Perfil Molecular de Doenças de Malignidades Hematológicas (RELab1)

1. FUNDO

   A medicina molecular é o ramo do conhecimento cujo objetivo é elucidar a base genética das doenças, melhorar a definição diagnóstica e a avaliação prognóstica dos pacientes e contribuir para o desenvolvimento de tratamentos inovadores. A informação genômica está sendo cada vez mais usada no processo de tomada de decisão de tratamento para pacientes individuais. A implementação clínica da medicina molecular requer abordagens sistemáticas baseadas na integração de conhecimentos científicos, médicos e tecnológicos.

   As malignidades hematológicas incluem leucemia, linfoma e mieloma múltiplo. A base molecular de muitas neoplasias hematológicas ainda é desconhecida. No conhecimento atual dos pesquisadores, os cientistas sabem que as malignidades hematológicas são principalmente doenças dinâmicas que surgem de uma grande série de eventos biológicos e genéticos primários e secundários (ou seja, mutações de motorista e passageiro). A identificação das principais alterações moleculares que impulsionam o desenvolvimento e a progressão do tumor é essencial para o desenvolvimento de novas terapias direcionadas e personalizadas.

   As malignidades hematológicas ocorrem tipicamente em pessoas idosas e, como resultado do envelhecimento populacional, representam um problema crítico crescente para as políticas de saúde. As malignidades hematológicas são um contexto ideal para a implementação da medicina molecular. O exemplo paradigmático é a leucemia mielóide crónica, em que a descoberta da base molecular (a fusão do gene BCR/ABL1) se traduziu em grandes avanços clínicos no diagnóstico, tratamento e monitorização da doença.

   A classificação da Organização Mundial da Saúde (OMS) para neoplasias mielóides e linfóides, publicada em 2008, introduziu muitas mudanças genéticas na definição diagnóstica dos cânceres do sangue. Desde 2008, muitas lesões genéticas foram identificadas em muitas neoplasias hematológicas e a próxima classificação da OMS incluirá muitas delas.

   As técnicas de sequenciamento de próxima geração (NGS) deram a melhor contribuição para essas descobertas.

   Os NGS utilizam ferramentas de alta tecnologia que permitem sequenciar, em pouco tempo e com custos relativamente baixos, todo o genoma ou uma parte específica dele (p. exoma ou genes-alvo). A vantagem do NGS em relação ao sequenciamento padrão consiste em maior eficiência (grande quantidade de genes analisados ​​rapidamente em grande quantidade de amostras) e maior sensibilidade (capacidade de detectar mutações em clones muito pequenos de células neoplásicas). Nos últimos anos, a disponibilidade de novas tecnologias para genômica permitiu a triagem de alto rendimento de mutações somáticas em neoplasias hematológicas. Espera-se que os resultados desses estudos melhorem significativamente o manejo de pacientes individuais por meio da implementação de sistemas inovadores de diagnóstico/prognóstico e do desenvolvimento de estratégias terapêuticas baseadas no perfil genômico individual.

   O Departamento de Hematologia Oncológica, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo e a Universidade de Pavia contribuíram significativamente para a definição da base molecular das malignidades hematológicas. Em 2005, a Universidade de Pavia descreveu a importância diagnóstica e prognóstica da mutação JAK2 V617F em neoplasias mieloproliferativas (MPN): essa mutação foi incluída na classificação de MPN da OMS e drogas anti-JAK2 inovadoras foram desenvolvidas. Em 2010, a Universidade de Pavia juntou-se ao Cancer Genome Project, um consórcio de centros de pesquisa internacionais coordenado pelo Wellcome Trust Sanger Institute de Cambridge com o objetivo de elucidar a base molecular do câncer. Nesse contexto, usando o sequenciamento massivo do genoma, mutações recorrentes no gene SF3B1 - que codificam um componente central da maquinaria de splicing de RNA - foram descritas em síndromes mielodisplásicas.

   Além disso, nos últimos anos, pesquisadores da Universidade de Pavia deram uma contribuição significativa na definição da base molecular das neoplasias linfóides (ou seja, mutação BRAF V600E na leucemia de células pilosas, mutação MYD88 L265P na doença de Waldenstrom e mutações SF3B1 na leucemia linfocítica crônica ). Finalmente, nos últimos meses, a Universidade de Pavia teve um papel fundamental na identificação de mutações CALR em MPN JAK2-negativo. Este é novamente um achado importante na compreensão da base genética destes grupos de doenças.

   Além da implementação de técnicas de próxima geração (NGS) para análise genômica, há claramente a necessidade de desenvolver soluções eficazes para analisar e integrar dados moleculares e clínicos de grandes populações de pacientes, a fim de entender completamente a relação entre genótipo e o expressão clínica de uma doença.

   A implementação da medicina molecular requer abordagens sistemáticas baseadas na integração de conhecimentos científicos, clínicos e tecnológicos. Na Itália, o contexto ideal para o desenvolvimento de programas de medicina molecular é representado por redes hematológicas regionais. Representam um modelo inovador de organização e colaboração, baseado na rede de estabelecimentos de saúde. The Rete Ematologica Lombarda (REL, www.rel-lombardia.net) reúne 11 centros de referência em hematologia e recentemente forneceu as bases para um estudo sistemático dessas doenças. O objetivo estratégico da rede clínica REL é garantir o melhor acesso às unidades de saúde, a alta qualidade dos serviços e a continuidade dos cuidados para todos os pacientes hematológicos.

   A rede clínica REL pode dar uma contribuição crucial na pesquisa translacional em neoplasias hematológicas e, recentemente, com esse propósito, a Regione Lombardia em janeiro de 2014 financiou um cluster de biotecnologia para a implementação de análises genômicas e o desenvolvimento de novos tratamentos para doenças hematológicas. O cluster de biotecnologia REL (www.relab-lombardia.net) envolve o Departamento de Oncologia Hematologia, Fondazione IRCCS Policlinico S. Matteo, a Universidade de Pavia, a empresa de biotecnologia Clonit (www.clonit.it) e a empresa farmacêutica Novartis. Este cluster tem como objetivo investigar a base molecular das neoplasias hematológicas e desenvolver tratamentos personalizados.

2. OBJETIVO GERAL DO ESTUDO

   Neste estudo, o Departamento de Hematologia Oncológica, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia, em colaboração com a Universidade de Pavia e o IRCCS Fondazione Maugeri, Pavia fornecerá uma análise sistemática de mutações genéticas em neoplasias hematológicas usando técnicas NGS.

   Serão inscritos pacientes com diagnóstico conclusivo de malignidades hematológicas de acordo com os critérios da OMS encaminhados à rede clínica REL. Os pesquisadores irão analisar DNA genômico e RNA extraídos de células hematopoiéticas em diferentes momentos da doença do paciente. O estudo contempla a utilização de duas plataformas moleculares otimizadas voltadas para a identificação de mutações recorrentes em neoplasias mielóides e linfóides, respectivamente.

   O rastreio de mutações genéticas por NGS será implementado prospectivamente no contexto da rede clínica REL. As amostras dos pacientes serão analisadas no momento do diagnóstico e sequencialmente durante o curso da doença em momentos específicos.

   Os investigadores irão analisar as correlações entre mutações somáticas, fenótipos clínicos específicos (de acordo com a classificação da OMS) e evolução da doença. Isso permitirá: 1) identificar novas mutações genéticas recorrentes envolvidas na patogênese molecular de neoplasias hematológicas; 2) definir o papel dos genes mutados, distinguindo entre genes que induzem uma proliferação clonal de células estaminais hematopoiéticas e genes que determinam o fenótipo clínico da doença; 3) identificar mutações responsáveis ​​pela evolução da doença; 4) definir o papel diagnóstico/prognóstico das mutações identificadas e atualizar as classificações atuais da doença e os escores prognósticos, incluindo parâmetros moleculares.

   Um biobanco sistemático de material biológico será fornecido.

3. OBJETIVOS

   O objetivo geral do estudo é realizar uma análise sistemática de mutações gênicas associadas a malignidades hematológicas usando uma abordagem de sequenciamento direcionado NGS.

4. ENDPOINTS:

   • Incidência cumulativa (%) de mutações genéticas no clone principal e subclones em cada malignidade hematológica
   • Genótipo - correlações fenotípicas entre características clínicas e estado mutacional, avaliadas pelo teste exato de Fisher (para variáveis ​​categóricas) ou pelos testes de Mann-Whitney ou Kruskall-Wallis (para variáveis ​​quantitativas comparadas em dois ou mais grupos de pacientes, respectivamente) com valor-p
   • Sobrevida global e sobrevida livre de doença de acordo com fatores de risco clínicos e biológicos no momento do diagnóstico e durante a evolução da doença, avaliados pelo método limite do produto de Kaplan-Meier e pelo modelo de risco proporcional de Cox, tanto para covariáveis ​​dependentes quanto não dependentes do tempo
5. SELEÇÃO DE PACIENTES:

Critério de inclusão:

• Diagnóstico conclusivo de neoplasia mielóide ou linfóide de acordo com os critérios da OMS de 2008
• idade ≥ 18 anos. Não há limite máximo de idade
• consentimento informado por escrito assinado

Critério de exclusão:

• distúrbio neurológico ou psiquiátrico grave que interfere na capacidade de dar consentimento informado
• sem consentimento informado por escrito

• sem consentimento para biobanking

  7. PROJETO DO ESTUDO:

Este é um estudo multicêntrico, prospectivo e observacional. Todos os pacientes com diagnóstico de malignidade hematológica de acordo com a classificação da OMS realizado na rede clínica REL devem ser incluídos.

8. ASPECTOS DA BOA PRÁTICA CLÍNICA, PRIVACIDADE DE DADOS

O biobanco é regido pelo quadro regulamentar geral da investigação biomédica. Este é um mosaico de instrumentos jurídicos formais e órgãos reguladores implementados a nível nacional e europeu, bem como tipos mais informais de ferramentas e instrumentos de governação, como orientações profissionais e melhores práticas. A regulamentação da investigação biomédica consiste em instrumentos jurídicos vinculativos e não vinculativos, tanto a nível nacional como europeu. Isso ocorre na forma de lei específica para pesquisa médica - por exemplo, a Convenção de Oviedo do Conselho da Europa de 1997 - e instrumentos jurídicos mais gerais - como direitos humanos e lei de proteção de dados - alguns dos quais têm relevância para biobancos. A responsabilidade pela supervisão da pesquisa e pela garantia do cumprimento dos requisitos legais foi amplamente delegada a órgãos nacionais, como comitês de ética em pesquisa.

8.1 COLETA DE DADOS

O estudo contempla a coleta de dados clínicos e biológicos indispensáveis ​​para a definição precisa de um padrão diagnóstico e prognóstico em um CRF eletrônico ad-hoc e a análise de genes específicos que podem estar envolvidos na base molecular das doenças através de técnicas de NGS.

8.2 ARMAZÉM DE DADOS CLÍNICOS (Informática para Integrar a Biologia e a Beira do Leito, I2B2)

Informatics for Integrating Biology and the Bedside (i2b2, www.i2b2.org) é um data warehouse clínico de código aberto, que é interrogado com eficiência para encontrar conjuntos de pacientes interessantes, preservando sua privacidade por meio de uma interface de ferramenta de consulta. Dentro dessa arquitetura, objetos de software interoperáveis ​​do lado do servidor, chamados de "células", são capazes de trocar informações entre si, contando com a tecnologia de serviços web.

A fim de apoiar e melhorar a eficiência da pesquisa clínica em oncologia, a Universidade de Pavia e a IRCCS Fondazione Salvatore Maugeri de Pavia desenvolveram e implementaram uma nova plataforma de TIC, chamada Onco-i2b2, baseada no software i2b2 e instalada na IRCCS Fondazione S. Maugeri, Pavia. Onco-i2b2 é capaz de integrar dados de diferentes fontes dentro do data warehouse i2b2 por meio da implementação de uma arquitetura de TI complexa, que inclui o desenvolvimento de novas células i2b2 para análise de dados.

Como resultado deste projeto, os pesquisadores hospitalares puderam obter informações do banco de dados de patologia, de um sistema de gerenciamento de biobanco e mesclá-los com as informações clínicas presentes no sistema de informações hospitalares, a fim de selecionar pacientes interessantes com um fenótipo específico de interesse.

8.3 DESCRIÇÃO TÉCNICA DO PROCESSO DE PSEUDONIMIZAÇÃO E FERRAMENTAS UTILIZADAS

Na verdade, não existe um regulamento específico a nível nacional para os aspectos técnicos relacionados com o biobanco, mas alguns grupos de trabalho de especialistas (e.g. AIOM e SIAPEC-IAP) têm suscitado iniciativas de definição e harmonização dos procedimentos gerais nacionais existentes. Uma breve lista de requisitos estruturais e tecnológicos pode ser identificada em:

1. Definição de uma documentação programática com objetivo do biobanco, especificações funcionais a serem executadas, tipo de material preservado, número de espécimes esperados, métodos de retirada, processamento e conservação, gerenciamento de informações, transporte e recebimento de espécimes da unidade receptora , gestão do eventual risco biológico e um plano económico de médio-grande prazo
2. Definição lógica dos locais dedicados, sistemas de condicionamento e controle de acesso. Além disso, a temperatura dos recipientes criogênicos deve ser monitorada continuamente.
3. O plano de recuperação de desastres para equipamentos e contêineres criogênicos deve ser definido (por exemplo, uso de sistemas para continuidade elétrica ou lista de pessoal competente que deve intervir quando ocorrerem eventos especiais)
4. Recomenda-se o uso de um sistema de qualidade certificado para cada etapa dos diferentes procedimentos, monitorando a qualidade dos dados desde a obtenção do consentimento informado até o armazenamento da amostra
5. Definição de um sistema de informação dedicado à gestão de amostras do biobanco, relacionado com a informação clínica armazenada no sistema de informação hospitalar, para rastrear as movimentações das amostras e atualizar os dados de seguimento decorrentes da investigação científica realizada.
6. O plano de recuperação de desastre também para a arquitetura de TI deve ser implementado. Consiste em um backup incremental de todos os dados do biobanco que permite aos gestores do sistema de TI restaurar toda a informação em qualquer período de tempo No biobanco oncológico "Bruno Boerci" cada espécime biológico é identificado por um código específico, impresso no tubo usando um código de barras data matrix (um código de barras bidimensional legível através do uso de um scanner a laser), e armazenado no banco de dados do biobanco e gerenciado pelo software de gerenciamento do biobanco, que permite também visualizar sua posição dentro do recipiente crio do biobanco. Os dados clínicos de cada acompanhamento são coletados automaticamente recuperando dados do sistema de informações do hospital. Os dados clínicos e as informações do biobanco são constante e continuamente inseridos no data warehouse clínico por um procedimento de atualização automática. Os dados clínicos e patológicos são codificados usando os padrões SNOMED, ​​TNM e ICD9-CM. O uso do sistema BRISQ para padronização de dados (Biospecimen Reporting for Improved Study Quality, Biopreservation and Biobanking, 2011) é recomendado, mas ainda não implementado.

8.4 TRANSFERÊNCIA DE AMOSTRAS DE PACIENTES E ENTRADA DE AMOSTRAS NO BIOBANCO

A anonimização de espécimes biológicos (ou melhor, desidentificação) deve ser realizada para garantir altos níveis de privacidade de dados. A terminologia utilizada nos documentos europeus identifica o termo 'anonimizado' quando o material biológico é armazenado junto com informações associadas, como o tipo de tumor, tratamento médico, idade do doador e assim por diante, mas todas as informações que permitiriam a identificação do participante da pesquisa ou paciente é despojado, irreversivelmente (anonimizado não vinculado) ou reversivelmente (anonimizado vinculado). No caso de amostras anônimas vinculadas, a identificação é possível por meio de um código, ao qual os pesquisadores ou outros usuários do material - como parte da definição do termo 'anônimo reversível/vinculado' - não têm acesso. As amostras codificadas têm as mesmas características das amostras vinculadas (reversivelmente) anônimas, com a única diferença de que pesquisadores e usuários têm acesso ao código.

Neste projeto, o uso de anonimização codificada é preferido para ter um nível adequado de segurança de privacidade e viabilidade de atividades de pesquisa.

A arquitetura proposta que implementará esse tipo de desidentificação requer a definição de um código que identifique o espécime biológico desde o início e um segundo código que será gerado antes que o espécime seja armazenado no biobanco. Um terceiro código será gerado automaticamente durante a fase de aceitação da amostra e será armazenado em um local separado. Dessa forma, as informações relacionadas ao primeiro código e as relacionadas ao final são totalmente desacopladas, a menos que o terceiro código seja conhecido: isso ocorre apenas quando os pesquisadores precisam acessar os dois dados simultaneamente.

9 ANÁLISE MOLECULAR

A análise molecular é realizada usando 2 plataformas NGS diferentes para o resequenciamento de alvos. As plataformas são delineadas com base na literatura mais recente sobre a biologia molecular de neoplasias mielóides e linfóides. É de salientar que os esforços da comunidade científica nesta área são enormes, o que contribui para um fluxo contínuo de novas informações e descobertas, com a consequente possibilidade de modificação das plataformas.