Molekulares Krankheitsprofil hämatologischer Malignome (RELab1)

1. HINTERGRUND

   Molekulare Medizin ist der Wissenszweig, dessen Ziel es ist, die genetischen Grundlagen der Krankheiten aufzuklären, die diagnostische Definition und prognostische Einschätzung von Patienten zu verbessern und zur Entwicklung innovativer Therapien beizutragen. Genomische Informationen werden zunehmend im Prozess der Behandlungsentscheidung für einzelne Patienten verwendet. Die klinische Umsetzung der Molekularen Medizin erfordert systematische Ansätze, die auf der Integration naturwissenschaftlicher, medizinischer und technologischer Expertisen beruhen.

   Hämatologische Malignome umfassen Leukämie, Lymphom und multiples Myelom. Die molekularen Grundlagen vieler hämatologischer Neoplasien sind noch unbekannt. Nach derzeitigem Kenntnisstand der Forscher wissen Wissenschaftler, dass hämatologische Malignome meist dynamische Erkrankungen sind, die aus einer großen Reihe von primären und sekundären biologischen und genetischen Ereignissen (d. h. Fahrer- und Beifahrermutationen). Die Identifizierung wichtiger molekularer Veränderungen, die die Tumorentwicklung und -progression vorantreiben, ist für die Entwicklung neuer zielgerichteter und personalisierter Therapien von entscheidender Bedeutung.

   Hämatologische Malignome treten typischerweise bei älteren Menschen auf und stellen aufgrund der Alterung der Bevölkerung ein zunehmend kritisches Problem für die Gesundheitspolitik dar. Hämatologische Malignome sind ein ideales Umfeld für die Umsetzung der Molekularen Medizin. Das paradigmatische Beispiel dafür ist die chronische myeloische Leukämie, bei der die Entdeckung der molekularen Grundlage (des Fusionsgens BCR/ABL1) zu großen klinischen Fortschritten in Diagnose, Behandlung und Krankheitsüberwachung geführt hat.

   Die 2008 veröffentlichte Klassifikation der Weltgesundheitsorganisation (WHO) für myeloische und lymphatische Neoplasien führte viele genetische Veränderungen in die diagnostische Definition von Blutkrebs ein. Seit 2008 wurden zahlreiche genetische Läsionen bei vielen hämatologischen Malignomen identifiziert, und die nächste WHO-Klassifikation wird viele davon umfassen.

   Techniken der Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) lieferten den besten Beitrag zu diesen Ergebnissen.

   NGS verwendet hochtechnologische Werkzeuge, die in kurzer Zeit und mit relativ geringen Kosten das gesamte Genom oder einen bestimmten Teil davon (z. Exom oder Zielgene). Der Vorteil der NGS gegenüber der Standardsequenzierung besteht in einer höheren Effizienz (eine große Menge an Genen wird schnell in einer großen Menge an Proben analysiert) und einer höheren Sensitivität (Mutationsnachweisfähigkeit in sehr kleinen Klonen neoplastischer Zellen). In den letzten Jahren hat die Verfügbarkeit neuer Technologien für die Genomik das Hochdurchsatz-Screening von somatischen Mutationen in hämatologischen Malignomen ermöglicht. Es wird erwartet, dass die Ergebnisse dieser Studien die Behandlung einzelner Patienten durch die Implementierung innovativer diagnostischer/prognostischer Systeme und die Entwicklung therapeutischer Strategien auf der Grundlage individueller genomischer Profile erheblich verbessern werden.

   Die Abteilung für Hämatologie und Onkologie, die Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo und die Universität Pavia haben maßgeblich zur Definition der molekularen Grundlagen hämatologischer Malignome beigetragen. 2005 beschrieb die Universität Pavia die diagnostische und prognostische Bedeutung der JAK2-V617F-Mutation bei myeloproliferativen Neoplasien (MPN): Diese Mutation wurde in die WHO-Klassifikation von MPN aufgenommen und innovative Anti-JAK2-Medikamente wurden entwickelt. Im Jahr 2010 trat die University of Pavia dem Cancer Genome Project bei, einem Konsortium internationaler Forschungszentren, das vom Wellcome Trust Sanger Institute of Cambridge koordiniert wird, um die molekularen Grundlagen von Krebs aufzuklären. In diesem Zusammenhang wurden mithilfe massiver Genomsequenzierung wiederkehrende Mutationen im SF3B1-Gen – das für eine Kernkomponente der RNA-Spleißmaschinerie kodiert – bei myelodysplastischen Syndromen beschrieben.

   Darüber hinaus leisteten Forscher der Universität Pavia in den letzten Jahren einen bedeutenden Beitrag zur Definition der molekularen Basis lymphoider Neoplasmen (d. h. BRAF-V600E-Mutation bei Haarzell-Leukämie, MYD88-L265P-Mutation bei Waldenstrom-Krankheit und SF3B1-Mutationen bei chronischer lymphatischer Leukämie). ). Schließlich spielte die Universität Pavia in den letzten Monaten eine Schlüsselrolle bei der Identifizierung von CALR-Mutationen in JAK2-negativen MPN. Dies ist wiederum eine wichtige Erkenntnis für das Verständnis der genetischen Grundlagen dieser Krankheitsgruppe.

   Neben der Implementierung von Techniken der nächsten Generation (NGS) für die Genomanalyse besteht eindeutig ein Bedarf an der Entwicklung effektiver Lösungen zur Analyse und Integration molekularer und klinischer Daten großer Patientenpopulationen, um die Beziehung zwischen Genotyp und Genotyp vollständig zu verstehen klinischer Ausdruck einer Krankheit.

   Die Umsetzung der Molekularen Medizin erfordert systematische Ansätze, die auf der Integration wissenschaftlicher, klinischer und technologischer Expertise basieren. In Italien bilden hämatologische regionale Netzwerke den idealen Kontext für die Entwicklung molekularmedizinischer Programme. Sie stellen ein innovatives Organisations- und Kooperationsmodell dar, das auf der Vernetzung von Gesundheitseinrichtungen basiert. Die Rete Ematologica Lombarda (REL, www.rel-lombardia.net) vereint 11 hämatologische Überweisungszentren und hat kürzlich die Grundlage für eine systematische Untersuchung dieser Krankheiten geschaffen. Das strategische Ziel des klinischen Netzwerks REL besteht darin, den besseren Zugang zu den Gesundheitseinrichtungen, die hohe Qualität der Dienstleistungen und die Kontinuität der Versorgung aller hämatologischen Patienten zu gewährleisten.

   Das klinische Netzwerk REL kann einen entscheidenden Beitrag zur translationalen Forschung zu hämatologischen Malignomen leisten, und zu diesem Zweck finanzierte die Regione Lombardia im Januar 2014 kürzlich einen Biotechnologie-Cluster für die Implementierung von Genomanalysen und die Entwicklung neuer Behandlungen für hämatologische Erkrankungen. Das Biotechnologie-Cluster REL (www.relab-lombardia.net) Beteiligt sind die Abteilung für Hämatologie und Onkologie, Fondazione IRCCS Policlinico S. Matteo, die Universität Pavia, das Biotech-Unternehmen Clonit (www.clonit.it) und das Pharmaunternehmen Novartis. Ziel dieses Clusters ist es, die molekularen Grundlagen hämatologischer Malignome zu untersuchen und personalisierte Therapien zu entwickeln.

2. ALLGEMEINER ZWECK der STUDIE

   In dieser Studie wird die Abteilung für Hämatologie-Onkologie, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia, in Zusammenarbeit mit der Universität Pavia und der IRCCS Fondazione Maugeri, Pavia, eine systematische Analyse von Genmutationen bei hämatologischen Malignomen unter Verwendung von NGS-Techniken bereitstellen.

   Patienten mit einer schlüssigen Diagnose hämatologischer Malignome gemäß WHO-Kriterien, die an das klinische Netzwerk REL verwiesen werden, werden aufgenommen. Die Forscher werden genomische DNA und RNA analysieren, die aus hämatopoetischen Zellen zu verschiedenen Krankheitszeitpunkten des Patienten extrahiert wurden. Die Studie erwägt die Verwendung von zwei optimierten molekularen Plattformen, die auf die Identifizierung rezidivierender Mutationen in myeloiden bzw. lymphoiden Neoplasmen abzielen.

   Das Screening von Genmutationen durch NGS wird prospektiv im Rahmen des klinischen Netzwerks REL implementiert. Patientenproben werden bei der Diagnose und sequentiell während des Krankheitsverlaufs zu bestimmten Zeitpunkten analysiert.

   Die Forscher werden die Korrelationen zwischen somatischen Mutationen, spezifischen klinischen Phänotypen (gemäß der WHO-Klassifikation) und der Krankheitsentwicklung analysieren. Dies ermöglicht: 1) die Identifizierung neuer wiederkehrender genetischer Mutationen, die an der molekularen Pathogenese hämatologischer Malignome beteiligt sind; 2) die Rolle mutierter Gene definieren, wobei zwischen Genen, die eine klonale Proliferation hämatopoetischer Stammzellen induzieren, und Genen, die den klinischen Phänotyp der Krankheit bestimmen, unterschieden wird; 3) Identifizierung von Mutationen, die für die Krankheitsentwicklung verantwortlich sind; 4) die diagnostische/prognostische Rolle der identifizierten Mutationen definieren und die aktuellen Krankheitsklassifikationen und prognostischen Scores aktualisieren, indem sie molekulare Parameter einbeziehen.

   Eine systematische Biobank von biologischem Material wird bereitgestellt.

3. ZIELE

   Das allgemeine Ziel der Studie ist die Durchführung einer systematischen Analyse von Genmutationen im Zusammenhang mit hämatologischen Malignomen unter Verwendung eines NGS-gezielten Sequenzierungsansatzes.

4. ENDPUNKTE:

   • Kumulative Inzidenz (%) von Genmutationen im Hauptklon und den Subklonen bei jeder hämatologischen Malignität
   • Genotyp - phänotypische Korrelationen zwischen klinischen Merkmalen und Mutationsstatus, ausgewertet durch den exakten Test von Fisher (für kategoriale Variablen) oder durch den Mann-Whitney- oder den Kruskall-Wallis-Test (für quantitative Variablen, die in zwei oder mehr Patientengruppen verglichen werden) mit p-Wert
   • Gesamtüberleben und krankheitsfreies Überleben gemäß klinischen und biologischen Risikofaktoren zum Zeitpunkt der Diagnose und während der Krankheitsentwicklung, bewertet mit der Kaplan-Meier-Produktlimitmethode und dem Cox-Proportional-Hazard-Modell sowohl für zeitabhängige als auch für nicht zeitabhängige Kovariaten
5. PATIENTENAUSWAHL:

Einschlusskriterien:

• Abschließende Diagnose einer myeloischen oder lymphatischen Neoplasie gemäß den WHO-Kriterien von 2008
• Alter ≥ 18 Jahre. Es gibt keine Altersobergrenze
• unterschriebene schriftliche Einverständniserklärung

Ausschlusskriterien:

• Schwere neurologische oder psychiatrische Störung, die die Fähigkeit beeinträchtigt, eine informierte Einwilligung zu geben
• keine schriftliche Einverständniserklärung

• keine Zustimmung zum Biobanking

  7. STUDIENDESIGN:

Dies ist eine multizentrische, prospektive Beobachtungsstudie. Alle Patienten mit einer Diagnose einer hämatologischen Malignität gemäß der WHO-Klassifikation, die innerhalb des klinischen REL-Netzwerks durchgeführt wurde, sollen aufgenommen werden.

8. ASPEKTE GUTE KLINISCHE PRAXIS, DATENSCHUTZ

Das Biobanking unterliegt den allgemeinen rechtlichen Rahmenbedingungen für die biomedizinische Forschung. Dies ist ein Mosaik aus formellen Rechtsinstrumenten und Regulierungsbehörden, die auf nationaler und europäischer Ebene eingerichtet wurden, sowie informelleren Arten von Governance-Instrumenten und -Instrumenten wie professionellen Leitlinien und bewährten Verfahren. Die Regulierung der biomedizinischen Forschung besteht aus verbindlichen und nicht verbindlichen Rechtsinstrumenten auf nationaler und europäischer Ebene. Dies geschieht in Form spezifischer Gesetze für die medizinische Forschung – zum Beispiel das Oviedo-Übereinkommen des Europarates von 1997 – und allgemeinere Rechtsinstrumente – wie Menschenrechts- und Datenschutzgesetze – von denen einige für das Biobanking relevant sind. Die Verantwortung für die Aufsicht über die Forschung und die Sicherstellung der Einhaltung der gesetzlichen Anforderungen wurde weitgehend an nationale Gremien, wie Forschungsethikkommissionen, delegiert.

8.1 DATENERHEBUNG

Die Studie erwägt die Sammlung klinischer und biologischer unverzichtbarer Daten für eine präzise diagnostische und prognostische Standarddefinition in einem elektronischen Ad-hoc-CRF und die Analyse spezifischer Gene, die durch NGS-Techniken an der molekularen Grundlage der Krankheiten beteiligt sein können.

8.2 CLINICAL DATA WAREHOUSE (Informatics for Integrating Biology and the Bedside, I2B2)

Informatics for Integrating Biology and the Bedside (i2b2, www.i2b2.org) ist ein klinisches Open-Source-Data Warehouse, das effizient abgefragt wird, um Gruppen interessanter Patienten zu finden, die ihre Privatsphäre über eine Abfragetool-Schnittstelle wahren. Innerhalb dieser Architektur können interoperable serverseitige Softwareobjekte, die als „Zellen“ bezeichnet werden, Informationen untereinander austauschen, wobei sie sich auf die Technologie von Webdiensten stützen.

Um die Effizienz der klinischen Forschung in der Onkologie zu unterstützen und zu verbessern, haben die Universität Pavia und die IRCCS-Fondazione Salvatore Maugeri aus Pavia eine neuartige IKT-Plattform namens Onco-i2b2 entwickelt und implementiert, die auf der i2b2-Software basiert und in der IRCCS-Fondazione installiert ist S. Maugeri, Pavia. Onco-i2b2 ist in der Lage, Daten aus verschiedenen Quellen innerhalb des i2b2 Data Warehouse durch die Implementierung einer komplexen IT-Architektur zu integrieren, die die Entwicklung neuer i2b2-Zellen für die Datenanalyse umfasst.

Als Ergebnis dieses Projekts konnten Krankenhausforscher Informationen aus der Pathologiedatenbank und einem Biobank-Managementsystem abrufen und mit den im Krankenhausinformationssystem vorhandenen klinischen Informationen zusammenführen, um interessante Patienten mit einem bestimmten Phänotyp auszuwählen Interesse.

8.3 TECHNISCHE BESCHREIBUNG DES PSEUDONYMISIERUNGSPROZESSES UND DER VERWENDETEN WERKZEUGE

Derzeit gibt es keine spezifische Regelung auf nationaler Ebene für technische Aspekte im Zusammenhang mit Biobanken, aber einige Arbeitsgruppen von Experten (z. AIOM und SIAPEC-IAP) haben Initiativen zur Definition und Harmonisierung der bestehenden nationalen allgemeinen Verfahren auf den Weg gebracht. Eine kurze Auflistung der strukturellen und technologischen Anforderungen findet sich in:

1. Definition einer programmatischen Dokumentation mit Zielsetzung der Biobank, auszuführenden Funktionsspezifikationen, Art des konservierten Materials, Anzahl der erwarteten Exemplare, Methoden der Entnahme, Verarbeitung und Konservierung, Informationsmanagement, Transport und Empfang der Exemplare von der empfangenden Einheit , Management des möglichen biologischen Risikos und ein Wirtschaftsplan für einen mittelgroßen Zeitraum
2. Logische Definition der dedizierten Lokale, Konditionierungssysteme und Zugangskontrolle. Außerdem muss die Temperatur der Kryobehälter kontinuierlich überwacht werden.
3. Notfallwiederherstellungsplan für Ausrüstung und Kryobehälter muss definiert werden (z. Verwendung von Systemen für die elektrische Kontinuität oder Liste von kompetentem Personal, das eingreifen sollte, wenn besondere Ereignisse eintreten)
4. Die Verwendung eines zertifizierten Qualitätssystems für jeden Schritt der verschiedenen Verfahren wird empfohlen, wobei die Datenqualität von der Einholung der Einwilligung nach Aufklärung bis zur Aufbewahrung der Probe verfolgt wird
5. Definition eines dedizierten Informationssystems für die Verwaltung der Biobankproben in Bezug auf die im Krankenhausinformationssystem gespeicherten klinischen Informationen, um die Probenbewegungen zu verfolgen und die Folgedaten zu aktualisieren, die sich aus der durchgeführten wissenschaftlichen Forschung ergeben.
6. Disaster-Recovery-Plan auch für die IT-Architektur muss umgesetzt werden. Es besteht aus einer inkrementellen Sicherung aller Biobankdaten, die es den IT-Systemmanagern ermöglicht, alle Informationen jederzeit wiederherzustellen Data-Matrix-Barcode (ein zweidimensionaler Barcode, der mit einem Laserscanner gelesen werden kann) und der in der Biobank-Datenbank gespeichert und von der Biobank-Verwaltungssoftware verwaltet wird, die es auch ermöglicht, seine Position im Biobank-Kryobehälter anzuzeigen. Klinische Daten für jede Nachsorge werden automatisch gesammelt, indem Daten aus dem Krankenhausinformationssystem abgerufen werden. Klinische Daten und Biobank-Informationen werden durch ein automatisches Update-Verfahren ständig und kontinuierlich in das Clinical Data Warehouse eingefügt. Klinische und pathologische Daten werden unter Verwendung von SNOMED-, TNM- und ICD9-CM-Standards kodifiziert. Die Verwendung des BRISQ-Systems zur Datenstandardisierung (Biospecimen Reporting for Improved Study Quality, Biopreservation and Biobanking, 2011) wird empfohlen, aber noch nicht implementiert.

8.4 ÜBERTRAGUNG VON PATIENTENPROBEN UND EINTRITT VON BIOBANKPROBEN

Die Anonymisierung (oder besser Anonymisierung) von Bioproben muss durchgeführt werden, um ein hohes Maß an Datenschutz zu gewährleisten. Die in den europäischen Dokumenten verwendete Terminologie identifiziert den Begriff „anonymisiert“, wenn biologisches Material zusammen mit zugehörigen Informationen wie der Art des Tumors, der medizinischen Behandlung, dem Alter des Spenders usw. gespeichert wird, aber alle Informationen, die eine Identifizierung des Forschungsteilnehmers ermöglichen würden oder Der Patient wird entweder irreversibel (nicht verknüpft anonymisiert) oder reversibel (verknüpft anonymisiert) entfernt. Bei verlinkten anonymisierten Proben ist eine Identifizierung durch einen Code möglich, auf den Forscher oder andere Nutzer des Materials – im Sinne der Definition des Begriffs „reversibel/verlinkt anonymisiert“ – keinen Zugriff haben. Kodierte Proben haben die gleichen Eigenschaften wie verknüpfte (reversibel) anonymisierte Proben, mit dem einzigen Unterschied, dass Forscher und Benutzer Zugriff auf den Code haben.

In diesem Projekt wird die Verwendung von verschlüsselter Anonymisierung bevorzugt, um ein angemessenes Maß an Datenschutzsicherheit und Durchführbarkeit von Forschungsaktivitäten zu haben.

Die vorgeschlagene Architektur, die diese Art der Anonymisierung implementiert, erfordert die Definition eines Codes, der die Bioprobe von Anfang an identifiziert, und eines zweiten Codes, der generiert wird, bevor die Probe in der Biobank gespeichert wird. Ein dritter Code wird während der Annahmephase des Musters automatisch generiert und an einem separaten Ort gespeichert. Auf diese Weise sind die Informationen zum ersten Code und die zum letzten Code vollständig entkoppelt, es sei denn, der dritte Code ist bekannt: Dies geschieht nur, wenn Forscher gleichzeitig auf beide Daten zugreifen müssen.

9 MOLEKOLARANALYSE

Die molekulare Analyse wird unter Verwendung von 2 verschiedenen NGS-Plattformen für die Target-Resequenzierung durchgeführt. Die Plattformen werden auf der Grundlage der neuesten Literatur zur Molekularbiologie myeloischer und lymphoider Neoplasien skizziert. Es ist bemerkenswert, dass die Anstrengungen der wissenschaftlichen Gemeinschaft in diesem Bereich enorm sind, was zu einem kontinuierlichen Fluss neuer Informationen und Entdeckungen beiträgt, mit der daraus resultierenden Möglichkeit, die Plattformen zu modifizieren.