Молекулярный профиль гематологических злокачественных новообразований (RELab1)

1. ФОН

   Молекулярная медицина — это область знаний, целью которой является выяснение генетической основы заболеваний, улучшение диагностики и прогностической оценки пациентов, а также содействие разработке инновационных методов лечения. Геномная информация все чаще используется в процессе принятия решений о лечении отдельных пациентов. Клиническое внедрение молекулярной медицины требует системных подходов, основанных на интеграции научных, медицинских и технологических знаний.

   Гематологические злокачественные новообразования включают лейкемию, лимфому и множественную миелому. Молекулярные основы многих гематологических новообразований до сих пор неизвестны. В настоящее время ученые знают, что гематологические злокачественные новообразования в основном представляют собой динамические заболевания, возникающие в результате большого ряда первичных и вторичных биологических и генетических событий (т. мутации водителя и пассажира). Выявление ключевых молекулярных изменений, которые управляют развитием и прогрессированием опухоли, имеет важное значение для разработки новых целевых и персонализированных методов лечения.

   Гематологические злокачественные новообразования обычно возникают у пожилых людей и в результате старения населения представляют собой растущую критическую проблему для политики здравоохранения. Гематологические злокачественные новообразования являются идеальным контекстом для внедрения молекулярной медицины. Парадигматическим примером этого является хронический миелоидный лейкоз, при котором открытие молекулярной основы (слитый ген BCR/ABL1) привело к крупным клиническим достижениям в диагностике, лечении и мониторинге заболеваний.

   Классификация миелоидных и лимфоидных новообразований Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), опубликованная в 2008 году, ввела множество генетических изменений в диагностическое определение рака крови. С 2008 г. было выявлено множество генетических поражений при многих гематологических злокачественных новообразованиях, и следующая классификация ВОЗ будет включать многие из них.

   Методы секвенирования нового поколения (NGS) внесли наибольший вклад в эти результаты.

   NGS использует высокотехнологичные инструменты, которые могут за короткое время и с относительно низкими затратами секвенировать весь геном или его определенную часть (например, экзом или гены-мишени). Преимущество NGS по сравнению со стандартным секвенированием заключается в более высокой эффективности (быстро анализируется большое количество генов в большом количестве образцов) и более высокой чувствительности (возможность обнаружения мутаций в очень маленьких клонах опухолевых клеток). В последние годы доступность новых технологий для геномики позволила проводить высокопроизводительный скрининг соматических мутаций при гематологических злокачественных новообразованиях. Ожидается, что результаты этих исследований значительно улучшат ведение отдельных пациентов за счет внедрения инновационных диагностических/прогностических систем и разработки терапевтических стратегий на основе индивидуального геномного профиля.

   Отделение гематологической онкологии Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo и Университета Павии внесли значительный вклад в определение молекулярной основы гематологических злокачественных новообразований. В 2005 г. в Университете Павии была описана диагностическая и прогностическая значимость мутации JAK2 V617F при миелопролиферативных новообразованиях (МПН): эта мутация была включена в классификацию ВОЗ для МПН, и были разработаны инновационные препараты против JAK2. В 2010 году Университет Павии присоединился к Проекту генома рака, консорциуму международных исследовательских центров, координируемому Кембриджским институтом Сангера Wellcome Trust, с целью выяснения молекулярной основы рака. В этом контексте с помощью массивного секвенирования генома при миелодиспластических синдромах были описаны повторяющиеся мутации в гене SF3B1, кодирующем основной компонент механизма сплайсинга РНК.

   Более того, в последние годы исследователи из Университета Павии внесли значительный вклад в определение молекулярной основы лимфоидных новообразований (например, мутация BRAF V600E при волосатоклеточном лейкозе, мутация MYD88 L265P при болезни Вальденстрема и мутации SF3B1 при хроническом лимфоцитарном лейкозе). ). Наконец, в самые последние месяцы Университет Павии сыграл ключевую роль в идентификации мутаций CALR в JAK2-негативной MPN. Это снова важное открытие в понимании генетической основы этой группы болезней.

   Помимо внедрения методов нового поколения (NGS) для геномного анализа, очевидно, что необходимо разработать эффективные решения для анализа и интеграции молекулярных и клинических данных больших групп пациентов, чтобы полностью понять взаимосвязь между генотипом и клиническое проявление болезни.

   Внедрение молекулярной медицины требует системных подходов, основанных на интеграции научных, клинических и технологических знаний. В Италии идеальный контекст для развития программ молекулярной медицины представлен региональными гематологическими сетями. Они представляют собой инновационную модель организации и сотрудничества, основанную на объединении медицинских учреждений в сеть. Rete Ematologica Lombarda (REL, www.rel-lombardia.net) объединяет 11 гематологических справочных центров и недавно послужила основой для систематического изучения этих заболеваний. Стратегической целью клинической сети REL является обеспечение лучшего доступа к медицинским учреждениям, высокое качество услуг и непрерывность помощи всем гематологическим пациентам.

   Клиническая сеть REL может внести решающий вклад в трансляционные исследования гематологических злокачественных новообразований, и недавно, с этой целью, регион Ломбардия в январе 2014 года профинансировал биотехнологический кластер для проведения геномного анализа и разработки новых методов лечения гематологических заболеваний. Кластер биотехнологий REL (www.relab-lombardia.net) включает Отделение гематологии и онкологии, Fondazione IRCCS Policlinico S. Matteo, Университет Павии, биотехнологическую компанию Clonit (www.clonit.it). и фармацевтическая компания Novartis. Этот кластер направлен на изучение молекулярной основы гематологических злокачественных новообразований и разработку персонализированных методов лечения.

2. ОБЩАЯ ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

   В этом исследовании Отделение гематологической онкологии Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Павия в сотрудничестве с Университетом Павии и IRCCS Fondazione Maugeri, Павия проведет систематический анализ генных мутаций при гематологических злокачественных новообразованиях с использованием методов NGS.

   Пациенты с окончательным диагнозом гематологических злокачественных новообразований в соответствии с критериями ВОЗ, направляемые в клиническую сеть REL, будут включены в исследование. Исследователи проанализируют геномную ДНК и РНК, извлеченные из гемопоэтических клеток в разные моменты времени заболевания пациента. В исследовании предполагается использование двух оптимизированных молекулярных платформ, направленных на идентификацию повторяющихся мутаций в миелоидных и лимфоидных новообразованиях соответственно.

   Скрининг генных мутаций с помощью NGS будет перспективно реализован в контексте клинической сети REL. Образцы пациентов будут анализироваться при постановке диагноза и последовательно в течение заболевания в определенные моменты времени.

   Исследователи проанализируют корреляции между соматическими мутациями, конкретными клиническими фенотипами (по классификации ВОЗ) и развитием заболевания. Это позволит: 1) выявить новые рецидивирующие генетические мутации, участвующие в молекулярном патогенезе гемобластозов; 2) определить роль мутантных генов, различая гены, индуцирующие клональную пролиферацию гемопоэтических стволовых клеток, и гены, определяющие клинический фенотип заболевания; 3) выявить мутации, ответственные за развитие болезни; 4) определить диагностическую/прогностическую роль идентифицированных мутаций и обновить текущие классификации болезней и прогностические показатели, включив молекулярные параметры.

   Будет обеспечено систематическое биобанкирование биологического материала.

3. ЦЕЛИ

   Общая цель исследования - провести систематический анализ генных мутаций, связанных с гематологическими злокачественными новообразованиями, с использованием подхода целевого секвенирования NGS.

4. КОНЕЧНЫЕ ТОЧКИ:

   • Совокупная частота (%) генных мутаций в основном клоне и субклонах при каждом гематологическом злокачественном новообразовании
   • Генотип - фенотипические корреляции между клиническими признаками и мутационным статусом, оцениваемые по точному критерию Фишера (для категориальных переменных) или по критерию Манна-Уитни или Крускелла-Уоллиса (для количественных признаков, сравниваемых в двух и более группах пациентов соответственно) с р-значение
   • Общая выживаемость и выживаемость без признаков заболевания в соответствии с клиническими и биологическими факторами риска при постановке диагноза и в ходе развития заболевания, оцененные с помощью метода предельного произведения Каплана-Мейера и модели пропорциональных рисков Кокса как для зависящих от времени, так и не зависящих от времени ковариаций
5. ОТБОР ПАЦИЕНТОВ:

Критерии включения:

• Окончательный диагноз миелоидного или лимфоидного новообразования в соответствии с критериями ВОЗ 2008 г.
• возраст ≥ 18 лет. Верхнего возрастного предела нет
• подписанное письменное информированное согласие

Критерий исключения:

• тяжелое неврологическое или психическое расстройство, препятствующее возможности дать информированное согласие
• нет письменного информированного согласия

• нет согласия на биобанкинг

  7. ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ:

Это многоцентровое проспективное обсервационное исследование. Все пациенты с диагнозом гемобластозы по классификации ВОЗ, выполненным в рамках клинической сети REL, подлежат включению в исследование.

8. АСПЕКТЫ НАДЛЕЖАЩЕЙ КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКИ, КОНФИДЕНЦИАЛЬНОСТЬ ДАННЫХ

Биобанкирование регулируется общей нормативно-правовой базой для биомедицинских исследований. Это мозаика формальных правовых инструментов и регулирующих органов, созданных на национальном и европейском уровнях, а также более неформальных типов инструментов и инструментов управления, таких как профессиональные руководства и передовая практика. Регулирование биомедицинских исследований состоит из обязательных и необязательных правовых инструментов как на национальном, так и на европейском уровне. Это в форме специального закона о медицинских исследованиях — например, Овьедской конвенции Совета Европы 1997 года — и более общих правовых инструментов, таких как права человека и закон о защите данных, некоторые из которых имеют отношение к биобанкингу. Ответственность за надзор за исследованиями и обеспечение соблюдения требований законодательства в основном делегирована национальным органам, таким как комитеты по этике научных исследований.

8.1 СБОР ДАННЫХ

Исследование предусматривает сбор необходимых клинических и биологических данных для точного диагностического и прогностического стандартного определения в специальной электронной CRF и анализ конкретных генов, которые могут быть вовлечены в молекулярную основу заболеваний, с помощью методов NGS.

8.2 ХРАНИЛИЩЕ КЛИНИЧЕСКИХ ДАННЫХ (Информатика для интеграции биологии и прикроватных тумбочек, I2B2)

Informatics for Integrating Biology and the Bedside (i2b2, www.i2b2.org) — это хранилище клинических данных с открытым исходным кодом, которое эффективно опрашивается для поиска групп интересных пациентов, сохраняющих свою конфиденциальность, с помощью интерфейса инструмента запроса. В рамках этой архитектуры взаимодействующие программные объекты на стороне сервера, называемые «ячейками», могут обмениваться информацией друг с другом, полагаясь на технологию веб-сервисов.

В целях поддержки и повышения эффективности клинических исследований в области онкологии Университет Павии и IRCCS Fondazione Salvatore Maugeri of Pavia разработали и внедрили новую платформу ИКТ под названием Onco-i2b2, основанную на программном обеспечении i2b2 и установленную в IRCCS Fondazione. С. Могери, Павия. Onco-i2b2 способна интегрировать данные из разных источников внутри хранилища данных i2b2 за счет реализации сложной ИТ-архитектуры, включающей разработку новых i2b2-ячеек для анализа данных.

В результате этого проекта исследователи больницы получили возможность получать информацию из базы данных патологии, из системы управления биобанком и объединять ее с клинической информацией, представленной в информационной системе больницы, для выбора интересных пациентов с определенным фенотипом. интерес.

8.3 ТЕХНИЧЕСКОЕ ОПИСАНИЕ ПРОЦЕССА ПСЕВДОНИМИЗАЦИИ И ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СРЕДСТВ

На самом деле специального регулирования на национальном уровне по техническим аспектам, касающимся биобанков, не существует, но некоторые рабочие группы экспертов (например, AIOM и SIAPEC-IAP) выдвинули инициативы по определению и гармонизации существующих национальных общих процедур. Краткий перечень конструктивно-технологических требований можно выделить в:

1. Определение программной документации с целью биобанка, выполняемой функциональной спецификации, типа сохраняемого материала, количества ожидаемых образцов, методов выемки, обработки и консервации, управления информацией, транспортировки и получения образцов из принимающей единицы. , управление возможным биологическим риском и экономический план на средне-большой период
2. Логическое определение выделенных местных жителей, систем кондиционирования и контроля доступа. В зависимости от этого температура криоконтейнеров должна постоянно контролироваться.
3. Должен быть определен план аварийного восстановления оборудования и криоконтейнеров (например, использование систем обеспечения непрерывности электроснабжения или список компетентного персонала, который должен вмешиваться при возникновении особых событий)
4. Рекомендуется использовать сертифицированную систему качества на каждом этапе различных процедур, отслеживая качество данных с момента получения информированного согласия до хранения образца.
5. Определение специальной информационной системы для управления образцами биобанка, относящейся к клинической информации, хранящейся в информационной системе больницы, для отслеживания перемещений образцов и обновления последующих данных, полученных в результате проведенных научных исследований.
6. Должен быть реализован план аварийного восстановления и для ИТ-архитектуры. Он заключается в инкрементном резервном копировании всех данных биобанка, что позволяет администраторам ИТ-систем восстанавливать всю информацию в любой период времени. матричный штрих-код данных (двумерный штрих-код, читаемый с помощью лазерного сканера), хранящийся в базе данных биобанка и управляемый программным обеспечением управления биобанком, что позволяет также просматривать его положение внутри криоконтейнера биобанка. Клинические данные для каждого последующего наблюдения собираются автоматически путем извлечения данных из информационной системы больницы. Клинические данные и информация из биобанка постоянно и непрерывно вводятся в хранилище клинических данных с помощью процедуры автоматического обновления. Клинические и патологические данные кодируются с использованием стандартов SNOMED, ​​TNM и ICD9-CM. Рекомендуется использовать систему BRISQ для стандартизации данных (отчетность о биообразцах для улучшения качества исследований, биосохранение и биобанкирование, 2011 г.), но это еще не реализовано.

8.4 ПЕРЕДАЧА ОБРАЗЦОВ ОТ ПАЦИЕНТОВ И ВХОД ОБРАЗЦОВ В БИОБАНК

Анонимизация биообразцов (или, лучше, деидентификация) должна выполняться для обеспечения высокого уровня конфиденциальности данных. Терминология, используемая в европейских документах, определяет термин «анонимизированный», когда биологический материал хранится вместе с сопутствующей информацией, такой как тип опухоли, лечение, возраст донора и т. д., но вся информация, которая позволила бы идентифицировать участника исследования или пациент раздевается либо необратимо (несвязанный анонимный), либо обратимо (связанный анонимный). В случае связанных анонимных образцов идентификация возможна по коду, к которому исследователи или другие пользователи материала — как часть определения термина «обратимо/связанные анонимизированные» — не имеют доступа. Закодированные образцы имеют те же характеристики, что и связанные (обратимо) анонимные образцы, с той лишь разницей, что исследователи и пользователи имеют доступ к коду.

В этом проекте предпочтение отдается использованию закодированной анонимизации, чтобы обеспечить адекватный уровень безопасности конфиденциальности и осуществимость исследовательской деятельности.

Предлагаемая архитектура, которая реализует этот тип деидентификации, требует определения кода, который идентифицирует биообразец с самого начала, и второго кода, который будет сгенерирован до того, как образец будет сохранен в биобанке. Третий код будет автоматически сгенерирован на этапе приемки образца и будет храниться в отдельном месте. Таким образом, информация, относящаяся к первому коду, и информация, относящаяся к последнему, полностью отделены друг от друга, если только не известен третий код: это происходит только тогда, когда исследователям требуется одновременный доступ к обоим данным.

9 МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ

Молекулярный анализ выполняется с использованием двух разных платформ NGS для целевого повторного секвенирования. Платформы изложены на основе новейшей литературы по молекулярной биологии миелоидных и лимфоидных новообразований. Примечательно, что усилия научного сообщества в этой области огромны, и это способствует непрерывному потоку новой информации и открытий, с последующей возможностью модификации платформ.