Profil chorób molekularnych nowotworów hematologicznych (RELab1)

1. TŁO

   Medycyna molekularna to dziedzina wiedzy, której celem jest wyjaśnienie genetycznego podłoża chorób, poprawa definicji diagnostycznej i oceny rokowniczej pacjentów oraz przyczynienie się do rozwoju innowacyjnych metod leczenia. Informacje genomowe są coraz częściej wykorzystywane w procesie podejmowania decyzji dotyczących leczenia poszczególnych pacjentów. Kliniczne wdrożenie medycyny molekularnej wymaga systematycznego podejścia opartego na integracji wiedzy naukowej, medycznej i technologicznej.

   Hematologiczne nowotwory złośliwe obejmują białaczkę, chłoniaka i szpiczaka mnogiego. Molekularne podłoże wielu nowotworów hematologicznych jest nadal nieznane. Na obecnym etapie wiedzy badaczy naukowcy wiedzą, że nowotwory hematologiczne to w większości choroby dynamiczne, które powstają w wyniku dużej serii pierwotnych i wtórnych zdarzeń biologicznych i genetycznych (tj. mutacje kierowcy i pasażera). Identyfikacja kluczowych zmian molekularnych, które napędzają rozwój i progresję nowotworu, jest niezbędna do opracowania nowych ukierunkowanych i spersonalizowanych terapii.

   Hematologiczne nowotwory złośliwe zwykle występują u osób starszych iw wyniku starzenia się społeczeństwa stanowią coraz poważniejszy problem dla polityki zdrowotnej. Nowotwory hematologiczne stanowią idealny kontekst dla wdrażania medycyny molekularnej. Paradygmatycznym tego przykładem jest przewlekła białaczka szpikowa, w przypadku której odkrycie podłoża molekularnego (gen fuzyjny BCR/ABL1) przełożyło się na duże postępy kliniczne w diagnostyce, leczeniu i monitorowaniu choroby.

   Opublikowana w 2008 roku klasyfikacja nowotworów szpikowych i limfoidalnych Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) wprowadziła wiele zmian genetycznych w diagnostyce nowotworów krwi. Od 2008 roku zidentyfikowano wiele zmian genetycznych w wielu nowotworach hematologicznych i kolejna klasyfikacja WHO obejmie wiele z nich.

   Techniki sekwencjonowania nowej generacji (NGS) w największym stopniu przyczyniły się do tych odkryć.

   NGS wykorzystuje zaawansowane technologicznie narzędzia, które mogą w krótkim czasie i przy stosunkowo niskich kosztach sekwencjonować cały genom lub jego określoną część (np. egzom lub geny docelowe). Przewaga NGS w porównaniu ze standardowym sekwencjonowaniem polega na wyższej wydajności (duża ilość genów szybko analizowanych w dużej liczbie próbek) oraz wyższej czułości (zdolność wykrywania mutacji w bardzo małych klonach komórek nowotworowych). W ostatnich latach dostępność nowych technologii genomicznych umożliwiła wysokowydajne badania przesiewowe mutacji somatycznych w nowotworach hematologicznych. Oczekuje się, że wyniki tych badań znacząco poprawią postępowanie z poszczególnymi pacjentami poprzez wdrożenie innowacyjnych systemów diagnostyczno-prognostycznych oraz opracowanie strategii terapeutycznych opartych na indywidualnym profilu genomicznym.

   Klinika Hematologii Onkologicznej, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo oraz Uniwersytet w Pawii znacząco przyczyniły się do zdefiniowania molekularnego podłoża nowotworów hematologicznych. W 2005 roku Uniwersytet w Pawii opisał znaczenie diagnostyczne i prognostyczne mutacji JAK2 V617F w nowotworach mieloproliferacyjnych (MPN): mutacja ta została włączona do klasyfikacji MPN WHO i opracowano innowacyjne leki anty-JAK2. W 2010 roku University of Pavia dołączył do Cancer Genome Project, konsorcjum międzynarodowych ośrodków badawczych koordynowanych przez Wellcome Trust Sanger Institute of Cambridge w celu wyjaśnienia molekularnych podstaw raka. W tym kontekście, stosując masowe sekwencjonowanie genomu, opisano powtarzające się mutacje w genie SF3B1 - który koduje główny składnik maszynerii składania RNA - w zespołach mielodysplastycznych.

   Ponadto w ostatnich latach naukowcy z Uniwersytetu w Pawii wnieśli znaczący wkład w zdefiniowanie molekularnego podłoża nowotworów układu limfatycznego (m.in. mutacja BRAF V600E w białaczce włochatokomórkowej, mutacja MYD88 L265P w chorobie Waldenstroma oraz mutacje SF3B1 w przewlekłej białaczce limfocytowej ). Wreszcie, w ostatnich miesiącach Uniwersytet w Pawii odegrał kluczową rolę w identyfikacji mutacji CALR w JAK2-ujemnym MPN. Jest to ponownie ważne odkrycie w zrozumieniu genetycznych podstaw tej grupy chorób.

   Oprócz wdrożenia technik nowej generacji (NGS) do analizy genomicznej istnieje wyraźna potrzeba opracowania skutecznych rozwiązań do analizy i integracji danych molekularnych i klinicznych dużych populacji pacjentów, aby w pełni zrozumieć związek między genotypem a kliniczna ekspresja choroby.

   Wdrażanie medycyny molekularnej wymaga systematycznego podejścia opartego na integracji wiedzy naukowej, klinicznej i technologicznej. We Włoszech idealnym kontekstem dla rozwoju programów medycyny molekularnej są regionalne sieci hematologiczne. Reprezentują innowacyjny model organizacji i współpracy, oparty na sieciowaniu placówek służby zdrowia. Rete Ematologica Lombarda (REL, www.rel-lombardia.net) zrzesza 11 hematologicznych ośrodków referencyjnych i ostatnio stworzyła podstawę do systematycznego badania tych chorób. Celem strategicznym sieci klinik REL jest zapewnienie lepszego dostępu do placówek służby zdrowia, wysokiej jakości usług oraz ciągłości opieki wszystkim pacjentom hematologicznym.

   Sieć kliniczna REL może wnieść istotny wkład w badania translacyjne nad nowotworami hematologicznymi, a ostatnio w tym celu Regione Lombardia w styczniu 2014 r. sfinansowała klaster biotechnologiczny do wdrażania analizy genomicznej i opracowywania nowych metod leczenia chorób hematologicznych. Klaster biotechnologiczny REL (www.relab-lombardia.net) obejmuje Oddział Hematologii Onkologicznej, Fondazione IRCCS Policlinico S. Matteo, Uniwersytet w Pawii, firmę biotechnologiczną Clonit (www.clonit.it) oraz firma farmaceutyczna Novartis. Celem tego klastra jest badanie molekularnych podstaw nowotworów hematologicznych i opracowywanie spersonalizowanych metod leczenia.

2. OGÓLNY CEL BADANIA

   W tym badaniu Departament Hematologii Onkologicznej, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia we współpracy z University of Pavia i IRCCS Fondazione Maugeri, Pavia zapewni systematyczną analizę mutacji genów w nowotworach hematologicznych za pomocą technik NGS.

   Zostaną włączeni pacjenci z ostatecznym rozpoznaniem nowotworów hematologicznych zgodnie z kryteriami WHO skierowani do sieci klinicznej REL. Naukowcy przeanalizują genomowe DNA i RNA wyekstrahowane z komórek krwiotwórczych w różnych punktach czasowych choroby pacjenta. W badaniu rozważa się wykorzystanie dwóch zoptymalizowanych platform molekularnych mających na celu identyfikację powtarzających się mutacji odpowiednio w nowotworach szpikowych i limfoidalnych.

   Badania przesiewowe mutacji genów za pomocą NGS będą prospektywnie wdrażane w kontekście sieci klinicznej REL. Próbki pacjentów będą analizowane w momencie diagnozy i sekwencyjnie podczas przebiegu choroby w określonych punktach czasowych.

   Badacze przeanalizują korelacje między mutacjami somatycznymi, określonymi fenotypami klinicznymi (według klasyfikacji WHO) a ewolucją choroby. Pozwoli to na: 1) identyfikację nowych powtarzających się mutacji genetycznych zaangażowanych w molekularną patogenezę nowotworów hematologicznych; 2) określić rolę zmutowanych genów, rozróżniając geny indukujące klonalną proliferację hematopoetycznych komórek macierzystych oraz geny determinujące kliniczny fenotyp choroby; 3) zidentyfikować mutacje odpowiedzialne za ewolucję choroby; 4) zdefiniować diagnostyczną/prognostyczną rolę zidentyfikowanych mutacji i zaktualizować aktualne klasyfikacje chorób i wyniki prognostyczne poprzez uwzględnienie parametrów molekularnych.

   Zapewnione zostanie systematyczne biobankowanie materiału biologicznego.

3. CELE

   Ogólnym celem badania jest przeprowadzenie systematycznej analizy mutacji genów związanych z nowotworami hematologicznymi przy użyciu ukierunkowanego sekwencjonowania NGS.

4. PUNKTY KOŃCOWE:

   • Skumulowana częstość (%) mutacji genów w głównym klonie i subklonach w każdym nowotworu hematologicznym
   • Genotyp – korelacje fenotypowe między cechami klinicznymi a statusem mutacji, oceniane dokładnym testem Fishera (dla zmiennych kategorycznych) lub testami Manna-Whitneya lub Kruskalla-Wallisa (dla zmiennych ilościowych porównywanych odpowiednio w dwóch lub więcej grupach pacjentów) z wartość p
   • Całkowite przeżycie i przeżycie wolne od choroby zgodnie z klinicznymi i biologicznymi czynnikami ryzyka w momencie rozpoznania i podczas ewolucji choroby, oceniane metodą limitu iloczynu Kaplana-Meiera i modelem proporcjonalnego hazardu Coxa zarówno dla współzmiennych zależnych, jak i niezależnych od czasu
5. DOBÓR PACJENTÓW:

Kryteria przyjęcia:

• Ostateczne rozpoznanie nowotworu szpikowego lub limfoidalnego zgodnie z kryteriami WHO z 2008 roku
• wiek ≥ 18 lat. Nie ma górnej granicy wieku
• podpisana pisemna świadoma zgoda

Kryteria wyłączenia:

• ciężkie zaburzenie neurologiczne lub psychiatryczne utrudniające wyrażenie świadomej zgody
• brak pisemnej świadomej zgody

• brak zgody na biobankowanie

  7. PROJEKT STUDIUM:

Jest to wieloośrodkowe, prospektywne badanie obserwacyjne. Do badania kwalifikowani są wszyscy pacjenci z rozpoznaniem nowotworu hematologicznego zgodnie z klasyfikacją WHO przeprowadzoną w ramach sieci klinicznej REL.

8. ASPEKTY DOBREJ PRAKTYKI KLINICZNEJ, PRYWATNOŚĆ DANYCH

Biobankowanie podlega ogólnym ramom regulacyjnym dotyczącym badań biomedycznych. Jest to mozaika formalnych instrumentów prawnych i organów regulacyjnych wprowadzonych na poziomie krajowym i europejskim, a także bardziej nieformalnych rodzajów narzędzi i instrumentów zarządzania, takich jak profesjonalne wytyczne i najlepsze praktyki. Regulacja badań biomedycznych składa się z wiążących i niewiążących instrumentów prawnych zarówno na poziomie krajowym, jak i europejskim. Ma to formę szczegółowych przepisów dotyczących badań medycznych — na przykład Konwencji Rady Europy z Oviedo z 1997 r. — oraz bardziej ogólnych instrumentów prawnych — takich jak prawa człowieka i prawo ochrony danych — z których niektóre mają znaczenie dla biobanków. Odpowiedzialność za nadzór nad badaniami i zapewnienie zgodności z wymogami prawnymi została w dużej mierze delegowana na organy krajowe, takie jak komisje ds. etyki badań.

8.1 GROMADZENIE DANYCH

Badanie obejmuje gromadzenie danych klinicznych i biologicznych niezbędnych do precyzyjnego zdefiniowania standardu diagnostycznego i prognostycznego w elektronicznym CRF ad-hoc oraz analizę określonych genów, które mogą być zaangażowane w molekularne podłoże chorób za pomocą technik NGS.

8.2 HURTOWNIA DANYCH KLINICZNYCH (Informatyka do Integracji Biologii i Przyłóżkowa, I2B2)

Informatics for Integrating Biology and the Bedside (i2b2, www.i2b2.org) to hurtownia danych klinicznych typu open source, która jest skutecznie przesłuchiwana w celu znalezienia zestawów interesujących pacjentów, zachowujących ich prywatność za pomocą interfejsu narzędzia do wyszukiwania. W ramach tej architektury interoperacyjne obiekty oprogramowania po stronie serwera, zwane „komórkami”, są w stanie wymieniać między sobą informacje, opierając się na technologii usług sieciowych.

W celu wsparcia i poprawy efektywności badań klinicznych w onkologii, Uniwersytet w Pawii oraz IRCCS Fondazione Salvatore Maugeri z Pawii opracowały i wdrożyły nowatorską platformę ICT o nazwie Onco-i2b2, opartą na oprogramowaniu i2b2 i zainstalowaną w IRCCS Fondazione S. Maugeri, Pawia. Onco-i2b2 jest w stanie integrować dane z różnych źródeł w hurtowni danych i2b2 poprzez wdrożenie złożonej architektury IT, która obejmuje rozwój nowych komórek i2b2 do analizy danych.

Dzięki temu projektowi badacze szpitalni uzyskali możliwość pozyskiwania informacji z bazy danych patologii, systemu zarządzania biobankami oraz łączenia ich z informacjami klinicznymi obecnymi w systemie informatycznym szpitala w celu wyselekcjonowania interesujących pacjentów o określonym fenotypie odsetki.

8.3 OPIS TECHNICZNY PROCESU PSEUDONIMIZACJI I WYKORZYSTYWANYCH NARZĘDZI

W rzeczywistości nie istnieje szczegółowe rozporządzenie na szczeblu krajowym dotyczące aspektów technicznych związanych z biobankami, ale niektóre grupy robocze ekspertów (np. AIOM e SIAPEC-IAP) podjęły inicjatywy mające na celu zdefiniowanie i harmonizację istniejących krajowych procedur ogólnych. Krótką listę wymagań konstrukcyjnych i technologicznych można znaleźć w:

1. Definicja dokumentacji programowej z celem biobanku, specyfikacją funkcjonalną do wykonania, rodzajem zabezpieczanego materiału, przewidywaną liczbą okazów, metodami pozyskiwania, przetwarzania i konserwacji, zarządzaniem informacją, transportem okazów i odbiorem z jednostki przyjmującej , zarządzanie ewentualnym ryzykiem biologicznym oraz plan ekonomiczny na średnio-duży okres
2. Logiczna definicja dedykowanych lokali, systemów kondycjonowania i kontroli dostępu. Ponadto temperatura kriopojemników musi być stale monitorowana.
3. Należy określić plan odzyskiwania sprzętu i pojemników kriogenicznych po awarii (np. stosowanie systemów zapewniających ciągłość elektryczną lub wykaz kompetentnych pracowników, którzy powinni interweniować w przypadku wystąpienia szczególnych zdarzeń)
4. Zaleca się stosowanie certyfikowanego systemu jakości na każdym etapie różnych procedur, ze śledzeniem jakości danych od uzyskania świadomej zgody do przechowywania próbki
5. Zdefiniowanie dedykowanego systemu informatycznego do zarządzania próbkami biobanku, związanego z informacjami klinicznymi przechowywanymi w systemie informatycznym szpitala, w celu śledzenia ruchu próbek i aktualizacji danych uzupełniających wynikających z przeprowadzonych badań naukowych.
6. Plan Disaster Recovery również dla architektury IT musi zostać wdrożony. Polega na wykonywaniu przyrostowej kopii zapasowej wszystkich danych biobanku, która umożliwia administratorom systemu informatycznego odtworzenie wszystkich informacji w dowolnym okresie czasu. kod kreskowy data matrix (dwuwymiarowy kod kreskowy odczytywalny za pomocą skanera laserowego) i przechowywany w bazie danych biobanku oraz zarządzany przez oprogramowanie do zarządzania biobankami, które umożliwia również podgląd jego położenia wewnątrz pojemnika kriogenicznego biobanku. Dane kliniczne dla każdej wizyty kontrolnej są gromadzone automatycznie pobierając dane z systemu informatycznego szpitala. Dane kliniczne i informacje o biobankach są stale i nieprzerwanie wprowadzane do hurtowni danych klinicznych za pomocą procedury automatycznej aktualizacji. Dane kliniczne i patologiczne są skodyfikowane przy użyciu standardów SNOMED, ​​TNM i ICD9-CM. Stosowanie systemu BRISQ do standaryzacji danych (Biospecimen Reporting for Improved Study Quality, Biopreservation and Biobanking, 2011) jest zalecane, ale jeszcze nie wdrożone.

8.4 WEJŚCIE NA PRÓBKI PACJENTÓW I PRÓBKI BIOBANKOWE

Aby zapewnić wysoki poziom prywatności danych, należy przeprowadzić anonimizację próbek biologicznych (lub lepiej deidentyfikację). Terminologia stosowana w dokumentach europejskich określa termin „zanonimizowany”, gdy materiał biologiczny jest przechowywany wraz z powiązanymi informacjami, takimi jak rodzaj nowotworu, leczenie, wiek dawcy itd., ale wszystkie informacje, które umożliwiłyby identyfikację uczestnika badania lub pacjent jest usuwany, albo nieodwracalnie (anonimizacja niepołączona) lub odwracalna (anonimizacja powiązana). W przypadku połączonych zanonimizowanych próbek identyfikacja jest możliwa za pomocą kodu, do którego badacze lub inni użytkownicy materiału – w ramach definicji terminu „anonimizowane w sposób odwracalny/powiązany” – nie mają dostępu. Zakodowane próbki mają te same cechy, co powiązane (odwracalnie) anonimowe próbki, z tą różnicą, że badacze i użytkownicy mają dostęp do kodu.

W tym projekcie preferowane jest stosowanie szyfrowanej anonimizacji w celu zapewnienia odpowiedniego poziomu bezpieczeństwa prywatności i możliwości prowadzenia działań badawczych.

Proponowana architektura, która zaimplementuje ten rodzaj deidentyfikacji, wymaga zdefiniowania kodu, który identyfikuje okaz biologiczny od początku oraz drugiego kodu, który zostanie wygenerowany przed umieszczeniem okazu w biobanku. Trzeci kod zostanie automatycznie wygenerowany podczas fazy akceptacji próbki i będzie przechowywany w oddzielnym miejscu. W ten sposób informacje związane z pierwszym kodem i te związane z ostatnim kodem są całkowicie oddzielone, chyba że znany jest trzeci kod: dzieje się tak tylko wtedy, gdy badacze muszą uzyskać dostęp do obu danych jednocześnie.

9 ANALIZA MOLEKOLARNA

Analiza molekularna jest przeprowadzana przy użyciu 2 różnych platform NGS do ponownego sekwencjonowania celu. Platformy przedstawiono na podstawie najnowszej literatury dotyczącej biologii molekularnej nowotworów szpikowych i limfoidalnych. Warto zauważyć, że wysiłek środowiska naukowego w tym zakresie jest ogromny, a to przyczynia się do ciągłego przepływu nowych informacji i odkryć, a co za tym idzie możliwości modyfikacji platform.