Molekylær sygdomsprofil af hæmatologiske maligniteter (RELab1)

1. BAGGRUND

   Molekylær medicin er den vidensgren, hvis formål er at belyse sygdommenes genetiske grundlag, at forbedre den diagnostiske definition og prognostiske vurdering af patienter og at bidrage til udviklingen af ​​innovative behandlinger. Genomisk information bliver i stigende grad brugt i beslutningsprocessen for behandling af individuelle patienter. Den kliniske implementering af molekylær medicin kræver systematiske tilgange baseret på integration af videnskabelig, medicinsk og teknologisk ekspertise.

   Hæmatologiske maligniteter omfatter leukæmi, lymfom og myelomatose. Det molekylære grundlag for mange hæmatologiske neoplasmer er stadig ukendt. På nuværende tidspunkt af forskernes viden ved forskerne, at hæmatologiske maligniteter for det meste er dynamiske sygdomme, der opstår fra en lang række primære og sekundære biologiske og genetiske hændelser (dvs. fører- og passagermutationer). Identifikationen af ​​vigtige molekylære ændringer, der driver tumorudvikling og -progression, er afgørende for udviklingen af ​​nye målrettede og personaliserede terapier.

   Hæmatologiske maligniteter forekommer typisk hos ældre mennesker og udgør som følge af befolkningens aldring et voksende kritisk problem for sundhedspolitikker. Hæmatologiske maligniteter er en ideel kontekst for implementering af molekylær medicin. Det paradigmatiske eksempel på dette er kronisk myeloid leukæmi, hvor opdagelsen af ​​det molekylære grundlag (fusionsgenet BCR/ABL1) er blevet omsat til store kliniske fremskridt inden for diagnose, behandling og sygdomsovervågning.

   Verdenssundhedsorganisationens (WHO) klassificering af myeloid og lymfoid neoplasma offentliggjort i 2008 introducerede mange genetiske ændringer i den diagnostiske definition af blodkræft. Siden 2008 er masser af genetiske læsioner blevet identificeret i mange hæmatologiske maligniteter, og den næste WHO-klassificering vil omfatte mange af dem.

   Næste generations sekventeringsteknikker (NGS) gav det bedste bidrag til disse resultater.

   NGS bruger højteknologiske værktøjer, der på kort tid og med relativt lave omkostninger kan sekvensere hele genomet eller en specifik del af det (f. exome eller målrettede gener). Fordelen ved NGS sammenlignet med standardsekventering består i højere effektivitet (en stor mængde gener analyseres hurtigt i en stor mængde prøver) og højere følsomhed (kapacitet til at påvise mutationer i meget små kloner af neoplastiske celler). I de sidste år har tilgængeligheden af ​​nye teknologier til genomisk forskning muliggjort high-throughput screening af somatiske mutationer i hæmatologiske maligniteter. Det forventes, at resultaterne af disse undersøgelser væsentligt vil forbedre håndteringen af ​​individuelle patienter gennem implementering af innovative diagnostiske/prognostiske systemer og udvikling af terapeutiske strategier baseret på individuel genomisk profil.

   Afdelingen for hæmatologisk onkologi, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo og University of Pavia har bidraget væsentligt til definitionen af ​​det molekylære grundlag for hæmatologiske maligniteter. I 2005 beskrev University of Pavia den diagnostiske og prognostiske betydning af JAK2 V617F-mutationen i myeloproliferative neoplasmer (MPN): denne mutation blev inkluderet i WHO-klassifikationen af ​​MPN, og innovative anti-JAK2-lægemidler blev udviklet. I 2010 sluttede University of Pavia sig til Cancer Genome Project, et konsortium af internationale forskningscentre koordineret af Wellcome Trust Sanger Institute of Cambridge med det formål at belyse det molekylære grundlag for kræft. I denne sammenhæng blev tilbagevendende mutationer i SF3B1-genet - som koder for en kernekomponent i RNA-splejsningsmaskineriet - beskrevet i myelodysplastiske syndromer ved at bruge massiv genomsekventering.

   Desuden har forskere fra University of Pavia i de sidste år ydet et væsentligt bidrag til definitionen af ​​det molekylære grundlag for lymfoide neoplasmer (dvs. BRAF V600E-mutation i hårcelleleukæmi, MYD88 L265P-mutation i Waldenstroms sygdom og SF3B1-mutationer i kronisk lymfatisk leukæmi ). Endelig har Pavia-universitetet i de allersidste måneder haft en nøglerolle i identifikation af CALR-mutationer i JAK2-negativ MPN. Dette er igen et vigtigt fund i forståelsen af ​​det genetiske grundlag for denne gruppe af sygdomme.

   Ud over implementeringen af ​​næste generations teknikker (NGS) til genomisk analyse er der helt klart et behov for at udvikle effektive løsninger til at analysere og integrere molekylære og kliniske data fra store patientpopulationer for fuldt ud at forstå forholdet mellem genotypen og klinisk udtryk for en sygdom.

   Implementeringen af ​​molekylær medicin kræver systematiske tilgange baseret på integration af videnskabelig, klinisk og teknologisk ekspertise. I Italien er den ideelle kontekst for udvikling af molekylærmedicinske programmer repræsenteret af hæmatologiske regionale netværk. De repræsenterer en innovativ model for organisation og samarbejde, baseret på netværk af sundhedsfaciliteter. Rete Ematologica Lombarda (REL, www.rel-lombardia.net) samler 11 hæmatologiske henvisningscentre og har for nylig givet grundlag for en systematisk undersøgelse af disse sygdomme. Det strategiske mål for REL klinisk netværk er at sikre bedre adgang til sundhedsfaciliteterne, den høje kvalitet af tjenester og kontinuiteten i plejen for alle de hæmatologiske patienter.

   REL klinisk netværk kan give et afgørende bidrag til den translationelle forskning i hæmatologiske maligniteter og for nylig, med dette formål, finansierede Regione Lombardia i januar 2014 en bioteknologisk klynge til implementering af genomisk analyse og udvikling af nye behandlinger for hæmatologiske sygdomme. REL bioteknologisklyngen (www.relab-lombardia.net) involverer afdelingen for hæmatologisk onkologi, Fondazione IRCCS Policlinico S. Matteo, University of Pavia, biotekvirksomheden Clonit (www.clonit.it) og medicinalvirksomheden Novartis. Denne klynge har til formål at undersøge det molekylære grundlag for hæmatologiske maligniteter og at udvikle personlige behandlinger.

2. STUDIETS GENERELLE FORMÅL

   I denne undersøgelse vil Institut for Hæmatologisk Onkologi, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia i samarbejde med University of Pavia og IRCCS Fondazione Maugeri, Pavia levere en systematisk analyse af genmutationer i hæmatologiske maligniteter ved at bruge NGS-teknikker.

   Patienter med en endelig diagnose af hæmatologiske maligniteter i henhold til WHO-kriterier henvist til det kliniske REL-netværk vil blive indskrevet. Forskerne vil analysere genomisk DNA og RNA ekstraheret fra hæmatopoietiske celler på forskellige tidspunkter for patientens sygdom. Undersøgelsen overvejer brugen af ​​to optimerede molekylære platforme rettet mod identifikation af tilbagevendende mutationer i henholdsvis myeloide og lymfoide neoplasmer.

   Screening af genmutationer af NGS vil blive implementeret prospektivt i forbindelse med REL klinisk netværk. Patientprøver vil blive analyseret ved diagnose og sekventielt under sygdomsforløbet på bestemte tidspunkter.

   Forskerne vil analysere sammenhængen mellem somatiske mutationer, specifikke kliniske fænotyper (ifølge WHO-klassifikationen) og sygdomsudvikling. Dette vil tillade at: 1) identificere nye tilbagevendende genetiske mutationer involveret i den molekylære patogenese af hæmatologiske maligniteter; 2) definere rollen af ​​muterede gener ved at skelne mellem gener, der inducerer en klonal proliferation af hæmatopoietiske stamceller, og gener, som bestemmer sygdommens kliniske fænotype; 3) identificere mutationer, der er ansvarlige for sygdomsudvikling; 4) definere den diagnostiske/prognostiske rolle for de identificerede mutationer og opdatere de nuværende sygdomsklassifikationer og prognostiske score ved at inkludere molekylære parametre.

   Der vil blive sørget for en systematisk biobanking af biologisk materiale.

3. MÅL

   Det generelle formål med undersøgelsen er at udføre en systematisk analyse af genmutationer forbundet med hæmatologiske maligniteter ved at bruge en NGS-målrettet sekventeringstilgang.

4. ENDPUNKTER:

   • Kumulativ forekomst (%) af genmutationer i primære kloner og subkloner i hver hæmatologisk malignitet
   • Genotype - fænotype korrelationer mellem kliniske karakteristika og mutationsstatus, evalueret ved Fishers eksakte test (for kategoriske variabler) eller ved Mann-Whitney eller Kruskall-Wallis testene (for kvantitative variable sammenlignet i to eller flere grupper af patienter, hhv.) med p-værdi
   • Samlet overlevelse og sygdomsfri overlevelse i henhold til kliniske og biologiske risikofaktorer ved diagnose og under sygdomsudvikling, evalueret ved Kaplan-Meier produktgrænsemetoden og Cox proportional hazard model både for tidsafhængige og ikke tidsafhængige kovariater
5. UDVALG AF PATIENTER:

Inklusionskriterier:

• Konklusiv diagnose af myeloid eller lymfoid neoplasma i henhold til 2008 WHO-kriterier
• alder ≥ 18 år. Der er ingen øvre aldersgrænse
• underskrevet skriftligt informeret samtykke

Ekskluderingskriterier:

• alvorlig neurologisk eller psykiatrisk lidelse, der forstyrrer evnen til at give et informeret samtykke
• intet skriftligt informeret samtykke

• intet samtykke til biobanking

  7. STUDIEDESIGN:

Dette er en multicentrisk, prospektiv, observationsundersøgelse. Alle patienter med en diagnose af hæmatologisk malignitet i henhold til WHO-klassifikation udført inden for REL klinisk netværk er beregnet til at blive indskrevet.

8. ASPEKTER AF GOD KLINISK PRAKSIS, DATAFORBINDELSE

Biobanking er underlagt de generelle lovgivningsmæssige rammer for biomedicinsk forskning. Dette er en mosaik af formelle juridiske instrumenter og reguleringsorganer, der er indført på nationalt og europæisk plan, såvel som mere uformelle typer af styringsværktøjer og -instrumenter såsom professionelle retningslinjer og bedste praksis. Regulering af biomedicinsk forskning består af bindende og ikke-bindende juridiske instrumenter på både nationalt og europæisk plan. Dette er i form af specifik lovgivning for medicinsk forskning - for eksempel Europarådets Oviedo-konvention 1997 - og mere generelle juridiske instrumenter - såsom menneskerettigheder og databeskyttelseslovgivning - hvoraf nogle har relevans for biobanking. Ansvaret for tilsyn med forskning og sikring af overholdelse af lovkravene er i vid udstrækning blevet delegeret til nationale organer, såsom forskningsetiske komitéer.

8.1 DATAINDSAMLING

Undersøgelsen overvejer indsamling af kliniske og biologiske uundværlige data til en præcis diagnostisk og prognostisk standarddefinition i en ad-hoc elektronisk CRF og analyse af specifikke gener, der kan være involveret i sygdommenes molekylære grundlag gennem en NGS-teknik.

8.2 KLINISK DATAWAREHOUSE (Informatik til integration af biologi og sengekanten, I2B2)

Informatics for Integrating Biology and the Bedside (i2b2, www.i2b2.org) er et open source klinisk datavarehus, som effektivt udspørges for at finde sæt af interessante patienter, der bevarer deres privatliv gennem en forespørgselsværktøjsgrænseflade. Inden for denne arkitektur er interoperable softwareobjekter på serversiden, kaldet "celler", i stand til at udveksle information med hinanden, afhængigt af webserviceteknologi.

For at understøtte og forbedre effektiviteten af ​​klinisk forskning i onkologi udviklede og implementerede Pavia University og IRCCS Fondazione Salvatore Maugeri fra Pavia en ny IKT-platform, kaldet Onco-i2b2, baseret på i2b2-softwaren og installeret i IRCCS Fondazione S. Maugeri, Pavia. Onco-i2b2 er i stand til at integrere data fra forskellige kilder inde i i2b2 datavarehuset gennem implementering af en kompleks it-arkitektur, som omfatter udvikling af nye i2b2-celler til dataanalyse.

Som et resultat af dette projekt er hospitalsforskere blevet i stand til at indhente information fra patologidatabasen, fra et biobankstyringssystem og fusionere dem med den kliniske information, der findes i hospitalets informationssystem, for at udvælge interessante patienter med en specifik fænotype af interesse.

8.3 TEKNISK BESKRIVELSE AF PSEUDONYMISERINGSPROCES OG BRUGTE VÆRKTØJER

Der findes faktisk ikke en specifik regulering på nationalt plan for tekniske aspekter vedrørende biobank, men nogle arbejdsgrupper af eksperter (f.eks. AIOM og SIAPEC-IAP) har rejst initiativer til at definere og harmonisere de eksisterende nationale generelle procedurer. En kort liste over strukturelle og teknologiske krav kan identificeres i:

1. Definition af en programmatisk dokumentation med formål om biobanken, en funktionsspecifikation, der skal udføres, typen af ​​det konserverede materiale, antal forventede prøver, metoder til udtagning, behandling og konservering, håndtering af information, prøvetransport og modtagelse fra den modtagende enhed , styring af den mulige biologiske risiko og en økonomisk plan for mellem-lang periode
2. Logisk definition af de dedikerede lokale, konditioneringssystemer og adgangskontrol. I afhængighed skal temperaturen på kryo-beholderne overvåges kontinuerligt.
3. Disaster recovery plan for udstyr og kryobeholdere skal defineres (f.eks. brug af systemer til elektrisk kontinuitet eller liste over kompetent personale, der bør gribe ind, når særlige begivenheder opstår)
4. Det anbefales at bruge et certificeret kvalitetssystem for hvert trin i de forskellige procedurer, der holder styr på datakvaliteten fra erhvervelsen af ​​det informerede samtykke til opbevaringen af ​​prøven
5. Definition af et dedikeret informationssystem til styring af biobankprøverne, relateret til klinisk information, der er lagret i hospitalets informationssystem, til at spore prøvens bevægelser og opdatere de opfølgningsdata, der stammer fra den udførte videnskabelige forskning.
6. Disaster recovery plan også for it-arkitekturen skal implementeres. Den består i en trinvis sikkerhedskopiering af alle biobankdata, der gør det muligt for IT-systemadministratorerne at gendanne al information inden for et hvilket som helst tidsrum. I den onkologiske biobank "Bruno Boerci" identificeres hver biologisk prøve med en specifik kode, trykt på røret ved hjælp af en datamatrixstregkode (en todimensionel stregkode, der kan læses ved brug af en laserscanner), og gemt i biobankdatabasen og administreret af biobankstyringssoftwaren, der også gør det muligt at se dens position inde i biobankens kryobeholder. Kliniske data for hver opfølgning indsamles automatisk og henter data fra hospitalets informationssystem. Kliniske data og biobankoplysninger indsættes konstant og kontinuerligt i klinisk datavarehus ved en automatisk opdateringsprocedure. Kliniske og patologiske data er kodificeret ved hjælp af SNOMED, ​​TNM og ICD9-CM standarder. Brugen af ​​BRISQ-systemet til datastandardisering (Biospecimen Reporting for Improved Study Quality, Biopreservation and Biobanking, 2011) anbefales, men er ikke implementeret endnu.

8.4 OVERFØRSEL AF PATIENTPRØVER OG BIOBANKPRØVER INDGANG

Anonymisering af bioprøver (eller bedre, afidentifikation) skal udføres for at sikre høje niveauer af databeskyttelse. Den terminologi, der bruges i de europæiske dokumenter, identificerer udtrykket "anonymiseret", når biologisk materiale opbevares sammen med tilhørende information, såsom typen af ​​tumor, medicinsk behandling, donorens alder og så videre, men alle oplysninger, der gør det muligt at identificere forskningsdeltageren eller patienten strippes, enten irreversibelt (unlinked anonymiseret) eller reversibelt (linked anonymiseret). Ved tilknyttede anonymiserede prøver er identifikation mulig ved en kode, som forskere eller andre brugere af materialet - som en del af definitionen af ​​begrebet "reversibelt/tilknyttet anonymiseret" - ikke har adgang til. Kodede prøver har de samme egenskaber som sammenkædede (reversibelt) anonymiserede prøver, den eneste forskel er, at forskere og brugere har adgang til koden.

I dette projekt foretrækkes brugen af ​​kodet-anonymisering for at have et tilstrækkeligt niveau af privatlivssikkerhed og gennemførlighed af forskningsaktiviteter.

Den foreslåede arkitektur, som vil implementere denne type af-identifikation, kræver definitionen af ​​en kode, der identificerer bioprøven fra begyndelsen, og en anden kode, der vil blive genereret, før prøven gemmes i biobanken. En tredje kode vil automatisk genereres under acceptfasen af ​​prøven og vil blive gemt på et separat sted. På denne måde er informationen relateret til den første kode og dem, der er relateret til den sidste, fuldstændig afkoblet, medmindre den tredje kode er kendt: dette sker kun, når forskere skal have adgang til begge data samtidigt.

9 MOLEKOLAR ANALYSE

Den molekylære analyse udføres ved at bruge 2 forskellige NGS-platforme til mål-resekventeringen. Platformene er skitseret på baggrund af den nyeste litteratur om myeloid og lymfoid neoplasmas molekylære biologi. Det er bemærkelsesværdigt, at det videnskabelige samfunds indsats på dette område er enorm, og dette bidrager til en kontinuerlig strøm af ny information og opdagelser med den deraf følgende mulighed for at modificere platformene.