Hematologisten pahanlaatuisten kasvainten molekyylitautiprofiili (RELab1)

1. TAUSTA

   Molekyylilääketiede on tietämyksen ala, jonka tarkoituksena on selvittää sairauksien geneettistä perustaa, parantaa potilaiden diagnostista määritelmää ja ennustearviointia sekä edistää innovatiivisten hoitojen kehittämistä. Genomista tietoa käytetään yhä enemmän yksittäisten potilaiden hoitopäätöksenteossa. Molekyylilääketieteen kliininen toteutus edellyttää systemaattista lähestymistapaa, joka perustuu tieteellisen, lääketieteellisen ja teknologisen asiantuntemuksen yhdistämiseen.

   Hematologisia pahanlaatuisia kasvaimia ovat leukemia, lymfooma ja multippeli myelooma. Monien hematologisten kasvainten molekyyliperustaa ei vielä tunneta. Tutkijoiden tietämyksen mukaan hematologiset pahanlaatuiset kasvaimet ovat enimmäkseen dynaamisia sairauksia, jotka johtuvat suuresta sarjasta primäärisiä ja sekundaarisia biologisia ja geneettisiä tapahtumia (esim. kuljettajan ja matkustajan mutaatiot). Kasvaimen kehitystä ja etenemistä ohjaavien keskeisten molekyylimuutosten tunnistaminen on olennaista uusien kohdennettujen ja henkilökohtaisten hoitojen kehittämisessä.

   Hematologisia pahanlaatuisia kasvaimia esiintyy tyypillisesti iäkkäillä ihmisillä, ja väestön ikääntymisen seurauksena ne ovat kasvava kriittinen kysymys terveyspolitiikassa. Hematologiset pahanlaatuiset kasvaimet ovat ihanteellinen konteksti molekyylilääketieteen toteuttamiselle. Paradigmaattinen esimerkki tästä on krooninen myelooinen leukemia, jossa molekyyliperustan (fuusiogeenin BCR/ABL1) löytäminen on muunnettu merkittäviksi kliinisiksi edistysaskeliksi diagnosoinnissa, hoidossa ja sairauksien seurannassa.

   Maailman terveysjärjestön (WHO) vuonna 2008 julkaisema myeloidisten ja lymfaattisten kasvainten luokittelu toi monia geneettisiä muutoksia verisyöpien diagnostiseen määritelmään. Vuodesta 2008 lähtien monissa hematologisissa pahanlaatuisissa kasvaimissa on tunnistettu runsaasti geneettisiä vaurioita, ja seuraava WHO:n luokittelu sisältää monia niistä.

   Seuraavan sukupolven sekvensointitekniikat (NGS) antoivat parhaan panoksen näihin havaintoihin.

   NGS käyttää korkean teknologian työkaluja, joilla voidaan lyhyessä ajassa ja suhteellisen alhaisin kustannuksin sekvensoida koko genomi tai tietty osa siitä (esim. exome tai kohdegeenit). NGS:n etu standardisekvensointiin verrattuna on korkeampi tehokkuus (suuri määrä geenejä analysoidaan nopeasti suuressa määrässä näytteitä) ja korkeampi herkkyys (kyky havaita mutaatioita hyvin pienissä neoplastisten solujen klooneissa). Viime vuosina uusien genomitekniikoiden saatavuus on mahdollistanut hematologisten pahanlaatuisten kasvainten somaattisten mutaatioiden tehokkaan seulonnan. Näiden tutkimusten tulosten odotetaan parantavan merkittävästi yksittäisten potilaiden hoitoa ottamalla käyttöön innovatiivisia diagnostisia/prognostisia järjestelmiä ja kehittämällä yksilölliseen genomiseen profiiliin perustuvia hoitostrategioita.

   Hematologian onkologian laitos, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo ja Pavian yliopisto ovat merkittävästi myötävaikuttaneet hematologisten pahanlaatuisten kasvainten molekyyliperustan määrittelyyn. Pavian yliopisto kuvasi vuonna 2005 JAK2 V617F -mutaation diagnostista ja prognostista merkitystä myeloproliferatiivisissa kasvaimissa (MPN): tämä mutaatio sisällytettiin WHO:n MPN-luokitukseen ja kehitettiin innovatiivisia anti-JAK2-lääkkeitä. Vuonna 2010 Pavian yliopisto liittyi Cambridgen Wellcome Trust Sanger Instituten koordinoimaan Cancer Genome Projectiin, kansainvälisten tutkimuskeskusten yhteenliittymään, jonka tavoitteena on selvittää syövän molekyyliperustaa. Tässä yhteydessä massiivinen genomin sekvensointi käyttämällä toistuvia mutaatioita SF3B1-geenissä - jotka koodaavat RNA:n silmukointikoneiston ydinkomponenttia - kuvattiin myelodysplastisissa oireyhtymissä.

   Lisäksi Pavian yliopiston tutkijat ovat viime vuosina antaneet merkittävän panoksen lymfoidisten kasvainten molekyyliperustan määrittelyyn (eli BRAF V600E -mutaatio karvasoluleukemiassa, MYD88 L265P -mutaatio Waldenströmin taudissa ja SF3B1-mutaatiot kroonisessa lymfosyyttisessä leukemiassa ). Lopuksi, aivan viime kuukausina Pavian yliopistolla oli avainrooli CALR-mutaatioiden tunnistamisessa JAK2-negatiivisessa MPN:ssä. Tämä on jälleen tärkeä havainto näiden tautiryhmien geneettisen perustan ymmärtämisessä.

   Genomianalyysin seuraavan sukupolven tekniikoiden (NGS) käyttöönoton lisäksi on selvästikin kehitettävä tehokkaita ratkaisuja suurten potilaspopulaatioiden molekyyli- ja kliinisten tietojen analysoimiseksi ja integroimiseksi, jotta voidaan täysin ymmärtää genotyypin ja sairauden kliininen ilmentymä.

   Molekyylilääketieteen toteuttaminen edellyttää systemaattista lähestymistapaa, joka perustuu tieteellisen, kliinisen ja teknologisen asiantuntemuksen yhdistämiseen. Italiassa ihanteellinen ympäristö molekyylilääketieteen ohjelmien kehittämiselle on hematologiset alueelliset verkostot. Ne edustavat innovatiivista organisaatio- ja yhteistyömallia, joka perustuu terveydenhuoltolaitosten verkostoitumiseen. The Rete Ematologica Lombarda (REL, www.rel-lombardia.net) Se kokoaa yhteen 11 hematologista lähetekeskusta ja on äskettäin tarjonnut perustan näiden sairauksien systemaattiselle tutkimukselle. REL-kliinisen verkoston strategisena tavoitteena on varmistaa kaikkien hematologisten potilaiden parempi pääsy terveydenhuollon palveluihin, palvelujen korkea laatu ja hoidon jatkuvuus.

   Kliininen REL-verkosto voi antaa ratkaisevan panoksen hematologisten pahanlaatuisten kasvainten translaatiotutkimukseen, ja äskettäin tätä tarkoitusta varten Regione Lombardia rahoitti tammikuussa 2014 bioteknologiaklusterin genomianalyysin toteuttamiseksi ja uusien hoitomuotojen kehittämiseksi hematologisiin sairauksiin. REL-bioteknologiaklusteri (www.relab-lombardia.net) Mukana on hematologian onkologian laitos, Fondazione IRCCS Policlinico S. Matteo, Pavian yliopisto, bioteknologiayritys Clonit (www.clonit.it) ja lääkeyhtiö Novartis. Tämän klusterin tavoitteena on tutkia hematologisten pahanlaatuisten kasvainten molekyyliperustaa ja kehittää yksilöllisiä hoitoja.

2. TUTKIMUKSEN YLEINEN TARKOITUS

   Tässä tutkimuksessa Hematologian onkologian laitos, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia yhteistyössä Pavian yliopiston ja IRCCS Fondazione Maugeri, Pavia kanssa, tarjoaa systemaattisen analyysin hematologisten pahanlaatuisten kasvainten geenimutaatioista käyttämällä NGS-tekniikoita.

   Mukaan otetaan potilaat, joilla on WHO:n kriteerien mukaan lopullinen diagnoosi hematologisista pahanlaatuisista kasvaimista REL-kliinisen verkoston kautta. Tutkijat analysoivat hematopoieettisista soluista erotettua genomista DNA:ta ja RNA:ta potilaan sairauden eri ajankohtina. Tutkimuksessa harkitaan kahden optimoidun molekyylialustan käyttöä, joiden tarkoituksena on tunnistaa toistuvia mutaatioita myeloidisissa ja lymfoidisissa kasvaimissa, vastaavasti.

   Geenimutaatioiden seulonta NGS:llä toteutetaan prospektiivisesti REL-kliinisen verkoston yhteydessä. Potilasnäytteet analysoidaan diagnoosin yhteydessä ja peräkkäin taudin kulun aikana tiettyinä ajankohtina.

   Tutkijat analysoivat somaattisten mutaatioiden, spesifisten kliinisten fenotyyppien (WHO:n luokituksen mukaan) ja sairauden evoluution välisiä korrelaatioita. Tämä mahdollistaa: 1) uusien toistuvien geneettisten mutaatioiden tunnistamisen, jotka liittyvät hematologisten pahanlaatuisten kasvainten molekyylipatogeneesiin; 2) määrittää mutatoituneiden geenien roolin erottaen geenit, jotka indusoivat hematopoieettisten kantasolujen kloonista lisääntymistä, ja geenit, jotka määrittävät taudin kliinisen fenotyypin; 3) tunnistaa mutaatiot, jotka ovat vastuussa taudin evoluutiosta; 4) määrittää tunnistettujen mutaatioiden diagnostinen/prognostinen rooli ja päivittää nykyiset sairausluokitukset ja ennustepisteet sisällyttämällä molekyyliparametrit.

   Järjestetään järjestelmällinen biologisen materiaalin biopankki.

3. TAVOITTEET

   Tutkimuksen yleisenä tavoitteena on tehdä systemaattinen analyysi hematologisiin pahanlaatuisiin kasvaimiin liittyvistä geenimutaatioista käyttämällä NGS-kohdennettua sekvensointimenetelmää.

4. PÄÄTEKOHDAT:

   • Geenimutaatioiden kumulatiivinen ilmaantuvuus (%) pääkloonissa ja subkloonissa kussakin hematologisessa maligniteettissa
   • Genotyyppi - fenotyyppikorrelaatiot kliinisten ominaisuuksien ja mutaatiostatuksen välillä, jotka on arvioitu Fisherin tarkalla testillä (kategorisille muuttujille) tai Mann-Whitney- tai Kruskall-Wallis-testeillä (kvantitatiivisille muuttujille, joita verrataan kahdessa tai useammassa potilasryhmässä, vastaavasti) p-arvo
   • Kokonaiseloonjääminen ja taudista vapaa eloonjääminen kliinisten ja biologisten riskitekijöiden mukaan diagnoosin yhteydessä ja taudin evoluution aikana, arvioituna Kaplan-Meier-tuoterajamenetelmällä ja Coxin suhteellisella vaaramallilla sekä ajasta riippuville että ajasta riippumattomille kovariaateille
5. POTILASVALINTA:

Sisällyttämiskriteerit:

• Lopullinen myelooisen tai lymfoidisen kasvaimen diagnoosi WHO:n vuoden 2008 kriteerien mukaan
• ikä ≥ 18 vuotta. Yläikärajaa ei ole
• allekirjoitettu kirjallinen tietoinen suostumus

Poissulkemiskriteerit:

• vakava neurologinen tai psykiatrinen häiriö, joka häiritsee kykyä antaa tietoinen suostumus
• ei kirjallista tietoista suostumusta

• ei lupaa biopankkitoiminnalle

  7. SUUNNITTELU:

Tämä on monikeskinen, prospektiivinen, havainnollinen tutkimus. Kaikki potilaat, joilla on REL-kliinisen verkoston WHO-luokituksen mukainen hematologinen maligniteettidiagnoosi, on tarkoitus ottaa mukaan.

8. HYVÄN KLIINISEN KÄYTÄNNÖN NÄKÖKOHDAT, TIETOJEN SUOJA

Biopankkitoimintaa ohjataan biolääketieteellisen tutkimuksen yleisen sääntelykehyksen alaisina. Tämä on mosaiikki muodollisista oikeudellisista välineistä ja sääntelyelimistä, jotka on otettu käyttöön kansallisella ja Euroopan tasolla, sekä epävirallisempia hallintovälineitä ja -välineitä, kuten ammatillisia ohjeita ja parhaita käytäntöjä. Biolääketieteellisen tutkimuksen sääntely koostuu sitovista ja ei-sitovista oikeudellisista välineistä sekä kansallisella että Euroopan tasolla. Tämä koskee lääketieteellistä tutkimusta koskevaa erityislainsäädäntöä - esimerkiksi Euroopan neuvoston Oviedon yleissopimus 1997 - ja yleisempiä oikeudellisia välineitä - kuten ihmisoikeus- ja tietosuojalaki - joista joillakin on merkitystä biopankkitoiminnan kannalta. Vastuu tutkimuksen valvonnasta ja lakisääteisten vaatimusten noudattamisesta on suurelta osin delegoitu kansallisille elimille, kuten tutkimuseettisille toimikunnille.

8.1 TIETOJEN KERÄÄMINEN

Tutkimuksessa tarkastellaan kliinisen ja biologisen välttämättömän tiedon keräämistä tarkkaa diagnostista ja prognostista standardimäärittelyä varten ad-hoc-sähköisessä CRF:ssä ja sellaisten spesifisten geenien analysointia, jotka voivat olla mukana sairauksien molekyylipohjassa NGS-tekniikoiden avulla.

8.2 KLIINISET TIEDOT VARASTOT (Informatiikka biologian ja vuodepaikan yhdistämiseen, I2B2)

Informatics for Integrating Biology and the Bedside (i2b2, www.i2b2.org) on ​​avoimen lähdekoodin kliininen tietovarasto, jota tutkitaan tehokkaasti kiinnostavien potilaiden löytämiseksi, jotka säilyttävät yksityisyytensä kyselytyökalun käyttöliittymän kautta. Tässä arkkitehtuurissa yhteentoimivat palvelinpuolen ohjelmistoobjektit, joita kutsutaan "soluiksi", voivat vaihtaa tietoja toistensa kanssa verkkopalveluteknologian avulla.

Onkologian kliinisen tutkimuksen tukemiseksi ja tehostamiseksi Pavian yliopisto ja Pavian IRCCS Fondazione Salvatore Maugeri kehittivät ja ottivat käyttöön uuden ICT-alustan nimeltä Onco-i2b2, joka perustuu i2b2-ohjelmistoon ja asennettiin IRCCS Fondazioneen. S. Maugeri, Pavia. Onco-i2b2 pystyy integroimaan dataa eri lähteistä i2b2-tietovaraston sisällä toteuttamalla monimutkaisen IT-arkkitehtuurin, joka sisältää uusien i2b2-solujen kehittämisen data-analyysiä varten.

Hankkeen tuloksena sairaalatutkijat ovat voineet saada tietoa patologiatietokannasta, biopankin hallintajärjestelmästä ja yhdistää ne sairaalan tietojärjestelmässä olevaan kliiniseen tietoon, jotta voidaan valita kiinnostavia potilaita, joilla on tietty fenotyyppi. kiinnostuksen kohde.

8.3 TEKNINEN KUVAUS PSEUDONYMISOINTIPROSESSISTA JA KÄYTETTYJÄ TYÖKALUISTA

Biopankkiin liittyvistä teknisistä näkökohdista ei itse asiassa ole olemassa erityistä kansallista sääntelyä, mutta jotkut asiantuntijatyöryhmät (esim. AIOM ja SIAPEC-IAP) ovat tehneet aloitteita olemassa olevien kansallisten yleisten menettelyjen määrittelemiseksi ja yhdenmukaistamiseksi. Lyhyt luettelo rakenteellisista ja teknisistä vaatimuksista löytyy seuraavista:

1. Ohjelmallisen dokumentaation määrittely biopankin tavoitteen, suoritettavan toiminnallisen spesifikaation, säilytettävän materiaalin tyypin, odotettavissa olevien näytteiden lukumäärän, poisto-, käsittely- ja säilytysmenetelmät, tiedonhallinta, näytteiden kuljetus ja vastaanotto vastaanottavasta yksiköstä. , mahdollisen biologisen riskin hallinta ja taloudellinen suunnitelma keskipitkälle pitkälle ajanjaksolle
2. Looginen määritelmä omistautuneista paikallisista, ilmastointijärjestelmät ja kulunvalvonta. Riippuvuuden tapauksessa kryosäiliöiden lämpötilaa on seurattava jatkuvasti.
3. Laitteille ja kryosäiliöille on määriteltävä katastrofipalautussuunnitelma (esim. sähkön jatkuvuutta koskevien järjestelmien käyttö tai luettelo pätevistä henkilöistä, joiden tulee puuttua erityistapahtumiin)
4. Sertifioidun laatujärjestelmän käyttöä eri menettelyjen jokaisessa vaiheessa suositellaan, jotta voidaan seurata tietojen laatua tietoisen suostumuksen hankinnasta näytteen säilyttämiseen.
5. Biopankkinäytteiden hallintaan tarkoitetun tietojärjestelmän määrittely, joka liittyy sairaalan tietojärjestelmään tallennettuun kliiniseen tietoon näytteiden liikkeiden seuraamiseksi ja suoritetusta tieteellisestä tutkimuksesta saatavien seurantatietojen päivittämiseksi.
6. Myös IT-arkkitehtuurin katastrofipalautussuunnitelma on otettava käyttöön. Se koostuu kaikkien biopankkitietojen asteittaisesta varmuuskopioinnista, jonka avulla IT-järjestelmän johtajat voivat palauttaa kaikki tiedot milloin tahansa "Bruno Boerci" -onkologisessa biopankissa jokainen biologinen näyte tunnistetaan erityisellä koodilla, joka on painettu putkeen käyttämällä datamatriisiviivakoodi (laserskannerilla luettavissa oleva kaksiulotteinen viivakoodi), joka on tallennettu biopankkitietokantaan ja jota hallinnoi biopankin hallintaohjelmisto, jonka avulla voidaan tarkastella myös sen sijaintia biopankin kryosäiliön sisällä. Jokaisen seurannan kliiniset tiedot kerätään automaattisesti hakeen tiedot sairaalan tietojärjestelmästä. Kliiniset tiedot ja biopankkitiedot lisätään jatkuvasti ja jatkuvasti kliinisen tietovarastoon automaattisen päivityksen avulla. Kliiniset ja patologiset tiedot on koodattu käyttämällä SNOMED-, TNM- ja ICD9-CM-standardeja. BRISQ-järjestelmän käyttöä tiedon standardointiin (Biospecimen Reporting for Improved Study Quality, Biopreservation and Biobanking, 2011) suositellaan, mutta sitä ei ole vielä otettu käyttöön.

8.4 POTILASNÄYTTEIDEN SIIRTO JA BIOPANKINÄYTTEIDEN SISÄÄNPÄÄSY

Bionäytteiden anonymisointi (tai parempi, tunnistamisen poistaminen) on suoritettava korkeatasoisen tietosuojan varmistamiseksi. Eurooppalaisissa asiakirjoissa käytetty terminologia tunnistaa termin "anonymisoitu", kun biologista materiaalia tallennetaan siihen liittyvien tietojen, kuten kasvaimen tyypin, lääketieteellisen hoidon, luovuttajan iän ja niin edelleen, kanssa, mutta kaikki tiedot, jotka mahdollistaisivat tutkimukseen osallistuvan tai potilas riisutaan joko peruuttamattomasti (linkitetty anonymisoitu) tai palautuvasti (linkitetty anonymisoitu). Linkitettyjen anonymisoitujen näytteiden tapauksessa tunnistaminen on mahdollista koodilla, johon tutkijoilla tai muilla materiaalin käyttäjillä ei ole pääsyä käsitteen "palautettavasti/linkitetty anonymisoitu" määritelmän mukaisesti. Koodatuilla näytteillä on samat ominaisuudet kuin linkitetyillä (palautettavasti) anonymisoiduilla näytteillä, ainoa ero on, että tutkijoilla ja käyttäjillä on pääsy koodiin.

Tässä hankkeessa suositaan koodatun anonymisoinnin käyttöä riittävän yksityisyyden suojan ja tutkimustoiminnan toteutettavuuden varmistamiseksi.

Ehdotettu arkkitehtuuri, joka toteuttaa tämän tyyppisen de-identifioinnin, edellyttää koodin määrittelyä, joka tunnistaa bionäytteen alusta alkaen, ja toisen koodin, joka luodaan ennen kuin näyte tallennetaan biopankkiin. Kolmas koodi luodaan automaattisesti näytteen hyväksymisvaiheessa ja tallennetaan erilliseen paikkaan. Tällä tavalla ensimmäiseen koodiin ja viimeiseen koodiin liittyvät tiedot irrotetaan täysin toisistaan, ellei kolmatta koodia tiedetä: tämä tapahtuu vain silloin, kun tutkijoiden on päästävä molempiin tietoihin samanaikaisesti.

9 MOLEKOLAARINEN ANALYYSI

Molekyylianalyysi suoritetaan käyttämällä kahta erilaista NGS-alustaa kohteen uudelleensekvensointiin. Alustat on hahmoteltu viimeisimmän myelooisen ja lymfoidisen kasvaimen molekyylibiologiaa koskevan kirjallisuuden perusteella. On huomionarvoista, että tiedeyhteisön ponnistelut tällä alalla ovat valtavia, ja tämä myötävaikuttaa jatkuvaan uuden tiedon ja löytöjen virtaukseen, minkä seurauksena alustoja voidaan muuttaa.