Histologické hodnocení tvorby tvrdých tkání po přímém uzavření buničiny pomocí RetroMTA (RetroMTA)

Studie byla provedena v souladu s principy Helsinské deklarace Světové lékařské asociace. Do studie bylo zahrnuto sedm bezkazových, intaktních, maxilárních a mandibulárních třetích molárů od lidí ve věku 30-37 let, které byly naplánovány k extrakci pro ortodontické nebo chirurgické účely. Pacienti dostali důkladné vysvětlení experimentálního zdůvodnění, klinických postupů a možných komplikací. Všechny experimentální protokoly byly nezávisle přezkoumány a schváleny místní etickou komisí Pomořské lékařské univerzity, Štětín, Polsko (číslo schválení KB-0012/27/13).

Klinický protokol. U všech zahrnutých zubů byly pořízeny periapikální rentgenové snímky, aby se vyloučila přítomnost kazu nebo periapikální patologie. Citlivost zubů byla hodnocena tepelným testováním (Kältespray; M&W Dental, Büdingen, Německo) a testováním elektrické citlivosti (Vitality Scanner Pulp Vitality Tester; SybronEndo, Orange, CA, USA). Tyto zuby byly vystaveny expozici dřeně, přímému překrytí pomocí RetroMTA a restaurování pomocí kompozitní pryskyřice. O sedm měsíců později byly zuby klinicky a rentgenologicky hodnoceny. Klinické hodnocení bylo provedeno 1 týden a 7 měsíců po výkonu. Během klinických rozhovorů byli pacienti dotazováni na přítomnost bolesti, její typ a trvání. Reakce na tepelné podněty byly klasifikovány do tří kategorií: 1 = normální odpověď (bolest trvající do 10 s); 2 = prodloužená odpověď (bolest > 10 s); 3 = žádná odpověď. Elektrický test byl proveden pomocí Vitality Scanner a byl třikrát opakován. Sedm měsíců po zákroku byly zuby extrahovány a podrobeny histologickému zpracování a hodnocení.

Histologické zpracování. Ihned po extrakci byly zuby ponořeny do 10% neutrálního pufrovaného formalínového roztoku a jemně omyty od krve a slin. Po krátké prefixaci (≤ 10 minut) byla přijata speciální opatření k usnadnění fixace dřeňové tkáně. Kořeny byly odděleny 5 mm apikálně od spoje cemento-smalt pomocí diamantového kotouče za vydatného chlazení vodou. Potom byly zuby obroušeny vysokorychlostním válcovým diamantovým vrtákem pod vodní sprškou v mezio-distální nebo buko-lingvální rovině, dokud nebyl odhalen jeden nebo více dřeňových rohů. Před po sobě jdoucími kroky byly pořízeny fotografie a rentgenové snímky každého vzorku. Pro demineralizaci byly vzorky ponořeny na 3 až 4 týdny do vodného roztoku sestávajícího ze směsi 22,5% (v/v) kyseliny mravenčí a 10% (w/v) citrátu sodného, ​​s radiografickým stanovením koncového bodu. Poté byly všechny vzorky promývány v tekoucí vodě z vodovodu po dobu 24 hodin, dehydratovány za použití stoupajícího stupně ethanolu, vyčištěny v xylenu, infiltrovány a zality v parafínu (bod tání 56 °C) podle standardních postupů. Parafínové bloky byly oříznuty. S mikrotomem nastaveným na 5 μM byly odebírány sériové řezy, dokud nebyla vyčerpána celá dřeňová tkáň v komoře. Na každém sklíčku bylo shromážděno šest až osm řezů. Každé páté sklíčko bylo obarveno hematoxylinem a eosinem pro screening a hodnocení tvorby mineralizované tkáně. Tyto obarvené řezy byly použity k lokalizaci oblastí vykazujících nejzávažnější zánětlivé reakce a oblastí s méně příznivým přemostěním. Na základě tohoto počátečního hodnocení byla obarvena všechna sklíčka sousedící s místem s méně příznivými podmínkami. Kromě toho byla vybraná sklíčka podrobena modifikované technice Brown a Brenn (Taylor 1966) pro barvení bakterií. Dále byla na sklíčka umístěna krycí sklíčka a řezy byly zkoumány pomocí světelného mikroskopu. Pro každou pulpu byl zaznamenán nejhorší histologický pozorovaný stav. Pokud byly na stěnách kavity nebo v oblasti expozice pozorovány bakterie, případ byl z hodnocení vyloučen.

Jako kontrola byly použity dva neporušené zuby (jeden maxilární a jeden mandibulární třetí molár) extrahované pro perikoronitidu. Pro testování spolehlivosti bakteriálního zabarvení byly vyšetřeny dva zuby s hlubokým kazem, extrahované, protože byly považovány za neobnovitelné. Tyto zuby byly zpracovány pomocí stejného protokolu jako experimentální skupina.

Sklíčka byla pozorována pod světelným mikroskopem (Leica DMLB; Leica Microsystems, Wetzlar, Německo) a byly pořízeny digitální fotografie (Leica DFC420; Leica Microsystems, Wetzlar, Německo). Zvláště pečlivě byly sledovány následující aspekty: 1) Přítomnost a typ mineralizovaných tkání vytvořených v oblasti chirurgické expozice; 2) Morfologie buněk vrstvících tuto mineralizovanou tkáň; 3) Přítomnost a stupeň zánětlivých reakcí v pulpální oblasti podléhající nově vytvořené tkáni; a 4) Přítomnost barvitelných bakterií v experimentální dutině nebo v oblasti expozice dřeně.