Perfil molecular de la enfermedad de las neoplasias malignas hematológicas (RELab1)

1. FONDO

   La medicina molecular es la rama del conocimiento que tiene por objeto dilucidar las bases genéticas de las enfermedades, mejorar la definición diagnóstica y la evaluación pronóstica de los pacientes y contribuir al desarrollo de tratamientos innovadores. La información genómica se utiliza cada vez más en el proceso de toma de decisiones de tratamiento para pacientes individuales. La implementación clínica de la medicina molecular requiere enfoques sistemáticos basados ​​en la integración de conocimientos científicos, médicos y tecnológicos.

   Las neoplasias malignas hematológicas incluyen leucemia, linfoma y mieloma múltiple. Las bases moleculares de muchas neoplasias hematológicas aún se desconocen. Según el conocimiento actual de los investigadores, los científicos saben que las neoplasias malignas hematológicas son en su mayoría enfermedades dinámicas que surgen de una gran serie de eventos biológicos y genéticos primarios y secundarios (es decir, mutaciones del conductor y del pasajero). La identificación de cambios moleculares clave que impulsan el desarrollo y la progresión del tumor es esencial para el desarrollo de nuevas terapias dirigidas y personalizadas.

   Las neoplasias hematológicas típicamente ocurren en personas mayores y, como resultado del envejecimiento de la población, representan un problema crítico creciente para las políticas de salud. Las neoplasias malignas hematológicas son un contexto ideal para la implementación de la medicina molecular. El ejemplo paradigmático de ello es la leucemia mieloide crónica, en la que el descubrimiento de la base molecular (el gen de fusión BCR/ABL1) se ha traducido en importantes avances clínicos en el diagnóstico, tratamiento y seguimiento de la enfermedad.

   La clasificación de neoplasias mieloides y linfoides de la Organización Mundial de la Salud (OMS) publicada en 2008 introdujo muchos cambios genéticos en la definición diagnóstica de los cánceres de la sangre. Desde 2008 se han identificado muchas lesiones genéticas en muchas neoplasias malignas hematológicas y la próxima clasificación de la OMS incluirá muchas de ellas.

   Las técnicas de secuenciación de próxima generación (NGS) fueron las que mejor contribuyeron a estos hallazgos.

   NGS utiliza herramientas de alta tecnología que pueden secuenciar, en poco tiempo y con costos relativamente bajos, todo el genoma o una parte específica de él (p. exoma o genes específicos). La ventaja de la NGS frente a la secuenciación estándar consiste en una mayor eficiencia (una gran cantidad de genes analizados rápidamente en una gran cantidad de muestras) y una mayor sensibilidad (capacidad de detectar mutaciones en clones muy pequeños de células neoplásicas). En los últimos años, la disponibilidad de nuevas tecnologías para la genómica ha permitido la detección de alto rendimiento de mutaciones somáticas en neoplasias malignas hematológicas. Se espera que los resultados de estos estudios mejoren significativamente el manejo de pacientes individuales a través de la implementación de sistemas innovadores de diagnóstico/pronóstico y el desarrollo de estrategias terapéuticas basadas en el perfil genómico individual.

   El Departamento de Hematología Oncológica, la Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo y la Universidad de Pavía han contribuido significativamente a la definición de la base molecular de las neoplasias malignas hematológicas. En 2005, la Universidad de Pavía describió la importancia diagnóstica y pronóstica de la mutación JAK2 V617F en las neoplasias mieloproliferativas (MPN): esta mutación se incluyó en la clasificación de MPN de la OMS y se desarrollaron fármacos anti-JAK2 innovadores. En 2010, la Universidad de Pavía se unió al Proyecto Genoma del Cáncer, un consorcio de Centros de investigación internacionales coordinados por el Instituto Wellcome Trust Sanger de Cambridge con el objetivo de dilucidar las bases moleculares del cáncer. En este contexto, mediante el uso de la secuenciación masiva del genoma, se describieron mutaciones recurrentes en el gen SF3B1, que codifica un componente central de la maquinaria de corte y empalme del ARN, en los síndromes mielodisplásicos.

   Además, en los últimos años, investigadores de la Universidad de Pavía hicieron una contribución significativa en la definición de la base molecular de las neoplasias linfoides (es decir, la mutación BRAF V600E en la leucemia de células peludas, la mutación MYD88 L265P en la enfermedad de Waldenstrom y las mutaciones SF3B1 en la leucemia linfocítica crónica). ). Finalmente, en los últimos meses la Universidad de Pavia tuvo un papel clave en la identificación de mutaciones CALR en NMP JAK2 negativo. Este es nuevamente un hallazgo importante en la comprensión de la base genética de este grupo de enfermedades.

   Además de la implementación de técnicas de próxima generación (NGS) para el análisis genómico, existe una clara necesidad de desarrollar soluciones efectivas para analizar e integrar datos moleculares y clínicos de grandes poblaciones de pacientes, con el fin de comprender completamente la relación entre el genotipo y el expresión clínica de una enfermedad.

   La implementación de la medicina molecular requiere enfoques sistemáticos basados ​​en la integración de la experiencia científica, clínica y tecnológica. En Italia, el contexto ideal para el desarrollo de programas de medicina molecular está representado por redes regionales hematológicas. Representan un modelo innovador de organización y colaboración, basado en la creación de redes de establecimientos de salud. La Rete Ematologica Lombarda (REL, www.rel-lombardia.net) reúne a 11 centros de referencia hematológicos y recientemente ha sentado las bases para un estudio sistemático de estas enfermedades. El objetivo estratégico de la red clínica REL es garantizar el mejor acceso a los establecimientos de salud, la alta calidad de los servicios y la continuidad de la atención para todos los pacientes hematológicos.

   La red clínica REL puede contribuir de manera crucial a la investigación traslacional de las neoplasias malignas hematológicas y, recientemente, con este propósito, la Regione Lombardia financió en enero de 2014 un grupo de biotecnología para la implementación del análisis genómico y el desarrollo de nuevos tratamientos para enfermedades hematológicas. El clúster de biotecnología REL (www.relab-lombardia.net) involucra al Departamento de Hematología Oncológica, Fondazione IRCCS Policlinico S. Matteo, la Universidad de Pavía, la empresa de biotecnología Clonit (www.clonit.it) y la farmacéutica Novartis. Este grupo tiene como objetivo investigar las bases moleculares de las neoplasias malignas hematológicas y desarrollar tratamientos personalizados.

2. OBJETIVO GENERAL del ESTUDIO

   En este estudio, el Departamento de Hematología Oncológica, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavía, en colaboración con la Universidad de Pavía y el IRCCS Fondazione Maugeri, Pavía, proporcionarán un análisis sistemático de mutaciones genéticas en neoplasias malignas hematológicas mediante técnicas de NGS.

   Se inscribirán pacientes con diagnóstico concluyente de neoplasias hematológicas según criterios de la OMS referidos a la red clínica REL. Los investigadores analizarán el ADN genómico y el ARN extraídos de células hematopoyéticas en diferentes momentos de la enfermedad del paciente. El estudio contempla el uso de dos plataformas moleculares optimizadas destinadas a la identificación de mutaciones recurrentes en neoplasias mieloides y linfoides, respectivamente.

   La detección de mutaciones genéticas por NGS se implementará prospectivamente en el contexto de la red clínica REL. Las muestras de los pacientes se analizarán en el momento del diagnóstico y de forma secuencial durante el curso de la enfermedad en momentos específicos.

   Los investigadores analizarán las correlaciones entre mutaciones somáticas, fenotipos clínicos específicos (según la clasificación de la OMS) y evolución de la enfermedad. Esto permitirá: 1) identificar nuevas mutaciones genéticas recurrentes involucradas en la patogenia molecular de las neoplasias malignas hematológicas; 2) definir el papel de los genes mutados, distinguiendo entre genes que inducen una proliferación clonal de células madre hematopoyéticas y genes que determinan el fenotipo clínico de la enfermedad; 3) identificar las mutaciones que son responsables de la evolución de la enfermedad; 4) definir la función de diagnóstico/pronóstico de las mutaciones identificadas y actualizar las clasificaciones de enfermedades actuales y las puntuaciones de pronóstico mediante la inclusión de parámetros moleculares.

   Se proporcionará un biobanco sistemático de material biológico.

3. OBJETIVOS

   El objetivo general del estudio es realizar un análisis sistemático de mutaciones genéticas asociadas a neoplasias malignas hematológicas mediante el uso de un enfoque de secuenciación dirigida NGS.

4. PUNTOS FINALES:

   • Incidencia acumulada (%) de mutaciones génicas en clon principal y subclones en cada neoplasia hematológica
   • Correlaciones genotipo - fenotipo entre características clínicas y estado mutacional, evaluadas por la prueba exacta de Fisher (para variables categóricas) o por las pruebas de Mann-Whitney o Kruskall-Wallis (para variables cuantitativas comparadas en dos o más grupos de pacientes, respectivamente) con valor p
   • Supervivencia global y supervivencia libre de enfermedad según factores de riesgo clínicos y biológicos al momento del diagnóstico y durante la evolución de la enfermedad, evaluada por el método de límite de producto de Kaplan-Meier y el modelo de riesgos proporcionales de Cox, tanto para covariables dependientes como no dependientes del tiempo
5. SELECCIÓN DE PACIENTES:

Criterios de inclusión:

• Diagnóstico concluyente de neoplasia mieloide o linfoide según los criterios de la OMS de 2008
• edad ≥ 18 años. No hay limite de edad
• consentimiento informado por escrito firmado

Criterio de exclusión:

• trastorno neurológico o psiquiátrico grave que interfiere con la capacidad de dar un consentimiento informado
• sin consentimiento informado por escrito

• sin consentimiento para biobancos

  7. DISEÑO DEL ESTUDIO:

Se trata de un estudio multicéntrico, prospectivo, observacional. Todos los pacientes con un diagnóstico de neoplasia hematológica maligna según la clasificación de la OMS realizado dentro de la red clínica REL están destinados a ser inscritos.

8. ASPECTOS DE BUENAS PRÁCTICAS CLÍNICAS, PRIVACIDAD DE DATOS

El biobanco se rige por el marco normativo general de la investigación biomédica. Se trata de un mosaico de instrumentos legales formales y organismos reguladores establecidos a nivel nacional y europeo, así como tipos más informales de herramientas e instrumentos de gobernanza, como directrices profesionales y mejores prácticas. La regulación de la investigación biomédica consiste en instrumentos legales vinculantes y no vinculantes tanto a nivel nacional como europeo. Esto tiene la forma de una ley específica para la investigación médica, por ejemplo, el Convenio de Oviedo del Consejo de Europa de 1997, e instrumentos legales más generales, como los derechos humanos y la ley de protección de datos, algunos de los cuales tienen relevancia para los biobancos. La responsabilidad de supervisar la investigación y garantizar el cumplimiento de los requisitos legales se ha delegado en gran medida a organismos nacionales, como los comités de ética de la investigación.

8.1 RECOPILACIÓN DE DATOS

El estudio contempla la recopilación de datos clínicos y biológicos indispensables para una definición estándar diagnóstica y pronóstica precisa en un CRF electrónico ad-hoc y el análisis de genes específicos que pueden estar involucrados en la base molecular de las enfermedades a través de técnicas de NGS.

8.2 ALMACÉN DE DATOS CLÍNICOS (Informatics for Integrating Biology and the Bedside, I2B2)

Informatics for Integrating Biology and the Bedside (i2b2, www.i2b2.org) es un almacén de datos clínicos de código abierto, que se interroga de manera eficiente para encontrar conjuntos de pacientes interesantes que preservan su privacidad a través de una interfaz de herramienta de consulta. Dentro de esta arquitectura, los objetos de software del lado del servidor interoperables, llamados "células", pueden intercambiar información entre sí, basándose en la tecnología de servicios web.

Con el fin de apoyar y mejorar la eficiencia de la investigación clínica en oncología, la Universidad de Pavia y la IRCCS Fondazione Salvatore Maugeri de Pavia desarrollaron e implementaron una nueva plataforma de TIC, llamada Onco-i2b2, basada en el software i2b2 e instalada en la IRCCS Fondazione. S. Maugeri, Pavía. Onco-i2b2 puede integrar datos de diferentes fuentes dentro del almacén de datos i2b2 mediante la implementación de una arquitectura de TI compleja, que incluye el desarrollo de nuevas células i2b2 para el análisis de datos.

Como resultado de este proyecto, los investigadores del hospital han podido obtener información de la base de datos de patología, de un sistema de gestión de biobanco y fusionarla con la información clínica presente en el sistema de información del hospital, para seleccionar pacientes interesantes con un fenotipo específico de interés.

8.3 DESCRIPCIÓN TÉCNICA DEL PROCESO DE SEUDONIMIZACIÓN Y HERRAMIENTAS UTILIZADAS

Actualmente no existe una regulación específica a nivel nacional para los aspectos técnicos relacionados con el biobanco, pero algunos grupos de trabajo de expertos (p. AIOM y SIAPEC-IAP) han planteado iniciativas para definir y armonizar los procedimientos generales nacionales existentes. Una breve lista de requisitos estructurales y tecnológicos se puede identificar en:

1. Definición de una documentación programática con el objetivo del biobanco, especificaciones funcionales a realizar, tipo de material preservado, número de especímenes esperados, métodos de extracción, procesamiento y conservación, manejo de la información, transporte y recepción de especímenes desde la unidad receptora. , gestión del posible riesgo biológico y un plan económico a medio-largo plazo
2. Definición lógica de los locales dedicados, sistemas de acondicionamiento y control de acceso. Además, la temperatura de los criocontenedores debe controlarse continuamente.
3. Se debe definir un plan de recuperación de desastres para equipos y contenedores criogénicos (p. uso de sistemas para la continuidad eléctrica o lista de personal competente que debe intervenir cuando ocurren eventos especiales)
4. Se recomienda el uso de un sistema de calidad certificado para cada paso de los diferentes procedimientos, haciendo un seguimiento de la calidad de los datos desde la obtención del consentimiento informado hasta el almacenamiento de la muestra.
5. Definición de un sistema de información dedicado a la gestión de las muestras del biobanco, relacionado con la información clínica almacenada en el sistema de información del hospital, para realizar el seguimiento de los movimientos de las muestras y actualizar los datos de seguimiento derivados de la investigación científica realizada.
6. También se debe implementar un plan de recuperación ante desastres para la arquitectura de TI. Consiste en una copia de seguridad incremental de todos los datos del biobanco que permite a los administradores del sistema informático restaurar toda la información en cualquier período de tiempo En el biobanco oncológico "Bruno Boerci" cada muestra biológica se identifica mediante un código específico, impreso en el tubo mediante un código de barras de matriz de datos (un código de barras bidimensional legible mediante el uso de un escáner láser), y almacenado en la base de datos del biobanco y administrado por el software de gestión del biobanco, que también permite ver su posición dentro del contenedor criogénico del biobanco. Los datos clínicos de cada seguimiento se recogen automáticamente recuperando datos del sistema de información del hospital. Los datos clínicos y la información del biobanco se insertan constante y continuamente en el almacén de datos clínicos mediante un procedimiento de actualización automática. Los datos clínicos y patológicos se codifican utilizando los estándares SNOMED, ​​TNM e ICD9-CM. Se recomienda el uso del sistema BRISQ para la estandarización de datos (Biospecimen Reporting for Improved Study Quality, Biopreservation and Biobanking, 2011), pero aún no se implementa.

8.4 TRASLADO DE MUESTRAS DE PACIENTES Y ENTRADA DE MUESTRAS AL BIOBANCO

La anonimización de los especímenes biológicos (o mejor, la desidentificación) debe realizarse para garantizar altos niveles de privacidad de datos. La terminología utilizada en los documentos europeos identifica el término 'anonimizado' cuando el material biológico se almacena junto con la información asociada, como el tipo de tumor, el tratamiento médico, la edad del donante, etc., pero toda la información que permitiría la identificación del participante de la investigación o el paciente es despojado, ya sea irreversiblemente (desvinculado anonimizado) o reversiblemente (vinculado anonimizado). En el caso de muestras anonimizadas vinculadas, la identificación es posible mediante un código, al que los investigadores u otros usuarios del material, como parte de la definición del término 'anonimizado de forma reversible/vinculada', no tienen acceso. Las muestras codificadas tienen las mismas características que las muestras anonimizadas vinculadas (reversiblemente), con la única diferencia de que los investigadores y los usuarios tienen acceso al código.

En este proyecto se prefiere el uso de anonimización codificada para tener un nivel adecuado de seguridad de privacidad y viabilidad de las actividades de investigación.

La arquitectura propuesta que implementará este tipo de desidentificación requiere la definición de un código que identifique el bioespécimen desde el principio y un segundo código que se generará antes de que el espécimen se almacene en el biobanco. Un tercer código se generará automáticamente durante la fase de aceptación de la muestra y se almacenará en un lugar separado. De esta manera, la información relacionada con el primer código y la relacionada con el final están totalmente desvinculadas, a menos que se conozca el tercer código: esto sucede solo cuando los investigadores necesitan acceder a ambos datos al mismo tiempo.

9 ANÁLISIS MOLECOLAR

El análisis molecular se realiza utilizando 2 plataformas NGS diferentes para la resecuenciación de objetivos. Las plataformas se describen sobre la base de la literatura más reciente sobre la biología molecular de las neoplasias mieloides y linfoides. Es de destacar que los esfuerzos de la comunidad científica en esta área son enormes, y esto contribuye a un flujo continuo de nueva información y descubrimientos, con la consiguiente posibilidad de modificar las plataformas.