Diagnosi prenatale non invasiva dei disturbi monogenici mediante tecnologia di lettura collegata (NID)

Obiettivi:

La descrizione del DNA fetale libero nel plasma materno ha offerto la possibilità di un approccio non invasivo per la diagnosi prenatale (Diagnosi prenatale non invasiva, NIPD). Tuttavia, solo una piccola frazione del DNA libero totale è di origine fetale e il suo studio si è ampliato solo di recente con lo sviluppo di nuove tecnologie, come la PCR digitale e il Massively Parallel Sequencing.

Le cellule fetali circolanti (CFC) rappresentano un approccio promettente, ma necessitano di ulteriore sviluppo prima dell'implementazione di routine Ad oggi, le applicazioni cliniche sono limitate ai test prenatali non invasivi per l'aneuploidia fetale e al rilevamento non invasivo di regioni genomiche specifiche del feto, ad esempio la determinazione del sesso fetale o genotipizzazione fetale RHD, o più recentemente mutazioni de novo che possono essere sospettate dopo reperti ecografici, come l'acondroplasia. Tuttavia, la NIPD delle malattie monogeniche ereditate dalla madre rimane una sfida, poiché l'allele fetale è nascosto all'interno di una grande quantità di sequenze materne identiche. Alcune pubblicazioni riportano il NIPD di successo di malattie monogeniche ereditate dalla madre, ma solo su case report o piccole coorti, senza un protocollo standardizzato e controllo dei rischi statistici.

In questo studio ci proponiamo di:

• sviluppare un nuovo approccio non invasivo alla diagnosi prenatale utilizzando sia la strategia diretta che quella indiretta mediante sequenziamento massivo parallelo,
• identificare e caratterizzare i CFC.

Metodi:

Di recente abbiamo acquisito la tecnologia Chromium™ (10XGenomics™). Questo approccio, che si basa sul sequenziamento di lettura collegata basato su microfluidica, consente la fasatura diretta dell'aplotipo da lunghe molecole di DNA di input, in questo caso DNA genomico parentale. È quindi possibile identificare l'aplotipo legato al mutante per ciascun genitore e dedurre lo stato fetale con l'analisi concomitante del DNA plasmatico.

Abbiamo in programma di includere le coppie a rischio di trasmissione della fibrosi cistica, durante la consulenza genetica per la diagnosi prenatale (PND). L'analisi non invasiva verrà eseguita in concomitanza con la PND convenzionale, che verrà eseguita su un campione fetale invasivo. Dopo il sequenziamento, utilizzeremo un nuovo algoritmo di analisi che consente un controllo rigoroso del rischio statistico.

Inoltre, prevediamo di utilizzare la Chromium Single Cell Solution (10XGenomics™) per isolare il CFC. Questo approccio consente l'analisi dell'espressione genica di una singola cellula da migliaia di cellule in un campione.

Risultati aspettati:

In questo primo studio, desideriamo includere 20 coppie nel corso di 12 mesi, che rappresenteranno la più grande coorte pubblicata fino ad oggi.

Miriamo a valutare la fattibilità di questa nuova promettente tecnologia di Universal Haplotyping mediante sequenziamento a lettura collegata nel contesto di NIPD di malattie monogeniche, in termini di accuratezza dei risultati, tempi di analisi e costi tecnici. Questo semplice protocollo apre prospettive per un approccio non invasivo di prima intenzione della diagnosi prenatale delle malattie monogeniche familiari.

La Single Cell Solution ci consentirà inoltre di differenziare i tipi di cellule circolanti nel sangue materno e di identificare marcatori molecolari per isolare il CFC.