena na vnitrostátní orgány, jako jsou etické komise výzkumu.

8.1 SBĚR DAT

Studie uvažuje o sběru klinických a biologických nepostradatelných dat pro přesnou diagnostickou a prognostickou standardní definici v ad-hoc elektronickém CRF a analýzu specifických genů, které mohou být zapojeny do molekulární podstaty onemocnění pomocí technik NGS.

8.2 KLINICKÝ DATOVÝ SKLAD (Informatika pro integraci biologie a lůžka, I2B2)

Informatika pro integraci biologie a lůžka (i2b2, www.i2b2.org) je open source klinický datový sklad, který je efektivně dotazován za účelem nalezení souborů zajímavých pacientů, kteří si chrání své soukromí prostřednictvím rozhraní dotazovacího nástroje. V rámci této architektury jsou interoperabilní softwarové objekty na straně serveru, nazývané „buňky“, schopny vyměňovat si informace mezi sebou, přičemž se spoléhají na technologii webových služeb.

Za účelem podpory a zlepšení účinnosti klinického výzkumu v onkologii vyvinula Univerzita v Pavii a IRCCS Fondazione Salvatore Maugeri z Pavie novou platformu ICT nazvanou Onco-i2b2, která je založena na softwaru i2b2 a je nainstalována v IRCCS Fondazione. S. Maugeri, Pavia. Onco-i2b2 je schopen integrovat data z různých zdrojů v rámci datového skladu i2b2 prostřednictvím implementace komplexní IT architektury, která zahrnuje vývoj nových i2b2-buněk pro analýzu dat.

Výsledkem tohoto projektu bylo nemocničním výzkumníkům umožněno získat informace z patologické databáze, ze systému řízení biobanky a sloučit je s klinickými informacemi přítomnými v nemocničním informačním systému za účelem výběru zajímavých pacientů se specifickým fenotypem zájem.

8.3 TECHNICKÝ POPIS PROCESU PSEUDONYMIZACE A POUŽITÉ NÁSTROJE

Specifická regulace na národní úrovni pro technické aspekty týkající se biobanky ve skutečnosti neexistuje, ale některé pracovní skupiny odborníků (např. AIOM a SIAPEC-IAP) zahájily iniciativy pro definování a harmonizaci stávajících národních obecných postupů. Stručný seznam konstrukčních a technologických požadavků lze nalézt v:

1. Definice programové dokumentace s cílem biobanky, funkční specifikace, která má být provedena, typ uchovaného materiálu, počet předpokládaných exemplářů, způsoby čerpání, zpracování a konzervace, řízení informací, transport a příjem vzorků z přijímací jednotky , řízení možného biologického rizika a ekonomický plán na středně dlouhé období
2. Logická definice vyhrazených míst, klimatizačních systémů a řízení přístupu. V závislosti na teplotě kryokontejnerů musí být nepřetržitě monitorována.
3. Musí být definován plán obnovy po havárii pro zařízení a kryokontejnery (např. použití systémů pro elektrickou kontinuitu nebo seznam kompetentního personálu, který by měl zasáhnout, když nastanou zvláštní události)
4. Pro každý krok různých postupů se doporučuje použití certifikovaného systému kvality, který sleduje kvalitu dat od získání informovaného souhlasu až po uložení vzorku
5. Definice specializovaného informačního systému pro správu vzorků biobanky související s klinickými informacemi uloženými v nemocničním informačním systému, pro sledování pohybu vzorků a aktualizaci následných dat odvozených z provedeného vědeckého výzkumu.
6. Musí být implementován plán obnovy po havárii také pro IT architekturu. Spočívá v inkrementálním zálohování všech dat biobanky, která umožňuje správcům IT systému obnovit všechny informace v libovolném časovém období. V onkologické biobance „Bruno Boerci“ je každý biologický vzorek identifikován specifickým kódem vytištěným na zkumavce pomocí čárový kód datové matrice (dvojrozměrný čárový kód čitelný pomocí laserového skeneru) a uložený v databázi biobanky a spravovaný softwarem pro správu biobanky, který také umožňuje zobrazit jeho polohu uvnitř kryonádoby biobanky. Klinická data pro každé sledování jsou shromažďována automaticky načítáním dat z nemocničního informačního systému. Klinická data a informace z biobanky jsou neustále a nepřetržitě vkládány do klinického datového skladu postupem automatické aktualizace. Klinická a patologická data jsou kodifikována pomocí standardů SNOMED, ​​TNM a ICD9-CM. Použití systému BRISQ pro standardizaci dat (Biospecimen Reporting for Improved Study Quality, Biopreservation and Biobanking, 2011) se doporučuje, ale zatím není implementováno.

8.4 PŘEDÁVÁNÍ VZORKŮ PACIENTŮ A VSTUP VZORKŮ BIOBANK

Aby byla zajištěna vysoká úroveň ochrany osobních údajů, musí být provedena anonymizace biologických vzorků (nebo lépe deidentifikace). Terminologie používaná v evropských dokumentech identifikuje pojem „anonymizovaný“, pokud je biologický materiál uchováván vedle souvisejících informací, jako je typ nádoru, lékařské ošetření, věk dárce atd., ale všechny informace, které by umožnily identifikaci účastníka výzkumu nebo pacient je odstraněn, a to buď nevratně (odpojeno anonymizováno) nebo reverzibilně (propojené anonymizováno). V případě propojených anonymizovaných vzorků je identifikace možná pomocí kódu, ke kterému výzkumníci ani jiní uživatelé materiálu – v rámci definice pojmu „reverzibilně/propojený anonymizovaný“ – nemají přístup. Kódované vzorky mají stejné vlastnosti jako propojené (reverzibilně) anonymizované vzorky, jediný rozdíl je v tom, že výzkumníci a uživatelé mají přístup ke kódu.

V tomto projektu je preferováno použití kódované anonymizace, aby byla zajištěna odpovídající úroveň zabezpečení soukromí a proveditelnost výzkumných činností.

Navrhovaná architektura, která bude implementovat tento typ deidentifikace, vyžaduje definici kódu, který identifikuje biovzorek od začátku, a druhého kódu, který bude vygenerován před uložením vzorku do biobanky. Třetí kód bude automaticky vygenerován během fáze akceptace vzorku a bude uložen na samostatném místě. Tímto způsobem jsou informace související s prvním kódem a informace související s posledním kódem zcela odděleny, pokud není znám třetí kód: k tomu dochází pouze tehdy, když výzkumníci potřebují přístup k oběma údajům současně.

9 MOLEKOLÁRNÍ ANALÝZA

Molekulární analýza se provádí za použití 2 různých platforem NGS pro resekvenování cíle. Platformy jsou nastíněny na základě nejnovější literatury o molekulární biologii myeloidních a lymfoidních novotvarů. Je pozoruhodné, že úsilí vědecké komunity v této oblasti je obrovské, což přispívá k neustálému toku nových informací a objevů s následnou možností modifikace platforem.