Neinvazivní prenatální diagnostika monogenních poruch pomocí technologie Linked-reads (NID)

Cíle:

Popis bezbuněčné fetální DNA v mateřské plazmě nabídl možnost neinvazivního přístupu k prenatální diagnostice (Non Invasive Prenatal Diagnosis, NIPD). Avšak pouze malá část celkové bezbuněčné DNA je fetálního původu a její studium se rozšířilo teprve nedávno s rozvojem nových technologií, jako je digitální PCR a Massively Parallel Sequencing.

Cirkulující fetální buňky (CFC) představují slibný přístup, ale před rutinní implementací vyžadují další vývoj Dosud jsou klinické aplikace omezeny na neinvazivní prenatální testování fetální aneuploidie a neinvazivní detekci genomových oblastí specifických pro plod, například určení pohlaví plodu nebo fetální RHD genotypizace, nebo nověji de novo mutace, které mohou být podezřelé po echografických nálezech, jako je achondroplázie. Přesto zůstává NIPD monogenních onemocnění dědičných po matce náročná, protože fetální alela je skryta ve velkém množství identických mateřských sekvencí. Některé publikace uvádějí úspěšnou NIPD mateřských monogenních onemocnění, ale pouze na kazuistikách nebo malých kohortách, bez standardizovaného protokolu a kontroly statistických rizik.

V této studii se zaměřujeme na:

• vyvinout nový neinvazivní přístup k prenatální diagnostice využívající jak přímou, tak nepřímou strategii pomocí Massively Parallel Sequencing,
• identifikovat a charakterizovat CFC.

Metody:

Nedávno jsme získali technologii Chromium™ (10XGenomics™). Tento přístup, který se opírá o mikrofluidní sekvenování spojeného čtení, umožňuje přímé fázování haplotypů z dlouhých vstupních molekul DNA, v tomto případě rodičovské genomické DNA. Je tedy možné identifikovat haplotyp spojený s mutantem pro každého rodiče a odvodit fetální stav se současnou analýzou plazmové DNA.

Páry s rizikem přenosu cystické fibrózy plánujeme zařadit do genetického poradenství pro prenatální diagnostiku (PND). Neinvazivní analýza bude provedena současně s konvenční PND, která bude provedena na invazivním vzorku plodu. Po sekvenování použijeme nový analytický algoritmus, který umožňuje přísnou kontrolu statistického rizika.

Kromě toho plánujeme použití Chromium Single Cell Solution (10XGenomics™) k izolaci CFC. Tento přístup umožňuje analýzu genové exprese jedné buňky z tisíců buněk ve vzorku.

Očekávané výsledky:

Do této první studie chceme zahrnout 20 párů v průběhu 12 měsíců, což bude představovat největší dosud publikovanou kohortu.

Naším cílem je posoudit proveditelnost této nové slibné technologie univerzálního haplotypování pomocí sekvenování spojeného čtení v kontextu NIPD monogenních onemocnění, pokud jde o přesnost výsledků, jakož i dobu analýzy a technické náklady. Tento přímočarý protokol otevírá perspektivy pro neinvazivní přístup prvního záměru k prenatální diagnostice familiárních monogenních onemocnění.

Jednobuněčný roztok nám také umožní rozlišit typy buněk cirkulujících v mateřské krvi a identifikovat molekulární markery pro izolaci CFC.