Diagnóstico Pré-Natal Não Invasivo de Distúrbios Monogênicos por Tecnologia Linked-reads (NID)

Objetivos.

A descrição do DNA fetal livre de células no plasma materno ofereceu a possibilidade de uma abordagem não invasiva para o diagnóstico pré-natal (Non Invasive Prenatal Diagnosis, NIPD). No entanto, apenas uma pequena fração do DNA total livre de células é de origem fetal, e seu estudo foi ampliado apenas recentemente com o desenvolvimento de novas tecnologias, como PCR digital e Sequenciamento Massivamente Paralelo.

Células fetais circulantes (CFC) representam uma abordagem promissora, mas precisam de mais desenvolvimento antes da implementação de rotina genotipagem RHD fetal ou, mais recentemente, mutações de novo que podem ser suspeitadas após achados ecográficos, como acondroplasia. No entanto, o NIPD de doenças monogênicas herdadas da mãe continua sendo um desafio, pois o alelo fetal está oculto em uma grande quantidade de sequências maternas idênticas. Algumas publicações relatam NIPD com sucesso de doenças monogênicas hereditárias maternas, mas apenas em relatos de casos ou pequenas coortes, sem um protocolo padronizado e controle de riscos estatísticos.

Neste estudo, pretendemos:

• desenvolver uma nova abordagem não invasiva para o diagnóstico pré-natal usando estratégia direta e indireta por sequenciamento massivamente paralelo,
• para identificar e caracterizar CFC.

Métodos:

Recentemente adquirimos a tecnologia Chromium™ (10XGenomics™). Essa abordagem, baseada em sequenciamento de leitura vinculada baseado em microfluídicos, permite a faseamento direto de haplótipos de longas moléculas de DNA de entrada, neste caso, DNA genômico parental. Portanto, é possível identificar o haplótipo ligado ao mutante para cada progenitor e deduzir o estado fetal com análise concomitante de DNA plasmático.

Pretendemos incluir casais com risco de transmissão de fibrose cística, durante o aconselhamento genético para diagnóstico pré-natal (PND). A análise não invasiva será realizada concomitantemente ao PND convencional, que será realizado em amostra fetal invasiva. Após o sequenciamento, utilizaremos um novo algoritmo de análise que permite um controle rigoroso do risco estatístico.

Além disso, planejamos usar a solução de célula única de cromo (10XGenomics™) para isolar CFC. Esta abordagem permite a análise da expressão gênica de célula única de milhares de células em uma amostra.

Resultados esperados:

Neste primeiro estudo, desejamos incluir 20 casais ao longo de 12 meses, o que representará a maior coorte publicada até o momento.

Nosso objetivo é avaliar a viabilidade desta nova tecnologia promissora de Haplotipagem Universal por sequenciamento de leitura ligada no contexto de NIPD de doenças monogênicas, em termos de precisão de resultado, bem como tempo de análise e custo técnico. Este protocolo simples abre perspectivas para uma abordagem não invasiva de primeira intenção de diagnóstico pré-natal de doenças monogênicas familiares.

A Single Cell Solution também nos permitirá diferenciar os tipos de células que circulam no sangue materno e identificar marcadores moleculares para isolar CFC.