Pilot einer präbiotischen und probiotischen Studie bei jungen Säuglingen mit schwerer akuter Mangelernährung

Bestimmte Ziele:

Bewertung der Reaktion des Mikrobioms auf eine probiotische Supplementierung (mit und ohne Präbiotika) bei Säuglingen unter 6 Monaten mit schwerer akuter Unterernährung und Vergleich der Reaktion des Mikrobioms mit gesunden Säuglingen, die mit Probiotika ergänzt wurden.

Studienort: Die Studie wird am Dhaka Hospital des International Center for Diarrheal Disease Research, Bangladesch (icddr,b) durchgeführt. Die Einrichtung verfügt über eine gut ausgestattete klinische Versorgung sowie über Laboreinrichtungen, in denen alle klinischen Tests durchgeführt werden können.

Studienpopulation:

Gruppe 1 (SAM) Gruppe 2 (nicht unterernährt)

Intervention:

Bifidobacterium longum subsp. infantis (EVC001) mit und ohne präbiotische Ergänzung für 28 Tage wird in der Studie bereitgestellt.

Es gibt mehrere Studien in Entwicklungsländern, in denen Präbiotika und Probiotika bei schwerer akuter Unterernährung und bei gefährdeten Säuglingen eingesetzt wurden. Sicherheit von Bifidobacterium longum subsp. infantis (EVC001) geht aus veröffentlichter Literatur sowie Sicherheitsberichten hervor (Smilowitz et al., 2017; Sheridan et al., 2017; Grenov et al., 2017; Panigrahi et al., 2017; Kerac et al., 2009) . Die IMPRINT-Studie, eine klinische Phase-I-Studie, bestimmte die Sicherheit und Verträglichkeit der Nahrungsergänzung von gestillten Säuglingen mit B. infantis (EVC001) (Smilowitz et al., 2017). Die Sicherheit von Präbiotika (LNnT) wurde vom Gremium für diätetische Produkte, Ernährung und Allergien (NDA) der EFSA (Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit) für Lebensmittel bewertet, und das Gremium kam zu dem Schluss, dass LNnT für Säuglinge sicher ist. Die International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics (ISAPP) empfahl, dass ein attraktives Ziel für klinische Interventionen zu neuen Ansätzen zur Bekämpfung von Mangelernährung führen wird (Sheridan et al., 2017). Eine in Uganda durchgeführte Studie mit Probiotika bei hospitalisierten SAM-Kindern zeigte, dass Probiotika eine Rolle bei der Nachsorge von hospitalisierten Kindern mit SAM in der ambulanten Phase spielen können, da sie eine signifikante Verringerung der Durchfalldauer zeigten (Grenov et al., 2017). Im ländlichen Indien wurde eine signifikante Reduktion von kulturpositiver und kulturnegativer Sepsis und Infektionen der unteren Atemwege bei Säuglingen unter Verwendung von Symbiotika beobachtet (Kerac et al., 2009). Die PRONUT-Studie zeigte keinen Fall einer probiotisch bedingten Bakteriämie. Die Reaktion der Mikrobiota auf Probiotika kann je nach Ernährung oder Geographie unterschiedlich sein.

Probewaffen:

3 Behandlungsarme für Säuglinge mit SAM:

• Placebo (Laktose)
• B. infantis allein (Bif)
• B. infantis + Präbiotikum Lacto-N-neotetraose [LNnT] (Bif+Präbiotikum) Jeder Arm erhält die Standarddiät (F-75 während der Akutphasenbehandlung von SAM, F-100 während des Krankenhausaufenthalts zur Ernährung Rehabilitation und standardisierte Säuglingsnahrung bei der Entlassung). Die Randomisierung für die Behandlungszuweisung erfolgt im Verhältnis 1:1 unter Verwendung einer Stratifizierung nach Alter (2-3,9 Monate vs. 4-6 Monate), um eine gleichberechtigte Teilnahme der Säuglinge nach Altersgruppen sicherzustellen. Die Zuteilung erfolgt durch die Verwendung von zufällig permutierten Blöcken der Größe 3. Insgesamt werden 54 Teilnehmer mit 18 Kleinkindern (9+9) in jedem Behandlungsarm eingeschrieben.

Das Präbiotikum wird in Form von LNnT (Lacto-N-neotetraose, das durch Fermentation hergestellt wird und chemisch mit dem in der Muttermilch vorhandenen LNnT identisch ist) verwendet. LNnT enthält eine spezifische Verbindung, die B. infantis abbauen kann, während andere Bakterien dies nicht können. Wenn das Wachstumsmedium im In-vitro-Assay 50 % oder mehr LNnT enthält, wird das Wachstum von B. infantis unterstützt, aber das Wachstum von Bacteroides und E. coli gehemmt. Die Verteilung der Glycosylhydrolasen, die benötigt werden, um diese Struktur zu verbrauchen, ist unter Proteobakterien (einschließlich Campylobacter) als Ganzes selten und fehlt unter Bacteroides, und daher sollte LNnT nicht zur Kreuzfütterung beitragen, selbst wenn keine Anreicherung mit B. infantis vorliegt.

Das Ziel der Auswahl der nicht unterernährten Kinder besteht darin, zu sehen, ob sich die gestörte Mikrobiota von SAM-Säuglingen auf einen höheren B. infantis-Spiegel erholt, ähnlich den Spiegeln, die bei gesunden gestillten Säuglingen beobachtet werden, die eine akute Krankheit haben und mit einem Antibiotikum behandelt werden.

Probengröße:

Für das Pilotprojekt werden wir 18 Säuglinge pro Behandlungsarm haben, insgesamt 54 SAM-Säuglinge. Wir werden auch 18 nicht unterernährte Säuglinge für die offene Behandlung mit B. infantis anmelden. Insgesamt 72 Säuglinge werden die Studienpopulation für dieses Pilotprojekt bilden.

Selbst wenn die Studienteilnehmer abfallen oder eine im Krankenhaus erworbene Infektion entwickeln oder sich verschlechtern, müssen wir 18 auswertbare Fälle in jedem Arm abschließen.

Baseline-Datenerhebungsverfahren: Alle SAM- und Nicht-SAM-Kinder innerhalb der definierten Altersgruppen werden vom Studienarzt auf die Eignungskriterien für die Studie untersucht. Eltern / Betreuer von Personen, die die Eignung erfüllen, werden unter Anwendung der Einschluss- und Ausschlusskriterien aufgefordert, ihre Zustimmung zur Aufnahme ihrer Kinder in die Studie zu erteilen. Nach Unterzeichnung einer schriftlichen Einverständniserklärung, nach Bereitstellung von Informationen über die Studie und ihre Interventionen, Erläuterung möglicher Vorteile und Risiken und Freiwilligkeit der Teilnahme sowie des Rechts, Kinder jederzeit nach der ursprünglichen Zustimmung ohne Angabe von Gründen zurückzuziehen, werden Kinder sein vom Studienarzt eingeschrieben. Das Formular für klinische Aufzeichnungen wird verwendet, um relevante Informationen zu sammeln, wie z. B. Krankengeschichte, einschließlich Art und Dauer der Krankheit, Medikation für aktuelle Krankheit; soziodemografische Merkmale wie Alter, Geschlecht, Religion, Alter der Eltern mit Bildung, Beruf der Eltern, Kraftstoffverbrauch und Rauchergewohnheiten, monatliches Familieneinkommen, Anzahl der Geschwister usw. Es würden auch Informationen über die Ernährungsgewohnheiten des Kindes gesammelt, wie z. B. das Stillen in der Vorgeschichte, Formel- oder andere Beikost und der Impfstatus; Familienanamnese von Tuberkulose, kürzliche Atemwegsinfektionen von Familienmitgliedern und frühere Krankengeschichte des Kindes würden aufgezeichnet.

Für die langfristige Nachsorge wird ein separater CRF verwendet, um Informationen zu Gewicht, Größe, MUAC, Ernährung und Komorbiditätsgeschichte zu sammeln. Feldforschungsassistenten besuchen die Häuser der Eingeschriebenen und sammeln die erforderlichen Informationen, nachdem sie die schriftliche Zustimmung der Eltern oder Betreuer eingeholt haben.

Verwaltung:

Gruppe 1 (Kinder mit SAM): Geeignete SAM-Kinder werden für die Stabilisierungsphase in der Longer Stay Unit des Dhaka Hospital of icddr,b behandelt. Das standardisierte Behandlungsprotokoll für Kinder mit SAM und Durchfall (entwickelt am icddr,b und ausgerichtet an den WHO-Richtlinien; Ahmed et al. Lancet 1999) wird befolgt. Zu den Schlüsselelementen gehören anfänglich 2 stündliche Fütterung mit F-75 (die empfohlene Starternahrung, 130 ml/kg pro Tag), Folsäure, Vitamin A, Ampicillin plus Gentamicin, Temperatur- und Blutzuckerüberwachung und -kontrolle. Vor Beginn der Antibiotika-Therapie werden Ausgangs-Stuhlproben entnommen (bei Bedarf durch Stuhlkatheter).

Die Stabilisierungsphase dauert nach unserer Erfahrung durchschnittlich 4 Tage. Der Abschluss der Stabilisierungsphase ist gekennzeichnet durch einen zufriedenstellenden Appetit, keine Notwendigkeit einer Magensondenernährung, einen guten klinischen Allgemeinzustand, das Fehlen von Durchfall, Dehydratation, Fieber, Hypothermie oder Tachypnoe.

Stabilisierte Säuglinge werden nach Erhalt der schriftlichen Zustimmung der Betreuungsperson in die NRU verlegt. Stabilisierte Säuglinge werden nach Abschluss der 5- bis 7-tägigen Antibiotikakur randomisiert den 3 Behandlungsarmen zugeteilt. Der Leitende Ernährungsberater des Krankenhauses bereitet die Diät (F-100) vor und liefert sie an die NRU. F-100 wird in den ersten 2 Tagen alle 2 Stunden mit 130 ml/kg pro Tag und danach alle 3 Stunden verabreicht und schrittweise um 10 ml bei jeder Portion erhöht, bis etwas Futter übrig ist. Das Stillen zwischen den Mahlzeiten wird empfohlen. Die Menge der getrunkenen Muttermilch wird durch Testwiegen der Säuglinge geschätzt.

Betreuer werden geschult, um die Säuglinge psychosozial zu stimulieren, eine Aktivität, die routinemäßig in der NRU durchgeführt wird. Dies geschieht durch Sprechen oder Singen mit den Säuglingen, altersspezifische körperliche Aktivität und Spielen mit einheimischen Spielsachen.

Messung der Muttermilchaufnahme durch Testwiegen nach veröffentlichter Standardmethode (Islam et al., 2006):

Sammeln von Muttermilch:

Da diese Studie die Einpflanzung von Bifidobakterien untersuchen wird, die mit der Verfügbarkeit von HMOs in der Muttermilch verbunden ist, werden wir 10 ml Muttermilch unter aseptischen Bedingungen sammeln und auf den HMO-Gehalt analysieren.

Diese Analyse wird in Labors durchgeführt, die eine Erfolgsbilanz bei der Durchführung dieser Assays vorweisen können.

Darüber hinaus führen wir auch Mikrobiota-Analysen von gesammelten Muttermilchproben durch. Dies liegt daran, dass die Mikrobiota der Muttermilch wahrscheinlich die Besiedlung durch andere Organismen und die Darmleistung des Säuglings beeinflusst.

Muttermilch wird zwischen 07:00 und 11:00 Uhr aus der Brust entnommen, und die Frauen werden gebeten, mindestens 2 Stunden vor der Probenentnahme nicht an der Studienbrust gefüttert oder abgepumpt zu werden. Vor der Probenentnahme wird die Brust mit einem Jodtupfer gereinigt. Ein vollständiger Brustausdruck wird mit einem sterilen Einweg-Entnahmekit (Hygienikit®; Ameda, Cary, IL, USA) und einer elektrischen Brustpumpe (Modell SMR-B-R; Ameda-Egnell, Inc.) gesammelt. Die Milch wird sofort auf Eis gelegt.

Bif (8 Milliarden KBE/tägliche Einzeldosis), Bif (8 Milliarden KBE/tägliche Einzeldosis) + Präbiotikum (1 g/6 stündlich – 4 g/Tag) und Placebo (Laktose 625 mg) werden in Pulverform in enthaltenen Beuteln erhältlich sein innerhalb von Ernährungskits, die mit eindeutigen Codenummern gekennzeichnet sind, die mit dem Randomisierungscode jedes Säuglings übereinstimmen. Der Beutelinhalt wird einem Säugling einmal täglich für Bif- und Placebo-Beutel gemischt mit 5 ml Säuglingsanfangsnahrung oder Muttermilch verabreicht, und für jede Zubereitung von 200 ml F-100 wird ein Prebiotikum (LNnT)-Beutel aufgelöst. Betreuer, aber kein Studienpersonal, werden gegenüber der Behandlungszuweisung verblindet.

Die Dosis und Abgabe von LNnT wird letztendlich aus der Überprüfung der jüngsten Literatur sowie der Erfahrung von Experten abgeleitet, die auf diesem Gebiet tätig sind. Ziel ist es, die natürlichen Bedingungen der Verfügbarkeit von HMOs in der Muttermilch so weit wie möglich zu stimulieren.

Die Ernährungskits (Beutel), die randomisierten Säuglingen zugewiesen wurden, werden gekühlt oder gefroren gelagert, bis sie verwendet werden, während der Teilnehmer im Krankenhaus ist. Ernährungssets, die noch keinem Säugling zugewiesen wurden, werden in einem Krankenhaus-Gefrierschrank mit kontinuierlicher Temperaturüberwachung gelagert. Das im Gefrierschrank (-20 °C ± 5 °C) gelagerte Probiotikum kann bis zum auf dem Beutel aufgedruckten Verfallsdatum (1 Jahr ab Verpackungsdatum) verwendet werden. Es kann bis zu 31 Tage im Kühlschrank (4 °C ± 5 °C) aufbewahrt werden. Das Präbiotikum (LNnT) ist bei Raumtemperatur stabil, kann aber zusammen mit dem Probiotikum im Kühlschrank oder Gefrierschrank aufbewahrt werden.

Gruppe 2 (nicht unterernährte Kinder): Geeignete nicht unterernährte Säuglinge werden gemäß Krankenhausprotokoll behandelt. Kurz gesagt, sie werden in die Einheit für längere Aufenthalte oder bei Bedarf auf die Intensivstation aufgenommen. Das Krankenhaus hat Behandlungsprotokolle für akuten wässrigen Durchfall, Lungenentzündung und schwere Lungenentzündung, anhaltenden Durchfall, schwere Sepsis, Elektrolytstörungen und im Krankenhaus erworbene Infektionen definiert. Kinder werden gemäß diesen Protokollen im Krankenhaus behandelt. Ausschließlich gestillte Säuglinge erhalten weiterhin Muttermilch. Andere werden alle 2-3 Stunden mit modifizierter Säuglingsnahrung ergänzt. Die Menge der getrunkenen Muttermilch wird durch Testwiegen der Säuglinge geschätzt. Die Behandlung mit Bif beginnt am Tag des Abschlusses der Antibiotikakur und wird Säuglingen auf die gleiche Weise wie Gruppe 1 verabreicht. Der Beutelinhalt wird mit einem Teelöffel Säuglingsanfangsnahrung oder Muttermilch gemischt und dem Säugling zugeführt.

Selbst wenn die Studienteilnehmer abfallen oder eine im Krankenhaus erworbene Infektion entwickeln oder sich verschlechtern, müssen wir 18 auswertbare Fälle in jedem Arm abschließen.

Entlassung aus dem Krankenhaus:

Die Entlassung erfolgt, wenn der Säugling mit SAM ein Längengewicht > -3, möglichst ≥ -2 Z-Wert erreicht hat, und bei ödematöser Mangelernährung, wenn das Ödem zurückgeht und der Säugling gedeiht und klinisch gesund ist. Nicht unterernährte Säuglinge werden entlassen, wenn sie die Entlassungskriterien des Krankenhauses erfüllen. Bis dahin werden die Betreuer in der Zubereitung und Verabreichung von Nahrungsmitteln und Nahrungsergänzungsmitteln geschult sein.

Nachverfolgen:

Säuglinge mit SAM werden bis 8 Wochen nach der Randomisierung zweimal wöchentlich durch Hausbesuche von Forschungsassistenten nachuntersucht. Nicht unterernährte Säuglinge werden zweimal wöchentlich durch Hausbesuche begleitet, bis die Nahrungsergänzung abgeschlossen ist, und dann einmal wöchentlich bis 6 Wochen nach der Randomisierung. Während solcher Besuche werden die Rationen der Säuglingsnahrung (für SAM-Säuglinge) und Nahrungsergänzungsmittel (beide Gruppen) aufgefüllt, die tatsächliche Einnahme der Nahrung beobachtet oder die verabreichte Menge und die Methode der Rekonstitution überprüft und die Morbidität an einem individuellen Fall aufgezeichnet Rekordformular. Da das Nahrungsergänzungsmittel von B. infantis kühl gehalten werden sollte, um eine optimale Lebensfähigkeit zu erhalten, bringen Forschungsassistenten das Nahrungsergänzungsmittel in isolierten Boxen oder Kühlboxen mit Eis oder gefrorenen Gelpackungen zu Hausbesuchen. Obwohl sich das Supplement wahrscheinlich zwischen den Besuchen auf Raumtemperatur erwärmen wird, ist nicht zu erwarten, dass der Verlust der Lebensfähigkeit die Kolonisierung von B. infantis im Darm signifikant beeinflusst. Jedem Teilnehmer wird für den Studienzeitraum ein Minikühlschrank zur Verfügung gestellt, und alle Eltern werden angewiesen, das Nahrungsergänzungsmittel bis zur Verwendung in diesen Behältern aufzubewahren.

Säuglinge, die 8 Wochen nach der Randomisierung (Ende der Hausbesuche) noch keinen Gewicht-für-Länge-Z-Wert ≥ -1 erreicht haben, können den Säugling weiterhin zum Wiegen und Messen und zur Abholung der Säuglingsnahrungsrationen zu icddr,b bringen routinemäßig, bis ein Längengewicht ≥ -1 Z erreicht ist.

Es wird ein langfristiges Follow-up durchgeführt, um die Anthropometrie der eingeschriebenen Teilnehmer zu beurteilen.

Beispielsammlung:

Kotproben werden wie folgt gesammelt.

• Stuhlabstriche (zur Mikrobiomanalyse) (13 Mal in SAM, 11 Mal in Non-SAM)

  • Bei Aufnahme, vor Antibiotikabehandlung
  • Nach Stabilisierung, vor Randomisierung und Supplementierung
  • Tag 2 der Ergänzung
  • Tag 4 der Ergänzung
  • Tag 7 der Ergänzung
  • Tag 10 der Nahrungsergänzung (oder letzter Tag in NRU, wenn früher entlassen)
  • Tag 14 der Supplementierung (in NRU oder Abholung durch wissenschaftlichen Mitarbeiter bei Hausbesuch)
  • Tag 21 der Ergänzung (Abholung durch wissenschaftlichen Mitarbeiter bei Hausbesuch)
  • Tag 28 der Ergänzung (Abholung durch wissenschaftlichen Mitarbeiter bei Hausbesuch)
  • 1 Woche nach Supplementierung (Abholung durch wissenschaftlichen Mitarbeiter bei Hausbesuch)
  • 2 Wochen nach Supplementierung (Abholung durch wissenschaftlichen Mitarbeiter bei Hausbesuch)
  • 3 Wochen nach Supplementierung (Abholung durch wissenschaftlichen Mitarbeiter bei Hausbesuch): nur SAM
  • 4 Wochen nach Supplementierung (Abholung durch wissenschaftlichen Mitarbeiter bei Hausbesuch): nur SAM

• Stuhlstücke oder Stuhlproben aus Kathetern (für pH- und Entzündungsmarker) im Krankenhaus [nur SAM-Säuglinge]:

  • Bei Aufnahme, vor Antibiotikabehandlung
  • Nach Stabilisierung, vor Randomisierung und Supplementierung
  • Tag 7 der Nahrungsergänzung'
  • Tag 10 der Nahrungsergänzung (oder letzter Tag in NRU, wenn früher entlassen)
  • Tag 28 der Ergänzung (Abholung durch wissenschaftlichen Mitarbeiter bei Hausbesuch)
  • 4 Wochen nach Supplementierung (Abholung durch wissenschaftlichen Mitarbeiter bei Hausbesuch)

• Stuhlstücke oder Stuhlproben aus Kathetern (für pH- und Entzündungsmarker) im Krankenhaus [nur bei nicht unterernährten Säuglingen]:

  • Bei Aufnahme, vor Antibiotikabehandlung
  • Nach Beginn der Supplementierung, bei Entlassung aus dem Krankenhaus
  • Tag 28 der Ergänzung (Abholung durch wissenschaftlichen Mitarbeiter bei Hausbesuch)
  • 2 Wochen nach Supplementierung (Abholung durch wissenschaftlichen Mitarbeiter bei Hausbesuch)

Stuhlprobenentnahme im Krankenhaus:

Alle Kinder werden vom Dhaka Hospital, icddr,b, gemäß den oben genannten Ein- und Ausschlusskriterien untersucht. Das Forschungspersonal wird diese Kinder vor der Verabreichung eines Antibiotikums untersuchen. Vor der Entnahme von Stuhlproben wird das schriftliche Einverständnis des Erziehungsberechtigten eingeholt.

Stuhl sollte von jedem Kind frisch gesammelt werden. Die Proben müssen so schnell wie möglich nach der Entnahme, idealerweise weniger als 15 Minuten nach der Entnahme, sofort in voretikettierte 2-ml-Kryoröhrchen und in den Versandbehälter (~-70 °C) aliquotiert werden. Nach der Entnahme und vor dem Aliquotieren sollte das Stuhlsammelgefäß auf (nassem) Eis gehalten werden. Idealerweise würden die Kryoröhrchen ungefähr zu 2/3 gefüllt. Zweimal in der Woche werden diese kryokonservierten Proben zum Biosafety Level Laboratory im icddr,b Dhaka Hospital transportiert, um sie in einem -80⁰C Gefrierschrank zu lagern. Um ein Auftauen zu verhindern, werden die Fläschchen so schnell wie möglich vom Versandunternehmen in den -80⁰-Gefrierschrank überführt, während sie in Gefrierboxen überführt werden. Diese Gefrierboxen werden nicht aus dem -80⁰-Gefrierschrank entfernt, bis sie an World Courier für den Versand in die USA übergeben werden.

Maßnahmen zur bestmöglichen Rückgewinnung von Bakterien und deren Lebensfähigkeit:

1. Die Spediteure sollten vor dem Abholtag vollständig belastet werden, und es werden Aufzeichnungen darüber geführt, wie oft sie geöffnet werden.
2. Rund 12 Stunden nach Zugabe von Flüssigstickstoff benötigen die Verlader bis zur vollständigen Aufladung. Daher werden wir die Verlader am Ende eines jeden Tages wieder aufladen (füllen) und dann am nächsten Morgen jeglichen verbleibenden nicht absorbierten flüssigen Stickstoff abgießen, bevor wir sie verwenden.
3. Die Versender werden vor dem Beladen, nach dem Beladen (dh am nächsten Morgen nach dem Abgießen von nicht absorbiertem N2) und dann noch einmal am Ende eines jeden Tages gewogen, um zu wissen, wie viel flüssiger Stickstoff im Kanister verbleibt. Auf diese Weise können wir abschätzen, wie viel flüssiges N2 jedes Mal benötigt wird, wenn wir aufladen, und wie oft dies erforderlich ist.

Stuhlabstrichentnahme im Krankenhaus und bei der Gemeinde:

Stuhlproben werden wie im Zeitplan angegeben entnommen. Sobald die Teilnehmer aus der NRU entlassen wurden, wird der Stuhlabstrich innerhalb von zwei Tagen nach der geplanten Zeit gesammelt.

Für die Stuhlsammlung wird die Hauptbetreuungsperson des Kindes/Teilnehmers einen Tag vor der geplanten Stuhlsammlung informiert. Ein geschultes Forschungspersonal entnimmt dem Kind am Tag der geplanten Probenahme die erste verfügbare frische Stuhlprobe.

Während der Entnahme im Krankenhaus und in der Gemeinde erhält das Forschungspersonal die beschrifteten Stuhlabstrichröhrchen (mit Stabilisierungspuffer), einzeln verpackte Abstrichtupfer (mit Bruchstelle), einen kryogenen Marker und Plastiktüten.

Im Krankenhaus werden die Mütter/Betreuer angewiesen, das Forschungspersonal zu benachrichtigen, sobald das Kind Stuhlgang hat. Dann wird das Forschungspersonal Folgendes tun:

• Tupfe die verschmutzte Windel des Babys ab und sammle genügend Stuhlprobe, um den Kopf des Tupfers vollständig zu bedecken.
• Legen Sie den Tupfer in das entsprechend gekennzeichnete Entnahmeröhrchen mit grünem Verschluss und brechen Sie den Tupferkopf an der Bruchstelle ab – der Tupferkopf verbleibt im Röhrchen.
• Verschließen Sie das Röhrchen fest und schütteln Sie kräftig, um sicherzustellen, dass sich der Stuhl im Stabilisierungspuffer verteilt.
• Verwenden Sie den mitgelieferten kryogenen Marker (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4000221), Schreiben Sie das Datum, an dem der Stuhl gesammelt wurde, auf das Etikett auf dem Röhrchen.
• Wiederholen Sie den Tupfer mit einem zweiten sauberen Tupfer und dem doppelten Röhrchen mit grünem Verschluss.
• Legen Sie die Röhrchen mit grünem Verschluss wieder in die mitgelieferten Plastiktüten und lagern Sie sie bei Raumtemperatur, bis sie vom Gesundheitspersonal abgeholt werden.

Informationen über die Einnahme von Antibiotika werden während der Studie für jeden Teilnehmer gesammelt. Zum Zeitpunkt jeder Probenentnahme fragen wir die Mutter oder eine andere Bezugsperson nach Krankheiten in den letzten 14 Tagen und ob sie behandelt wurden. Die Art des Medikaments wird durch physische Inspektion des Medikaments, des Rezepts und durch Nachfragen nach dem Namen oder ob das Medikament ein Pulver war, das rekonstituiert werden musste, überprüft.

Speichelprobenentnahme der Mutter:

Wir werden den „Sekretorstatus-Phänotypisierungsassay“ im Speichel der Mutter durchführen, um den Sekretorstatus von Müttern zu sehen, um den HMO-Status sowie die Verbindung mit der Mikrobiota von Säuglingen zu erkennen.

Verfahren zur Speichelprobenentnahme

1. Mütter sollten die Hände waschen und den Mund mit kaltem Wasser ausspülen und das Wasser vollständig ausspucken.
2. Sie werden den Probennehmer entfernen und dabei darauf achten, nur den Griff zu berühren.
3. Mutter wird das Orakel-Probenahmeröhrchen mit Griff wie eine Zahnbürste halten und in ihren Mund einführen und eine Minute lang mit einem Schwamm über ihr Zahnfleisch reiben. Stellen Sie sicher, dass der Schwamm vollständig gesättigt ist.
4. ohne den Schwamm zu berühren, führen sie den Probennehmer mit dem Schwamm nach unten in das Original-Oracol-Röhrchen ein und schließen den Deckel fest.
5. Die Mutter gibt das Oracle-Probenröhrchen dem Studienpersonal zurück (das die Röhrchen etikettiert und kühlt, wenn die Proben nicht am selben Tag verarbeitet werden).

Sammlung und Transport von Stuhlproben aus der Gemeinde Jeder ausgebildete Gesundheitshelfer der Gemeinde ist für eine bestimmte Anzahl von Stuhlproben pro Monat verantwortlich. Sie wird die Mutter über das Handy kontaktieren und am frühen Morgen mit einem Benchtop-Stickstofftransporter zum Haus des Kindes kommen und den Stuhlabstrich abholen.

Die anfängliche Entnahme von Stuhlproben sollte in einem geeigneten sterilen Behälter erfolgen, wonach kleinere Aliquots des Stuhlmaterials vom Außendienstmitarbeiter (innerhalb von 20 Minuten nach dem Stuhlgang) in voretikettierte, sterile, kryosichere 2-ml-Röhrchen überführt werden sollten. Die Röhrchenetiketten sollten mindestens die Proben-ID (SID) des Teilnehmers und das Entnahmedatum enthalten.

Das Gesundheitspersonal trägt saubere Einweg-Latexhandschuhe und füllt jedes 2-ml-Kryoröhrchen mit einem sterilen Spatel etwa zur Hälfte bis zu zwei Dritteln und verschließt es fest. Der Probe werden keine Puffer, Konservierungsmittel oder Zusatzstoffe zugesetzt. Bei der Verwendung von Fläschchen mit Schraubverschluss ist Vorsicht geboten und sie dürfen nicht überfüllt werden, da dies das Risiko einer Kreuzkontamination der Proben während des Transports und der Lagerung minimiert.

Dann werden sie die verschlossenen Fläschchen sofort in mit flüssigem Stickstoff vorbefüllte „Dry Shippers“ stellen, um sie zurück ins Labor zu transportieren. Obwohl dies schwierig ist, sollten die Proben innerhalb von 20 Minuten nach dem Stuhlgang in Trockentransportbehälter überführt werden. Im Labor entleert geschultes Personal die Fläschchen aus dem Trockentransporter in einen Eimer mit Trockeneis, um ein Auftauen zu verhindern, während die Fläschchen sortiert und zur längerfristigen Lagerung und zum Transport in 9x9-Gefrierboxen überführt werden.

Berichterstattung:

Informationen werden auf dem Stool Field Collection Form (SFC) aufgezeichnet.

Untersuchungen:

Am icddrb durchgeführte Tests:

• Bestimmung des fäkalen pH-Werts im Krankenhauslabor
• Testen von Myeloperoxidase- und anderen Biomarkerspiegeln in Stuhlproben

Von Evolve Biosystems durchgeführte Tests:

• Sequenzierung der nächsten Generation, Metagenomik und q PCR-Analysen von Proben
• Immunbezogene Tests – Multiplex-Analyse von entzündlichen und immunbezogenen Zytokinen/Analyten
• IL-10, TGF-beta, IL-2, TNF-alpha, IL-17, IL-22, IL-8, IL-6, IP-10
• ELISAs für sCD83, sTLR2 und fäkales Lipocalin 2

Stuhl-PH:

Der pH-Wert des Stuhls wird gemessen, um die Veränderung des pH-Werts des Stuhls gegenüber der Grundlinie während der Supplementierung zu beurteilen.

Myeloperoxidase:

Myeloperoxidase ist ein spezifischer Marker für die Aktivität von Neutrophilen. Es wurde ausgewählt, weil es in der Muttermilch oder im Stuhl von gestillten Kindern nicht erhöht ist, wie dies bei Lactoferrin und Calprotectin der Fall ist (Dorosko et al., 2008) und die MPO-Spiegel im Stuhl mit der Krankheitsaktivität bei entzündlichen Darmerkrankungen korreliert wurden, was beides endoskopisch beurteilt wurde und biochemische Parameter (SAIKI T, 1998). Die MAL-ED-Studie hat bereits die Rolle von MPO als Marker der Darmfunktion gezeigt (McCormick et al., 2017).

Wir werden diese Biomarkerkonzentration mit einem kommerziellen ELISA messen.

Sequenzierung der nächsten Generation: In den letzten Jahren wurden mehrere Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation etabliert (Shendure & Ji, 2008), die es außerdem ermöglichen, eine große Anzahl von Mikroorganismen in verschiedenen Umgebungen (Tringe et al., 2005) und im menschlichen Körper zu analysieren Stellen (Ding & Schloss, 2014), einschließlich des menschlichen Darms (Methé et al., 2012).

16S-rDNA-Sequenzanalyse und Metagenomik sind zwei effektive DNA-Sequenzierungstechniken, und beide wurden verwendet, um unkultivierte mikrobiologische Gemeinschaften im Darm zu untersuchen. Die 16S-rDNA-Sequenzanalyse konzentriert sich auf die Sequenzierung des konservierten 16S-rDNA-Gens, das in allen Mikroben vorhanden ist (Woese & Fox, 1977) und hat eine Reihe neuer Zusammenhänge zwischen der Zusammensetzung der Darmmikrobiota und Krankheiten festgestellt (Blaser et al., 2013). Die auf der 16S-rDNA-Sequenz basierende Forschung ist eine Technik, um zu enthüllen, "wer ist da?" in einer bestimmten mikrobiellen Gemeinschaft, während die metagenomische Shotgun-Sequenzierung in der Lage sein wird, die ergänzende Frage zu beantworten: "Was können sie tun?" (Lepage et al., 2012). Die Sequenzierung der nächsten Generation wird durchgeführt, um die Transplantation von Organismen, insbesondere B. infantis, nach Eingriffen in schwer unterernährte Säuglinge zu erkennen und mit gut ernährten Kindern zu vergleichen.

Metagenomik:

Metagenomik wurde erstmals 1998 von Handelsman und Rodon (Handelsman et al., 1998) beschrieben und wurde zu einem weiteren DNA-Sequenzierungsansatz zur Untersuchung der komplexen mikrobiellen Gemeinschaft im Darm. Es zielt darauf ab, alle Gene einer Gemeinschaft durch zufällige Sequenzierung aller aus der Probe extrahierten DNA zu katalogisieren (Qin et al., 2010). Zunächst wird die Gesamt-DNA aller Mikroorganismen aus Kotproben extrahiert. Vor der Sequenzierung werden die gesamten DNA-Proben zufällig durch einen "Schrotflinten"-Ansatz geschoren. Die umfassenden Sequenzen werden dann analysiert, um entweder Artenprofile basierend auf phylogenetischen Markern (16S rDNA) (Sunagawa et al., 2010) oder genomische Profile basierend auf ganzen Genomen (Tringe et al., 2005) zu erhalten. Metagenomik spielt eine Rolle beim Verständnis des menschlichen Darmmikrobioms, einschließlich der Diversität des Darmmikrobioms, der Identifizierung neuer Gene und der Bestimmung der Ätiologie der funktionellen Dysbiose (Wang et al., 2015). Die Grundzusammensetzung der Darmmikrobiota (metagenomische Analyse) und die Bifidobacterium-Kolonisierung (relative Häufigkeit) durch metagenomische Analyse während/nach der Supplementierung wird durchgeführt.

qPCR: Für den quantitativen Nachweis von Organismen in DNA, die direkt aus einer Stuhlprobe extrahiert wurde, wird eine Echtzeit-PCR durchgeführt. B. infantis Kolonisation mittels qPCR während und nach Supplementierung (mit und ohne Präbiotika) erfolgen.

Zytokine:

Jegliches Zytokin, das lokal als Folge einer Darmentzündung produziert wird, kann in das Darmlumen gelangen und im Stuhl erscheinen. Ein großes entzündliches Infiltrat in der erkrankten Darmschleimhaut verursacht erhöhte Zytokine im Stuhl. Wir werden Zytokin-Assays durchführen, um Darmentzündungen zu erkennen. Wir messen in Stuhlproben Interleukin-10 (IL-10), Transforming Growth Factor-β (TGF-β), Interleukin-2 (IL-2), Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), Interleukin-17 ( IL-17), Interleukin-22 (IL-22), Interleukin-8 (IL-8), Interleukin-6 (IL-6), Interferon-Gamma-induziertes Protein 10 (IP-10).

ELISAs für sCD83, sTLR2:

Eine lösliche Form von CD83 wird aus aktivierten dendritischen Zellen und B-Lymphozyten freigesetzt und ist in normalen menschlichen Seren nachweisbar (Hock et al., 2001). Toll-like-Rezeptoren (TLRs) sind eine Klasse von Mustererkennungsrezeptoren (PRRs), die eine Schlüsselrolle bei der angeborenen Immunität spielen und eine spezifische Immunantwort auslösen. sTLR2 wurde in menschlichen Flüssigkeiten wie Plasma, Muttermilch, Speichel und Fruchtwasser sowie im Überstand kultivierter Monozyten nachgewiesen (LeBouder et al., 2003; Kuroishi et al., 2007; Dulay et al., 2009) We wird sCD83 und sTLR2 aus Stuhlproben von unterernährten Säuglingen isolieren.

Fäkales Lipocalin 2:

Dieses Glykoprotein wird in mehreren Zellen exprimiert und wurde mit primären und sekundären Granula menschlicher Neutrophiler in Verbindung gebracht (Roudkenar et al., 2007). Eine Hochregulierung von Lcn-2 wird bei gewebeschädigenden Zuständen wie Infektionen, Nierenschäden, Krebs, Colitis ulcerosa und Verbrennungen beobachtet, bei denen freie Radikale produziert werden (Chassaing et al., 2012). Lipocalin-2 korreliert weniger eng mit den Neutrophilenmarkern, es kann einen komplementären Marker für Epithelzellzerstörung oder -schädigung liefern (Prata et al., 2016). Wir werden den Test sowohl für unterernährte als auch für gut ernährte Säuglinge durchführen, um Enterozytenschäden festzustellen.

Muttermilchmikrobiota und HMO-Analyse:

Es gibt mehrere Studien, in denen die Muttermilchanalyse (Williams et al., 2017) und die Bakteriengemeinschaft in der Muttermilch (Hunt et al., 2011) bewertet wurden. In dieser Studie wird die Mikrobiota-Analyse mit 16S-rDNA-Sequenzanalyse durchgeführt. Die HMO-Messung wird durchgeführt, um den LnNT-Spiegel zu ermitteln.

Datenverarbeitungsverfahren:

• Die Fragebögen werden kurz nach dem Interview visuell gescannt und auf Auslassungen, Inkonsistenzen oder Fehler markiert, die sofort behoben werden
• SPSS wird verwendet und Daten werden eingegeben, nachdem eine Vorlage für jede Dateneingabedatei mit geeigneten Logik- und Konsistenzprüfungen erstellt wurde
• Die Daten werden kontinuierlich eingegeben, da die Daten in Krankenhaus und Labor generiert werden
• Die Daten werden durch eine Reihe von logischen und Bereichsprüfungen validiert, wodurch zusammenfassende Statistiken und Tabellen erstellt werden
• Zusätzlich werden 50 % CRF (und alle Variablen) von Prüfärzten überprüft.
• Die Daten werden sofort auf die Festplatten von zwei Computern kopiert, sobald die Datenprüfung abgeschlossen ist.

Berechnung der Stichprobengröße und Ergebnis (primäre und sekundäre) Variable(n):

Für die Pilotstudie werden wir 18 SAM-Säuglinge pro Behandlungsarm und weitere 18 nicht unterernährte Kinder einschreiben, also insgesamt 72 Säuglinge.

Datenanalyse Die Daten werden in die vorgetesteten Clinical Record Forms (CRFs) mit SPSS (Version 20.0, Armonk, NY) eingegeben und schließlich durch wiederholte Überprüfung bereinigt. Um das Ergebnis der präbiotischen und probiotischen Nahrungsergänzung bei unseren Studienkindern für normalverteilte Daten zu ermitteln, führen wir eine ANOVA durch, und im Falle einer nichtnormalen Verteilung der Messwerte werden äquivalente nichtparametrische Tests wie der Kruskal-Wallis-H-Test und ein geeigneter Post-hoc-Test verwendet Für die Subgruppenanalyse wird ggf. ein Test durchgeführt. Eine Wahrscheinlichkeit von weniger als 0,05 wird als statistisch signifikant betrachtet und die Stärke des Zusammenhangs wird durch Berechnung des Odds Ratio (OR) und des 95 % Konfidenzintervalls (CI) bestimmt. Wenn ein Todesfall eintritt, führen wir eine mündliche Autopsie durch und bewerten die damit verbundenen Todesfaktoren nach demselben Analyseplan.

Datensicherheitsüberwachungsplan (DSMP) Die Datensicherheitsüberwachung wird während des gesamten Studienverlaufs streng durchgeführt. Alle Formulare werden nach der Einschreibung und Datenerhebung vom Studienarzt und anschließend vom Betreuer auf Vollständigkeit, Lesbarkeit und interne Konsistenz überprüft. Die Verabreichung von Präbiotika und Probiotika im Krankenhaus erfolgt in Anwesenheit des Studienarztes. Alle Aspekte der Probenaufnahme, -verarbeitung und -interpretation werden ebenfalls gemäß SOPs durchgeführt.

Kooperationsvereinbarungen icddr,b wird die Studie in Zusammenarbeit mit Evolve BioSystems, Inc. USA durchführen, einem Privatunternehmen, das in Kalifornien von international anerkannten Akademikern gegründet wurde, die das Darmmikrobiom von Säuglingen und seine kritische Verbindung mit menschlicher Muttermilch erforschen.