Pilotní studie prebiotik a probiotik u malých kojenců s těžkou akutní podvýživou

Specifické cíle:

Zhodnotit odpověď mikrobiomu na suplementaci probiotik (s prebiotiky a bez nich) u kojenců mladších 6 měsíců s těžkou akutní podvýživou a porovnat odpověď mikrobiomu se zdravými kojenci suplementovanými probiotiky.

Místo studie: Studie bude provedena v nemocnici Dháka Mezinárodního centra pro výzkum průjmových onemocnění, Bangladéš (icddr,b). Ústav disponuje dobře vybavenou klinickou péčí i laboratorním zařízením schopným provádět všechna klinická vyšetření.

Studijní populace:

Skupina 1 (SAM) Skupina 2 (podvyživení)

Zásah:

Bifidobacterium longum subsp. infantis (EVC001) s a bez prebiotické suplementace po dobu 28 dnů ve studii.

V rozvojovém světě existuje několik studií, kde byla prebiotika a probiotika používána u těžké akutní podvýživy au rizikových kojenců. Bezpečnost Bifidobacterium longum subsp. infantis (EVC001) je zřejmé z publikované literatury i bezpečnostních zpráv (Smilowitz et al., 2017; Sheridan et al., 2017; Grenov et al., 2017; Panigrahi er al., 2017; Kerac et al., 2009) . Studie IMPRINT, klinická studie fáze I, stanovila bezpečnost a snášenlivost doplňování kojených dětí B. infantis (EVC001) (Smilowitz et al., 2017). Bezpečnost prebiotik (LNnT) byla hodnocena Panelem pro dietetické výrobky, výživu a alergie (NDA) EFSA (Evropský úřad pro bezpečnost potravin) a panel dospěl k závěru, že LNnT je pro kojence bezpečný. Mezinárodní vědecká asociace pro probiotika a prebiotika (ISAPP) doporučila, že atraktivní cíl pro klinické intervence povede k novým přístupům, které bojují s podvýživou (Sheridan et al., 2017). Studie provedená v Ugandě s použitím probiotik u hospitalizovaných dětí se SAM odhalila, že probiotika mohou hrát roli při sledování hospitalizovaných dětí se SAM v ambulantní fázi, protože prokázala významné snížení trvání průjmu (Grenov et al., 2017). Na venkově Indie bylo pozorováno významné snížení kultivačně pozitivní a kultivačně negativní sepse a infekcí dolních cest dýchacích u kojenců s použitím symbiotik (Kerac et al., 2009). Studie PRONUT neprokázala žádný případ bakteriémie související s probiotiky. Reakce mikroflóry na probiotika se může lišit podle stravy nebo zeměpisné polohy.

Zkušební zbraně:

3 léčebná ramena pro kojence se SAM:

• Placebo (laktóza)
• B. infantis sám (Bif)
• B. infantis + prebiotikum lakto-N-neotetraóza [LNnT] (Bif+prebiotikum) Každé rameno bude přiděleno tak, aby dostávalo standardní dietu (F-75 během akutní fáze léčby SAM, F-100 během pobytu v nemocnici pro nutriční rehabilitace a standardizovaná kojenecká výživa po propuštění). Randomizace pro alokaci léčby bude provedena v poměru 1:1 pomocí stratifikace podle věku (2-3,9 měsíce vs. 4-6 měsíců), aby byla zajištěna stejná účast kojenců podle věkových skupin. Přidělení bude dosaženo použitím náhodných permutovaných bloků velikosti 3. Celkem bude zapsáno 54 účastníků s 18 kojenci (9+9) přidělenými v každé léčebné větvi.

Prebiotikum bude použito ve formě LNnT (lakto-N-neotetraóza, která vzniká fermentací a je chemicky identická s LNnT přítomným v lidském mateřském mléce. LNnT obsahuje specifickou vazbu, kterou B. infantis dokáže rozložit, zatímco jiné bakterie nikoli. V in vitro testu, kdy růstové médium obsahuje 50 % nebo více LNnT, je podporován růst B. infantis, ale růst Bacteroides a E. coli je inhibován. Distribuce glykosylhydroláz potřebných ke konzumaci této struktury je vzácná mezi Proteobakteriemi (včetně Campylobacter) jako celkem a chybí mezi Bacteroides, a proto by LNnT neměl přispívat ke zkříženému krmení, dokonce i bez přihojení B. infantis.

Cílem výběru nepodvyživených dětí je zjistit, zda se narušená mikroflóra kojenců SAM obnoví na vyšší úroveň B. infantis, podobnou úrovním pozorovaným u zdravých kojených dětí, které mají akutní onemocnění a jsou léčeny antibiotiky.

Velikost vzorku:

Pro pilotní projekt budeme mít 18 kojenců na léčebné rameno, celkem 54 kojenců SAM. Do otevřené léčby B. infantis zařadíme také 18 nepodvyživených kojenců. V tomto pilotním projektu bude studovanou populací celkem 72 kojenců.

I když účastníci studie upadnou nebo se u nich rozvine jakákoli infekce získaná v nemocnici nebo se zhorší, musíme dokončit 18 hodnotitelných případů v každém rameni.

Postup sběru výchozích dat: Všechny děti se SAM a non-SAM v rámci definovaných věkových skupin budou vyšetřeny na kritéria způsobilosti studie lékařem studie. Rodiče / pečující pečovatelé těch, kteří splňují způsobilost podle kritérií pro zařazení a vyloučení, budou vyzváni, aby poskytli svůj souhlas se zařazením svých dětí do studie. Po podepsání písemného informovaného souhlasu, po poskytnutí informací o studii a jejích intervencích, vysvětlení možných přínosů a rizik a dobrovolnosti účasti spolu s právem odvolat děti kdykoliv po prvotním souhlasu bez udání důvodu, budou děti zapsal studijní lékař. Formulář klinického záznamu bude použit ke shromažďování relevantních informací, jako je anamnéza včetně povahy a trvání nemoci, léky na současnou nemoc; sociodemografické charakteristiky, jako je věk, pohlaví, náboženství, věk rodičů se vzděláním, povolání rodičů, spotřeba paliva a kouření, měsíční příjem rodiny, počet sourozenců atd. Rovněž by byly shromažďovány informace o stravovací praxi dítěte, jako je historie kojení, umělé výživy nebo jiného doplňkového krmení a stav imunizace; bude zaznamenána rodinná anamnéza tuberkulózy, nedávná infekce dýchacích cest kteréhokoli člena rodiny a anamnéza dítěte v minulosti.

Pro dlouhodobé sledování bude použit samostatný CRF ke sběru informací o hmotnosti, výšce, MUAC, krmení a historii komorbidit. Terénní výzkumní asistenti navštíví domy přihlášených a budou shromažďovat požadované informace po obdržení písemného souhlasu rodičů nebo pečovatele.

Řízení:

Skupina 1 (děti se SAM): Způsobilí kojenci se SAM budou léčeni pro stabilizační fázi na oddělení pro delší pobyt v nemocnici Dhaka icddr,b. Bude dodržován standardizovaný léčebný protokol pro děti se SAM a průjmem (vyvinutý na icddr,ba v souladu s pokyny WHO; Ahmed et al Lancet 1999). Mezi klíčové prvky patří zpočátku 2hodinové krmení F-75 (doporučená počáteční receptura, 130 ml/kg denně), kyselina listová, vitamín A, ampicilin plus gentamicin, sledování a kontrola teploty a glukózy v krvi. Před zahájením podávání antibiotik budou odebrány základní vzorky stolice (v případě potřeby fekálním katetrem).

Stabilizační fáze podle našich zkušeností trvá v průměru 4 dny. Dokončení stabilizační fáze je charakterizováno uspokojivou chutí k jídlu, bez nutnosti krmení nazogastrickou sondou, dobrým celkovým klinickým stavem, nepřítomností průjmu, dehydratací, horečkou, hypotermií nebo tachypnoí.

Kojenci, kteří jsou stabilizovaní, jsou přemístěni do NRU po obdržení písemného souhlasu od pečovatele. Stabilizovaní kojenci budou randomizováni do 3 léčebných ramen, jakmile dokončí 5-7denní léčbu antibiotiky. Vedoucí dietní lékař nemocnice připravuje stravu (F-100) a dodává ji NRU. F-100 se dávkuje v dávce 130 ml/kg denně každé 2 hodiny po dobu prvních 2 dnů a poté se podává každé 3 hodiny a postupně se zvyšuje o 10 ml v každé dávce, dokud nezbude nějaké krmivo. Mezi kojením je podporováno kojení. Množství spotřebovaného mateřského mléka bude odhadnuto zkušebním vážením kojenců.

Pečovatelé budou vyškoleni k poskytování psychosociální stimulace kojencům, což je činnost, která se v NRU běžně provádí. To se děje prostřednictvím mluvení nebo zpívání s kojenci, věkově specifické fyzické aktivity a hraní si s místními hračkami.

Měření příjmu mateřského mléka testovacím vážením podle standardní publikované metody (Islam et al., 2006):

Sběr mateřského mléka:

Protože tato studie bude zkoumat přihojení bifidobakterií, které je spojeno s dostupností HMO v mateřském mléce, odebereme 10 ml mateřského mléka za aseptických podmínek a bude analyzováno na obsah HMO.

Tato analýza bude provedena v laboratořích, které mají zkušenosti s prováděním těchto testů.

Kromě toho provedeme také analýzu mikroflóry odebraných vzorků mateřského mléka. Je to proto, že mikrobiota mateřského mléka pravděpodobně ovlivní kolonizaci jinými organismy a střevní kilometry kojence.

Mateřské mléko bude odebráno z prsu mezi 7:00 a 11:00 a ženy budou požádány, aby alespoň 2 hodiny před odběrem vzorku nekrmily ani neodsávaly z prsu studie. Před odběrem vzorku se prsa očistí jodovým tamponem. Kompletní odsátí prsu bude odebráno pomocí sterilní odběrové soupravy na jedno použití (Hygienikit®; Ameda, Cary, IL, USA) a elektrické odsávačky prsu (Model SMR-B-R; Ameda-Egnell, Inc.). Mléko bude okamžitě umístěno na led.

Bif (8 miliard CFU/denní jednorázová dávka-), Bif (8 miliard CFU/denní jednorázová dávka-) + Prebiotikum (1g/6hodin-4g/den) a placebo (laktóza 625mg) budou dostupné ve formě prášku v sáčcích. v krmných soupravách označených jedinečnými kódovými čísly, které odpovídají randomizačnímu kódu každého kojence. Obsah sáčku bude podáván kojenci jednou denně pro sáčky Bif a placebo smíchané s 5 ml kojenecké výživy nebo mateřského mléka a každý přípravek 200 ml F-100 bude rozpuštěn v jednom sáčku s prebiotikem (LNnT). Ošetřovatelé, ale ne studijní personál, budou zaslepeni vůči přidělení léčby.

Dávkování a dávkování LNnT bude nakonec odvozeno na základě přehledu aktuální literatury a zkušeností odborníků pracujících v této oblasti. Cílem je co nejvíce stimulovat přirozené podmínky dostupnosti HMO v mateřském mléce.

Soupravy na krmení (sáčky), které byly přiděleny náhodně vybraným kojencům, budou chlazeny nebo skladovány zmrazené až do použití, dokud nebude účastník hospitalizován. Krmné soupravy, které ještě nebyly přiřazeny kojenci, budou uloženy v nemocničním mrazáku s nepřetržitým sledováním teploty. Probiotikum skladované v mrazáku (-20°C ± 5°C) lze spotřebovat do data expirace vytištěného na sáčku (1 rok od data balení). Může být uchováván až 31 dní v chladničce (4°C ± 5°C). Prebiotikum (LNnT) je stabilní při pokojové teplotě, ale může být skladováno v chladničce nebo mrazáku spolu s probiotikem.

Skupina 2 (nepodvyživené děti): Způsobilé nepodvyživené děti budou léčeny podle nemocničního protokolu. Stručně řečeno, jsou přijímáni na oddělení pro delší pobyt nebo v případě potřeby na JIP. Nemocnice má definované léčebné protokoly pro akutní vodnatý průjem, zápal plic a těžký zápal plic, přetrvávající průjem, těžkou sepsi, poruchy elektrolytů a infekce získané v nemocnici. Děti budou ošetřeny v nemocnici podle těchto protokolů. Výhradně kojené děti budou pokračovat v mateřském mléce. Ostatní jsou doplňovány upravenou kojeneckou výživou každé 2-3 hodiny. Množství spotřebovaného mateřského mléka bude odhadnuto zkušebním vážením kojenců. Léčba přípravkem Bif bude zahájena v den ukončení antibiotické kúry a bude poskytována kojencům stejným způsobem jako skupina 1. Obsah sáčku se smíchá s lžičkou kojenecké výživy nebo mateřského mléka a krmí se kojenci.

I když účastníci studie upadnou nebo se u nich rozvine jakákoli infekce získaná v nemocnici nebo se zhorší, musíme dokončit 18 hodnotitelných případů v každém rameni.

Propuštění z nemocnice:

Propuštění bude provedeno, pokud dítě se SAM dosáhlo hmotnosti na délku >-3, pokud možno ≥ -2 Z-skóre, a v případě edematózní malnutrice, když edém odezní a když dítě prospívá a je klinicky dobré. Děti, které nejsou podvyživené, budou propuštěny, když splní kritéria propuštění z nemocnice. Do té doby budou pečovatelé vyškoleni pro přípravu a podávání stravy a doplňků.

Následovat:

Kojenci se SAM budou sledováni prostřednictvím domácích návštěv výzkumných asistentů dvakrát týdně až do 8 týdnů po randomizaci. Děti bez podvýživy budou sledovány prostřednictvím domácích návštěv dvakrát týdně, dokud není suplementace dokončena, a poté jednou týdně až do 6 týdnů po randomizaci. Při těchto návštěvách budou doplňovány dávky kojenecké výživy (pro kojence SAM) a doplňků (obě skupiny), bude sledován skutečný příjem stravy nebo ověřeno podávané množství a způsob rekonstituce a zaznamenána nemocnost na zakázkovém pouzdru. záznamový formulář. Protože doplněk B. infantis by měl být uchováván v chladu, aby byla zachována optimální životaschopnost, výzkumní asistenti přinesou doplněk na domácí návštěvy v izolovaných boxech nebo chladičích s ledem nebo zmrazeným gelem. Ačkoli se doplněk pravděpodobně mezi návštěvami zahřeje na pokojovou teplotu, neočekává se, že ztráta životaschopnosti významně ovlivní kolonizaci B. infantis ve střevě. Každému účastníkovi bude po dobu studia poskytnuta miniaturní lednička a každý rodič bude instruován, aby do použití uchovával doplněk v těchto nádobách.

Kojenci, kteří ještě nedosáhli hmotnosti vzhledem k délce ≥ -1 Z-skóre do 8 týdnů po randomizaci (konec návštěv doma), mohou pokračovat v přenášení dítěte na icddr,b k vážení a měření a k vyzvednutí dávek umělé výživy. na rutinním základě, dokud není dosaženo hmotnosti na délku ≥ -1 Z.

Bude provedeno dlouhodobé sledování za účelem posouzení antropometrie zapsaných účastníků.

Kolekce vzorků:

Vzorky stolice budou odebírány následovně.

• Výtěry ze stolice (pro analýzu mikrobiomů) (13krát v SAM, 11krát v non-SAM)

  • Při příjmu, před léčbou antibiotiky
  • Po stabilizaci, před randomizací a suplementací
  • 2. den suplementace
  • 4. den suplementace
  • 7. den suplementace
  • 10. den suplementace (nebo poslední den v NRU, pokud bude vyřízen dříve)
  • 14. den suplementace (v NRU nebo vyzvednuto výzkumným asistentem při návštěvě doma)
  • 21. den suplementace (vyzvednutí výzkumným asistentem při návštěvě doma)
  • 28. den suplementace (vyzvednutí výzkumným asistentem při návštěvě doma)
  • 1 týden po suplementaci (vyzvednutí výzkumným asistentem při návštěvě doma)
  • 2 týdny po suplementaci (vyzvednutí výzkumným asistentem při návštěvě doma)
  • 3 týdny po suplementaci (vyzvednutí výzkumným asistentem při domácí návštěvě): pouze SAM
  • 4 týdny po suplementaci (vyzvednutí výzkumným asistentem při domácí návštěvě): pouze SAM

• Kusy stolice nebo katétrové vzorky stolice (pro pH a zánětlivé markery) v nemocnici [pouze kojenci SAM]:

  • Při příjmu, před léčbou antibiotiky
  • Po stabilizaci, před randomizací a suplementací
  • 7. den suplementace"
  • 10. den suplementace (nebo poslední den v NRU, pokud bude vyřízen dříve)
  • 28. den suplementace (shromážděno výzkumným asistentem při návštěvě doma)
  • 4 týdny po suplementaci (shromážděno výzkumným asistentem při návštěvě doma)

• Kusy stolice nebo katétrové vzorky stolice (pro pH a zánětlivé markery) v nemocnici [pouze pro nepodvyživené děti]:

  • Při příjmu, před léčbou antibiotiky
  • Po zahájení suplementace při propuštění z nemocnice
  • 28. den suplementace (shromážděno výzkumným asistentem při návštěvě doma)
  • 2 týdny po suplementaci (shromážděno výzkumným asistentem při návštěvě doma)

Odběr vzorků stolice v nemocnici:

Všechny děti budou vyšetřeny z nemocnice Dhaka, icddr,b podle výše uvedených kritérií pro zařazení a vyloučení. Výzkumný personál provede screening těchto dětí před podáním antibiotika. Před odběrem vzorků stolice bude odebrán písemný souhlas zákonného zástupce.

Stolici je třeba od každého dítěte odebírat čerstvě. Vzorky musí být okamžitě rozděleny do alikvotů do předem označených 2ml kryozkumavek a do přepravce (~-70°C) co nejrychleji po odběru, ideálně méně než 15 minut po odběru. Po odběru a před rozdělením na alikvoty by měla být nádoba na odběr stolice udržována na (mokrém) ledu. V ideálním případě by byly kryozkumavky naplněny přibližně do 2/3. Dvakrát týdně budou tyto kryokonzervované vzorky přepraveny do laboratoře úrovně biologické bezpečnosti v nemocnici icddr,b Dhaka k uskladnění v mrazáku -80 °C. Aby se zabránilo rozmrazování, budou lahvičky přepravovány od odesílatele do -80⁰ mrazničky tak rychle, jak je to možné, během přesunu do mrazicích boxů. Tyto mrazicí boxy nebudou vyjmuty z -80⁰ mrazáku, dokud nebudou předány společnosti World Courier k odeslání do USA.

Opatření k zajištění co nejlepší obnovy bakterií a jejich životaschopnosti:

1. Odesilateli by měli být plně nabiti před dnem vyzvednutí a bude veden záznam o počtu otevření.
2. Odesílatelé potřebují asi 12 hodin po přidání kapalného dusíku, aby se plně nabili. Proto přepravníky na konci každého dne znovu nabijeme (naplníme) a poté další ráno před použitím vylijeme veškerý zbývající neabsorbovaný tekutý dusík.
3. Odesílatelé budou zváženi před nabitím, po nabití (tj. druhý den ráno po vylití veškerého nevstřebaného N2) a poté znovu na konci každého dne, aby se vědělo, kolik kapalného dusíku zůstává v kanystru. To nám umožní odhadnout, kolik kapalného N2 je potřeba při každém dobíjení a jak často je to potřeba.

Odběr výtěru ze stolice v nemocnici a z komunity:

Vzorky stolice budou odebírány tak, jak je uvedeno v časovém harmonogramu. Jakmile budou účastníci propuštěni z NRU, výtěr ze stolice bude odebrán do dvou dnů od plánovaného času.

O odběru stolice bude den před plánovaným odběrem stolice informován primární opatrovník dítěte/účastníka. Vyškolený výzkumný personál odebere od dítěte první dostupný vzorek čerstvé stolice v den plánovaného odběru.

Během odběru v nemocnici a v komunitě budou výzkumnému personálu poskytnuty označené zkumavky na výtěry stolice (obsahující stabilizační pufr), jednotlivě zabalené výtěry (s bodem přerušení), kryogenní marker a plastové sáčky.

V nemocnici budou matky/pečovatelé instruováni, aby informovali výzkumný personál, jakmile se dítě vyprázdní. Poté výzkumní pracovníci udělají následující:

• Utřete ušpiněnou plenku dítěte a odeberte dostatek vzorku stolice, aby byla hlava tamponu zcela pokryta.
• Vložte tampon do vhodně označené odběrové zkumavky se zeleným vrškem a odlomte tamponovou hlavu v místě zlomu - tamponová hlava zůstane ve zkumavce.
• Zkumavku pevně uzavřete a důkladně protřepejte, aby se zajistilo rozložení stolice ve stabilizačním pufru.
• Pomocí dodaného kryogenního markeru (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4000221) napište datum odběru stolice na štítek na tubě.
• Opakujte výtěr s druhým čistým tamponem a duplikátem zkumavky se zeleným vrškem.
• Zkumavky se zeleným vrškem vložte zpět do přiložených plastových sáčků a uchovávejte při pokojové teplotě, dokud je nevyzvedne zdravotnický pracovník.

Informace o příjmu antibiotik budou shromažďovány pro každého účastníka během studie. Při každém odběru vzorku se zeptáme matky nebo jiné pečovatelky na jakékoli onemocnění za posledních 14 dní a zda je léčeno. Povaha léku bude ověřena fyzickou kontrolou léku, předpisu a dotazem na název nebo zda lék byl prášek, který se musel rekonstituovat.

Odběr vzorků slin od matky:

Provedeme „test fenotypování stavu sekretorů“ ve slinách matek, abychom viděli stav sekretorů matek, abychom detekovali stav HMO a také spojení s mikrobiotou kojenců.

Postup odběru vzorku slin

1. Matky by si měly umýt ruce a vypláchnout ústa studenou vodou a vodu úplně vyplivnout.
2. Odeberou vzorkovač a dávají pozor, aby se dotkli pouze rukojeti.
3. Matka bude držet rukojeť Oracle odběrové zkumavky jako zubní kartáček a vloží si ji do úst a bude si jednu minutu třít houbu o dásně. Ujistěte se, že je houba zcela nasycená.
4. aniž by se houbičky dotkli, vloží vzorkovač do originální zkumavky Oracol, houbičkou dolů a pevně uzavřou víko.
5. Matka předá zkumavku se vzorkem Oracle zpět pracovníkům studie (kteří zkumavky označí a zmrazí, pokud vzorky nebudou zpracovány ve stejný den).

Odběr a transport vzorků stolice z komunity Každý vyškolený komunitní zdravotnický pracovník bude zodpovědný za určitý počet odběrů stolice za měsíc. Kontaktuje matku přes mobilní telefon a brzy ráno dorazí do domu dítěte se stolním přepravcem dusíku a odebere výtěr ze stolice.

Počáteční odběr vzorků stolice by měl být proveden ve vhodné sterilní nádobě, poté by měl terénní pracovník přenést menší alikvoty fekálního materiálu (do 20 minut po defekaci) do předem označených sterilních 2ml zkumavek bezpečných pro kryokrystalizaci. Štítky zkumavek by měly obsahovat minimálně ID vzorku účastníka (SID) a datum odběru.

Zdravotníci v čistých jednorázových latexových rukavicích naplní každou 2ml kryo lahvičku přibližně do jedné poloviny až dvou třetin pomocí sterilní špachtle a pevně uzavře. Ke vzorku nebudou přidány žádné pufry, konzervační látky nebo přísady. Při používání lahviček se šroubovacím uzávěrem je třeba postupovat opatrně a ne je přeplňovat, protože to minimalizuje možnost křížové kontaminace vzorků během přepravy a skladování.

Poté vloží zavíčkované lahvičky do předem naplněných „suchých přepravců“ tekutým dusíkem, aby je okamžitě převezli zpět do laboratoře. I když je to obtížné, vzorky by měly být přeneseny k suchým přepravcům do 20 minut po defekaci. V laboratoři vyškolený personál vyprázdní lahvičky ze suchého přepravce do kbelíku se suchým ledem, aby se zabránilo rozmrazení při třídění a přemisťování lahviček do mrazicích boxů 9x9 pro dlouhodobé skladování a přepravu.

Hlášení:

Informace budou zaznamenány na formuláři pro odběr stolice (SFC).

Vyšetřování:

Testy provedené na icddrb:

• stanovení pH stolice v nemocniční laboratoři
• Testování hladin myeloperoxidázy a dalších biomarkerů ve vzorcích stolice

Testy provedené společností Evolve Biosystems:

• Sekvenování nové generace, metagenomika a q PCR analýzy vzorků
• Imunitní testy - Multiplexní analýza zánětlivých a imunitně souvisejících cytokinů/analytů
• IL-10, TGF beta, IL-2, TNF alfa, IL-17, IL-22, IL-8, IL-6, IP-10
• ELISA pro sCD83, sTLR2 a fekální lipokalin 2

PH stolice:

PH stolice bude měřeno za účelem posouzení změny pH stolice od výchozí hodnoty během suplementace.

Myeloperoxidáza:

Myeloperoxidáza je specifickým markerem aktivity neutrofilů. Byl vybrán, protože není zvýšený v mateřském mléce ani ve stolici kojených dětí jako laktoferin a kalprotektin (Dorosko et al., 2008) a hladiny MPO ve stolici korelovaly s aktivitou onemocnění u zánětlivého onemocnění střev, jak bylo hodnoceno endoskopicky. a biochemické parametry (SAIKI T, 1998). Studie MAL-ED již prokázala roli MPO jako markeru funkce střev (McCormick et al., 2017).

Tuto koncentraci biomarkerů změříme komerční ELISA.

Sekvenování nové generace: V posledních letech bylo zavedeno několik sekvenačních technologií nové generace (Shendure & Ji, 2008), které dále umožňují analyzovat velké množství mikroorganismů v různých prostředích (Tringe et al., 2005) a lidské tělo. míst (Ding & Schloss, 2014, včetně lidského střeva (Methé et al., 2012).

16S rDNA sekvenční analýza a metagenomika jsou dvě účinné techniky sekvenování DNA a obě byly použity ke studiu nekultivovaných střevních mikrobiálních komunit. Analýza sekvence 16S rDNA se zaměřuje na sekvenování konzervovaného genu 16S rDNA přítomného ve všech mikrobech (Woese & Fox, 1977) a vytvořila řadu nových spojení mezi složením střevní mikroflóry a onemocněním (Blaser et al., 2013). Výzkum založený na 16S rDNA sekvenci je technika k odhalení "kdo je tam?" v dané mikrobiální komunitě, zatímco metagenomické sekvenování pomocí brokovnice bude schopno odpovědět na doplňující otázku „co mohou dělat?“. (Lepage et al., 2012). Bude provedeno sekvenování nové generace k detekci přihojení organismu, zejména B. infantis, po intervenci u těžce podvyživených kojenců a jeho porovnání s dobře živenými dětmi.

Metagenomika:

Metagenomika byla poprvé popsána v roce 1998 Handelsmanem a Rodonem (Handelsman et al., 1998) a stala se dalším přístupem k sekvenování DNA ke studiu komplexní střevní mikrobiální komunity. Jeho cílem je katalogizovat všechny geny z komunity náhodným sekvenováním veškeré DNA extrahované ze vzorku (Qin et al., 2010). Nejprve je ze vzorků stolice extrahována celková DNA všech mikroorganismů. Před sekvenováním jsou vzorky celkové DNA náhodně stříhány metodou „brokovnice“. Komplexní sekvence jsou poté analyzovány, aby se získaly buď profily druhů založené na fylogenetických markerech (16S rDNA) (Sunagawa et al., 2010) nebo genomové profily založené na celých genomech (Tringe et al., 2005). Metagenomika hraje roli v porozumění lidskému střevnímu mikrobiomu, včetně diverzity střevního mikrobiomu, identifikaci nových genů a určování etiologie funkční dysbiózy (Wang et al., 2015). Bude provedeno základní složení střevní mikroflóry (metagenomická analýza) a kolonizace Bifidobacterium (relativní četnost) metagenomickou analýzou během/po suplementaci.

qPCR: Real time PCR bude provedena pro kvantitativní detekci organismu v DNA přímo extrahované ze vzorku stolice. Bude provedena kolonizace B. infantis pomocí qPCR během a po suplementaci (s prebiotiky a bez nich).

Cytokiny:

Jakýkoli cytokin, který je produkován lokálně v důsledku zánětu střeva, může unikat do lumen střeva a objevit se ve stolici. Velký zánětlivý infiltrát v nemocné sliznici střeva způsobuje zvýšené cytokiny ve stolici. Provedeme cytokinové testy k detekci zánětu střeva. Ve vzorcích stolice budeme měřit Interleukin-10 (IL-10), Transformující růstový faktor-β (TGF-β), Interleukin-2 (IL-2), Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α), Interleukin-17 ( IL-17), interleukin-22 (IL-22), interleukin-8 (IL-8), interleukin-6 (IL-6), interferonem gama-indukovaný protein 10 (IP-10).

ELISA pro sCD83, sTLR2:

Rozpustná forma CD83 se uvolňuje z aktivovaných dendritických buněk a B lymfocytů a je detekovatelná v normálním lidském séru (Hock et al., 2001). Toll-like receptory (TLR) jsou třídou receptorů pro rozpoznávání vzorů (PRR), které hrají klíčovou roli ve vrozené imunitě a spouštějí specifickou imunitní odpověď. sTLR2 byl detekován v lidských tekutinách, jako je plazma, mateřské mléko, sliny a plodová voda, stejně jako v supernatantu kultivovaných monocytů (LeBouder et al., 2003; Kuroishi et al., 2007; Dulay et al., 2009) bude izolovat sCD83 a sTLR2 ze vzorků stolice podvyživených kojenců.

Fekální lipokalin 2:

Tento glykoprotein je exprimován v několika buňkách a je spojován s primárními a sekundárními granulemi lidských neutrofilů (Roudkenar et al., 2007). Upregulace Lcn-2 je pozorována u stavů poškozujících tkáň, jako je infekce, poranění ledvin, rakovina, ulcerózní kolitida a popáleninové poranění, kde dochází k produkci volných radikálů (Chassaing et al., 2012). Lipocalin-2 koreluje méně těsně s markery neutrofilů, může poskytovat komplementární marker narušení nebo poškození epiteliálních buněk (Prata et al., 2016). Test provedeme u podvyživených i dobře živených kojenců, abychom odhalili poškození enterocytů.

Analýza mikroflóry mateřského mléka a HMO:

Existuje několik studií, kde byla hodnocena analýza mateřského mléka (Williams et al., 2017) a bakteriální komunita v mateřském mléce (Hunt et al., 2011). V této studii bude analýza mikrobioty provedena sekvenční analýzou 16S rDNA. Pro zjištění úrovně LnNT bude provedeno měření HMO.

Postup zpracování údajů:

• Dotazníky budou vizuálně naskenovány krátce po pohovoru a označeny na opomenutí, nesrovnalosti nebo chyby, které budou okamžitě vyřešeny
• SPSS bude použit a data budou vložena po vytvoření šablony pro každý datový vstupní soubor s příslušnými kontrolami logiky a konzistence
• Data budou průběžně zadávána tak, jak jsou data generována v nemocnici a laboratoři
• Data budou ověřena řadou logických a rozsahových kontrol, které vytvoří souhrnné statistiky a tabulky
• Kromě toho bude vyšetřovatel(é) zkontrolováno 50 % CRF (a všechny proměnné).
• Data budou okamžitě zkopírována na pevné disky dvou počítačů, jakmile bude dokončeno ověření dat.

Výpočet velikosti vzorku a proměnná(y) výsledku (primární a sekundární):

Do pilotní studie zařadíme 18 kojenců SAM na léčebné rameno a dalších 18 nepodvyživených dětí, tedy celkem 72 kojenců.

Analýza dat Data budou vložena do předem testovaných formulářů klinických záznamů (CRF) pomocí SPSS (verze 20.0, Armonk, NY) a nakonec vyčištěna opakovanou kontrolou. Abychom poznali výsledek prebiotické a probiotické suplementace u našich studovaných dětí pro normálně distribuovaná data, provedeme ANOVA a v případě nenormální distribuce měření budou použity ekvivalentní neparametrické testy jako Kruskal-Wallis H test a vhodné post hoc V případě potřeby bude proveden test pro analýzu podskupin. Pravděpodobnost menší než 0,05 bude považována za statisticky významnou a síla asociace bude určena výpočtem poměru šancí (OR) a 95% intervalu spolehlivosti (CI). Pokud dojde k úmrtí, provedeme verbální pitvu a vyhodnotíme související faktory smrti stejným analytickým plánem.

Plán monitorování bezpečnosti dat (DSMP) Monitorování bezpečnosti dat bude důsledně prováděno v průběhu studie. Všechny formuláře budou zkontrolovány studijním lékařem po zápisu a sběru dat a následně školitelem z hlediska úplnosti, čitelnosti a vnitřní konzistence. Podávání prebiotik a probiotik v nemocnici bude za přítomnosti lékaře studie. Všechny aspekty přístupu, zpracování a interpretace vzorků budou rovněž prováděny podle standardních operačních postupů.

Collaborative Arrangements icddr,b provede studii ve spolupráci s Evolve BioSystems, Inc. USA, soukromou společností založenou v Kalifornii mezinárodně uznávanými akademiky zkoumajícími střevní mikrobiom kojenců a jeho kritickou souvislost s lidským mateřským mlékem.