对患有严重急性营养不良的小婴儿进行益生元和益生菌试验的试点

具体目标：

评估 6 个月以下严重急性营养不良婴儿补充益生菌（含和不含益生元）后的微生物组反应，并将微生物组反应与补充益生菌的健康婴儿进行比较。

研究地点：该研究将在孟加拉国国际腹泻病研究中心 (icddr,b) 的达卡医院进行。 该机构拥有设备齐全的临床护理以及能够进行所有临床测试的实验室设施。

研究人群：

第 1 组 (SAM) 第 2 组（非营养不良）

干涉：

长双歧杆菌亚种。 婴儿 (EVC001) 有和没有益生元补充 28 天将在研究中提供。

在发展中国家进行了几项研究，其中益生元和益生菌被用于严重急性营养不良和高危婴儿。 长双歧杆菌亚种的安全性。 infantis (EVC001) 从已发表的文献和安全报告中可以看出（Smilowi​​tz 等人，2017 年；Sheridan 等人，2017 年；Grenov 等人，2017 年；Panigrahi 等人，2017 年；Kerac 等人，2009 年） . IMPRINT 研究是一项 I 期临床试验，确定了用婴儿双歧杆菌 (EVC001) 补充母乳喂养婴儿的安全性和耐受性（Smilowi​​tz 等人，2017 年）。 EFSA（欧洲食品安全局）饮食产品、营养和过敏 (NDA) 相关食品小组评估了益生元 (LNnT) 的安全性，小组得出结论认为 LNnT 对婴儿是安全的。 国际益生菌和益生元科学协会 (ISAPP) 建议，一个有吸引力的临床干预目标将导致抗击营养不良的新方法（Sheridan 等人，2017 年）。 在乌干达使用益生菌对住院的 SAM 儿童进行的一项研究表明，益生菌可能在门诊阶段的 SAM 住院儿童随访中发挥作用，因为它显示腹泻持续时间显着减少（Grenov 等人，2017 年）。 在印度农村，观察到使用共生菌后婴儿的培养阳性和培养阴性败血症和下呼吸道感染显着减少（Kerac 等人，2009 年）。 PRONUT 研究没有证明任何与益生菌相关的菌血症病例。 微生物群对益生菌的反应可能因饮食或地理位置而异。

试用武器：

SAM 婴儿的 3 个治疗组：

• 安慰剂（乳糖）
• B. infantis 单独 (Bif)
• B. infantis + prebiotic Lacto-N-neotetraose [LNnT] (Bif+prebiotic) 每只手臂将被分配接受标准护理饮食（SAM 急性期治疗期间的 F-75，住院期间的 F-100 营养康复和标准化婴儿配方奶粉出院）。 治疗分配的随机化将按照 1:1 的比例进行，使用按年龄分层（2-3.9 个月对 4-6 个月），以确保婴儿按年龄组平等参与。 分配将通过使用大小为 3 的随机排列块来实现。总共将招募 54 名参与者，每个治疗组分配 18 名婴儿 (9+9)。

益生元将以 LNnT（Lacto-N-neotetraose，通过发酵产生，在化学上与人类母乳中存在的 LNnT 相同）的形式使用。 LNnT 包含婴儿双歧杆菌可以分解而其他细菌不能分解的特定连接。 在体外试验中，当培养基含有 50% 或更多的 LNnT 时，支持婴儿双歧杆菌的生长，但抑制拟杆菌和大肠杆菌的生长。 消耗这种结构所需的糖基水解酶的分布在整个变形杆菌（包括弯曲杆菌）中很少见，在拟杆菌中也不存在，因此 LNnT 不应有助于交叉喂养，即使没有婴儿双歧杆菌植入。

选择非营养不良儿童的目的是查看 SAM 婴儿被破坏的微生物群是否恢复到更高水平的婴儿双歧杆菌，类似于患有急性疾病并接受抗生素治疗的健康母乳喂养婴儿的水平。

样本量：

对于试点，我们每个治疗组将有 18 名婴儿，总共 54 名 SAM 婴儿。 我们还将招募 18 名非营养不良的婴儿进行开放标签婴儿双歧杆菌治疗。 共有 72 名婴儿将成为该试验的研究人群。

即使研究参与者下降或发生任何医院获得性感染或恶化，我们也必须在每组中完成 18 个可评估的病例。

基线数据收集程序：研究医师将根据研究资格标准筛选规定年龄组内的所有 SAM 和非 SAM 儿童。 在应用纳入和排除标准时，将邀请符合资格者的父母/主治护理人员同意其子女参加研究。 在签署书面知情同意书后，在提供有关研究及其干预措施的信息、解释可能的益处和风险、参与的自愿性质以及在初始同意后随时退出儿童的权利而无需提供任何理由后，儿童将由研究医师登记。 临床记录表将用于收集相关信息，例如病史，包括疾病的性质和持续时间，当前疾病的药物治疗；社会人口特征，如年龄、性别、宗教信仰、父母受教育年龄、父母职业、燃料使用和吸烟史、家庭月收入、兄弟姐妹人数等。 还将收集有关儿童喂养习惯的信息，例如母乳喂养史、配方奶或其他辅食以及免疫状况；记录结核病家族史、任何家庭成员近期呼吸道感染史和儿童既往病史。

对于长期随访，单独的 CRF 将用于收集有关体重、身高、MUAC、喂养和合并症历史的信息。 实地研究助理将访问登记者的房屋，并在征得父母或看护人的书面同意后收集所需信息。

管理：

第 1 组（患有 SAM 的儿童）：符合条件的 SAM 婴儿将在 icddr,b 的达卡医院长期住院病房接受稳定期治疗。 将遵循针对患有 SAM 和腹泻的儿童的标准化治疗方案（由 icddr,b 制定并与 WHO 指南保持一致；Ahmed et al Lancet 1999）。 关键要素包括最初每 2 小时喂食一次 F-75（推荐的起始配方，每天 130 毫升/千克）、叶酸、维生素 A、氨苄西林加庆大霉素、温度和血糖监测和控制。 在开始使用抗生素之前，将获得基线粪便样本（如果需要，通过粪便导管）。

根据我们的经验，稳定阶段平均持续 4 天。 完成稳定期的特征是食欲满意，无需鼻饲，一般临床状况良好，无腹泻、脱水、发热、体温过低或呼吸急促。

在收到护理人员的书面同意后，稳定的婴儿将被转移到 NRU。 一旦稳定的婴儿完成 5-7 天的抗生素疗程，他们将被随机分配到 3 个治疗组。 医院的高级营养师为 NRU 准备饮食 (F-100) 和用品。 F-100 在前 2 天每 2 小时每天分配 130 毫升/千克，此后每 3 小时分配一次，每次逐渐增加 10 毫升，直到剩下一些饲料。 鼓励在两次喂食之间进行母乳喂养。 消耗的母乳量将通过对婴儿进行测试称重来估计。

护理人员将接受培训，为婴儿提供社会心理刺激，这是 NRU 经常进行的一项活动。 这是通过与婴儿交谈或唱歌、特定年龄的体育活动和玩当地玩具来完成的。

按照标准公布的方法通过测试称重测量母乳摄入量（Islam 等人，2006 年）：

母乳采集：

由于本研究将调查与母乳中 HMO 可用性相关的双歧杆菌的植入，我们将在无菌条件下收集 10 毫升母乳并分析 HMO 含量。

该分析将在具有执行这些化验记录的实验室中进行。

此外，我们还将对收集的母乳样本进行微生物群分析。 这是因为母乳微生物群很可能会影响其他生物的定植和婴儿的肠道里程。

将在 0700 和 1100 小时之间从乳房收集母乳，并要求女性在样本收集前至少 2 小时内不要从研究乳房喂食或挤奶。 在样本采集之前，将用碘拭子清洁乳房。 将使用一次性、无菌收集套件（Hygienikit®；Ameda，Cary，IL，USA）和电动吸奶器（型号 SMR-B-R；Ameda-Egnell, Inc.）收集完整的乳汁。 牛奶将立即置于冰上。

Bif（80 亿 CFU/每日单次剂量-）、Bif（80 亿 CFU/每日单次剂量-）+ 益生元（1 克/6 小时-4 克/天）和安慰剂（乳糖 625 毫克）将以粉末形式提供，小袋装在标有与每个婴儿的随机化代码相匹配的唯一代码的喂养套件中。 将 Bif 和安慰剂小袋与 5 毫升婴儿配方奶粉或母乳混合，每天一次将小袋内容物施用于婴儿，每次制备 200 毫升 F-100 益生元 (LNnT) 小袋将溶解。 护理人员（但不是研究人员）将对治疗分配不知情。

LNnT 的剂量和分配最终将根据最近的文献回顾以及该领域专家的经验得出。 目标是尽可能地刺激母乳中 HMO 可用性的自然条件。

分配给随机分配的婴儿的喂养包（小袋）将冷藏或冷冻保存，直到参与者住院期间使用。 尚未分配给婴儿的喂养包将被存放在医院的冰箱中，并进行持续的温度监测。 储存在冰箱（-20°C ± 5°C）中的益生菌可以使用至小袋上印刷的有效期（自包装之日起 1 年）。 在冰箱 (4°C ± 5°C) 中最多可保存 31 天。 益生元 (LNnT) 在室温下稳定，但可以与益生菌一起储存在冰箱或冰柜中。

第 2 组（非营养不良儿童）：符合条件的非营养不良婴儿将按照医院方案接受治疗。 简而言之，他们将被送入长期住院病房或必要时送入加护病房。 医院制定了针对急性水样腹泻、肺炎和重症肺炎、持续性腹泻、严重败血症、电解质紊乱和医院获得性感染的治疗方案。 儿童将根据这些协议在医院接受治疗。 纯母乳喂养的婴儿将继续使用母乳。 其他人则每 2-3 小时补充一次改良婴儿配方奶粉。 消耗的母乳量将通过对婴儿进行测试称重来估计。 Bif 治疗将在完成抗生素疗程的当天开始，并将以与第 1 组相同的方式提供给婴儿。 小袋内容物将与一茶匙婴儿配方奶粉或母乳混合并喂给婴儿。

即使研究参与者下降或发生任何医院获得性感染或恶化，我们也必须在每组中完成 18 个可评估的病例。

出院：

如果患有 SAM 的婴儿已达到身长别体重 >-3，如果可能≥-2 Z 评分，并且在水肿消退且婴儿发育良好且临床表现良好时发生水肿性营养不良，则将出院。 非营养不良的婴儿在达到出院标准后将出院。届时，护理人员将接受食品和补充剂准备和管理方面的培训。

跟进：

患有 SAM 的婴儿将由研究助理每周两次进行家访，直至随机化后 8 周。 将通过每周两次家访对非营养不良婴儿进行跟踪，直到补充剂完成，然后每周一次，直到随机化后 6 周。 在此类访问期间，将补充婴儿配方奶粉（针对 SAM 婴儿）和补充剂（两组）的口粮，观察饮食的实际摄入量或验证给定的量和重构方法，并在定制案例中记录发病率记录形式。 由于婴儿双歧杆菌补充剂应保持低温以保持最佳生存能力，因此研究助理会将补充剂放在保温箱或装有冰块或冷冻凝胶包的冷藏箱中进行家访。 尽管补充剂可能会在两次访问之间升温至室温，但预计生存能力的丧失不会显着影响婴儿双歧杆菌在肠道中的定植。 在研究期间将向每位参与者提供一个微型冰箱，并且将指示每位家长将补充剂保存在这些容器中直至使用。

到随机化后 8 周（家访结束）尚未达到身长别体重 ≥ -1 Z 分数的婴儿可继续将婴儿带到 icddr,b 进行称重和测量并领取配方口粮在常规基础上，直到达到身长比 ≥ -1 Z。

将进行长期跟进以评估登记参与者的人体测量学。

样品采集：

将按如下方式收集粪便样本。

• 粪便拭子（用于微生物组分析）（SAM 13 次，非 SAM 11 次）

  • 入院时，抗生素治疗前
  • 稳定后，随机化和补充前
  • 补充剂第2天
  • 补充第4天
  • 补充剂第7天
  • 补充剂的第 10 天（如果提前出院，则为在 NRU 的最后一天）
  • 补充剂第 14 天（在 NRU 或在家访时由研究助理领取）
  • 补充第21天（研究助理家访领取）
  • 补充第28天（助研家访领取）
  • 补充后 1 周（由研究助理在家访时领取）
  • 补充后 2 周（由研究助理在家访时领取）
  • 补充后 3 周（由研究助理在家访时获取）：仅限 SAM
  • 补充后 4 周（由研究助理在家访时获取）：仅限 SAM

• 医院的粪便块或导管粪便样本（用于 pH 值和炎症标记物）[仅限 SAM 婴儿]：

  • 入院时，抗生素治疗前
  • 稳定后，随机化和补充前
  • 补充第7天'
  • 补充剂的第 10 天（如果提前出院，则为在 NRU 的最后一天）
  • 补充第28天（研究助理家访采集）
  • 补充后 4 周（研究助理在家访时收集）

• 医院的粪便块或导管粪便样本（用于 pH 值和炎症标记物）[仅限非营养不良的婴儿]：

  • 入院时，抗生素治疗前
  • 开始补充后，出院时
  • 补充第28天（研究助理家访采集）
  • 补充后 2 周（由研究助理在家访时收集）

医院大便样本采集：

根据上述纳入和排除标准，将从达卡医院 icddr,b 筛选所有儿童。 研究人员将在使用抗生素之前对这些儿童进行筛查。 在收集粪便样本之前，将征得法定监护人的书面同意。

应该从每个孩子身上新鲜收集粪便。 样品必须立即等分到预先标记的 2 ml 冷冻管中，并在收集后尽快放入托运器 (~-70⁰C)，最好在收集后 15 分钟内。 收集后和等分之前，粪便收集容器应保持在（湿）冰上。 理想情况下，冷冻管应装满大约 2/3。 每周两次，这些冷冻保存的样本将被运送到 icddr,b 达卡医院的生物安全级别实验室，并在 -80⁰C 冰箱中储存。 为了防止解冻，小瓶将在转移到冷冻箱的同时尽快从托运人转移到 -80⁰ 冷冻室。 在将这些冷冻箱移交给 World Courier 运往美国之前，它们不会从 -80⁰ 冷冻箱中取出。

确保最好地恢复细菌及其生存能力的措施：

1. 托运人应在收集日之前充满电，并将打开次数记录在案。
2. 托运人在添加液氮后需要大约 12 小时才能充满电。 因此，我们会在每天结束时对托运人重新充电（填充），然后在第二天早上使用前倒掉所有未吸收的液氮。
3. 托运人将在充电前、充电后（即第二天早上倒掉所有未吸收的 N2 后）称重，然后在每天结束时再次称重，以了解罐中剩余多少液氮。 这将使我们能够估计每次充电时需要多少液态 N2 以及需要多久一次。

医院和社区的粪便拭子采集：

将按照时间表中的说明收集粪便样本。 一旦参与者从 NRU 出院，粪便拭子将在预定时间的两天窗口内收集。

对于粪便收集，将在计划收集粪便前一天通知儿童/参与者的主要看护人。 训练有素的研究人员将在预定取样当天从孩子那里收集第一份可用的新鲜粪便样本。

在医院和社区收集期间，研究人员将获得贴有标签的粪便拭子管（含有稳定缓冲液）、单独包装的拭子（带断点）、低温标记物和塑料袋。

在医院中，将指示母亲/看护人在孩子排便后立即通知研究人员。 然后研究人员会做以下事情：

• 擦拭婴儿弄脏的尿布，收集足够的粪便样本以完全覆盖拭子的头部。
• 将拭子放入适当标记的绿色顶部收集管中，并在断点处折断拭子头 - 拭子头将保留在管中。
• 紧紧密封管子并用力摇晃以确保粪便在稳定缓冲液中分布。
• 使用提供的低温标记 (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4000221)， 在试管的标签上写下收集粪便的日期。
• 用第二根干净的棉签和重复的绿色顶管重复擦拭。
• 将带绿色顶盖的试管放回提供的塑料袋中，并在室温下存放，直到医护人员将其取走。

在研究期间，将为每位参与者收集有关抗生素摄入量的信息。 在每次采集样本时，我们会询问母亲或其他看护人在过去 14 天内是否有任何疾病，以及是否接受过治疗。 药物的性质将通过对药物、处方的物理检查以及询问名称或药物是否为必须重新配制的粉末来验证。

母亲唾液样本采集：

我们将在母亲的唾液中进行“分泌者状态表型分析”，以查看母亲的分泌者状态，以检测 HMO 状态以及与婴儿微生物群的联系。

唾液样本采集程序

1. 妈妈们要用冷水洗手漱口，把水吐干净。
2. 他们将取出取样器，小心只触摸手柄。
3. 母亲将甲骨文取样管的手柄当作牙刷，插入嘴里，用海绵在牙龈上摩擦一分钟。 确保海绵完全浸透。
4. 在不接触海绵的情况下，他们会将采样器插入原始的 Oracol 管中，用海绵擦拭，然后将盖子盖紧。
5. 母亲会将 Oracle 采样器管还给研究人员（如果样品不会在同一天进行处理，他们将标记并冷藏管）。

从社区收集和运输粪便样本 每个经过培训的社区卫生工作者将负责每月一定数量的粪便收集。 她将通过手机联系母亲，并在清晨带着台式氮气托运人到达孩子家并收集粪便拭子。

粪便样本的初始收集应在合适的无菌容器中进行，之后现场工作人员应将较小等分的粪便材料（在排便后 20 分钟内）转移到预先标记的无菌 2ml 低温安全试管中。 试管标签应至少包括参与者的样品 ID (SID) 和采集日期。

卫生工作者戴着干净的一次性乳胶手套，使用无菌抹刀将每个 2 ml 冷冻瓶装满大约二分之一到三分之二，并盖紧瓶盖。 样品中不会添加任何缓冲液、防腐剂或添加剂。 在使用螺旋盖小瓶时要小心，不要装得太满，因为这将最大限度地减少运输和储存过程中样品交叉污染的可能性。

然后他们会立即将加盖的小瓶放入预充液氮的“干燥托运器”中，运回实验室。 尽管困难，标本应在排便后 20 分钟内转移到干燥托运人处。 在实验室中，训练有素的工作人员会将小瓶从干燥托运器中倒出到一桶干冰中以防止解冻，同时将小瓶分类并将小瓶转移到 9x9 冷冻箱中以进行长期储存和运输。

报告：

信息将记录在粪便收集表 (SFC) 上。

调查：

在 icddrb 上进行的测试：

• 在医院实验室测定粪便 pH 值
• 检测粪便样本中的髓过氧化物酶和其他生物标志物水平

Evolve Biosystems 进行的测试：

• 样本的下一代测序、宏基因组学和 q PCR 分析
• 免疫相关测试 - 炎症和免疫相关细胞因子/分析物的多重分析
• IL-10、TGF β、IL-2、TNF α、IL-17、IL-22、IL-8、IL-6、IP-10
• sCD83、sTLR2 和粪便脂质运载蛋白 2 的 ELISA

大便酸碱度：

将测量粪便 PH 值以评估补充期间粪便 pH 值相对于基线的变化。

髓过氧化物酶：

髓过氧化物酶是中性粒细胞活性的特异性标志物。 之所以选择它，是因为它在母乳或母乳喂养儿童的粪便中没有像乳铁蛋白和钙卫蛋白那样升高（Dorosko 等人，2008 年），并且粪便 MPO 水平与炎症性肠病的疾病活动相关，这通过内窥镜评估和生化参数 (SAIKI T, 1998)。 MAL-ED 研究已经证明了 MPO 作为肠道功能标志物的作用（McCormick 等人，2017 年）。

我们将通过商业 ELISA 测量这种生物标志物的浓度。

Next Generation Sequencing：近年来，已经建立了几种下一代测序技术（Shendure & Ji, 2008），进一步使得分析不同环境（Tringe et al., 2005）和人体中的大量微生物成为可能位点（Ding & Schloss，2014，包括人类肠道（Methé 等人，2012）。

16S rDNA 序列分析和宏基因组学是两种有效的 DNA 测序技术，均已用于研究未培养的肠道微生物群落。 16S rDNA 序列分析侧重于对存在于所有微生物中的保守 16S rDNA 基因进行测序 (Woese & Fox, 1977)，并在肠道微生物群组成与疾病之间建立了一系列新的联系 (Blaser et al., 2013)。 基于16S rDNA序列的研究是一种揭示“谁在那儿？”的技术。在给定的微生物群落中，鸟枪法宏基因组测序将能够回答“它们能做什么？”的补充问题。 （Lepage 等人，2012 年）。 对严重营养不良的婴儿进行干预后，将进行下一代测序以检测生物体尤其是婴儿双歧杆菌的植入，并将其与营养良好的儿童进行比较。

宏基因组学：

宏基因组学于 1998 年由 Handelsman 和 Rodon 首次描述 (Handelsman et al., 1998)，并成为另一种研究复杂肠道微生物群落的 DNA 测序方法。 它旨在通过对从样本中提取的所有 DNA 进行随机测序来对社区中的所有基因进行分类（Qin et al., 2010）。 首先，从粪便样本中提取所有微生物的总DNA。 在测序之前，总 DNA 样本通过“鸟枪”方法随机剪切。 然后分析综合序列以获得基于系统发育标记 (16S rDNA) 的物种概况 (Sunagawa et al., 2010) 或基于全基因组的基因组概况 (Tringe et al., 2005)。 宏基因组学在理解人类肠道微生物组方面发挥着重要作用，包括肠道微生物组的多样性、识别新基因以及确定功能失调的病因（Wang 等人，2015 年）。 将在补充期间/之后通过宏基因组分析进行肠道微生物群（宏基因组分析）和双歧杆菌定植（相对丰度）的基线组成。

qPCR：将进行实时 PCR 以定量检测直接从粪便样本中提取的 DNA 中的生物体。 B. infantis 在补充期间和之后（有和没有益生元）通过 qPCR 进行定植。

细胞因子：

由于肠道炎症而局部产生的任何细胞因子都可能渗入肠腔并出现在粪便中。 肠道病变粘膜中的大量炎症浸润导致粪便中细胞因子升高。 我们将进行细胞因子检测以检测肠道炎症。 我们将测量粪便样本中的白细胞介素-10 (IL-10)、转化生长因子-β (TGF-β)、白细胞介素-2 (IL-2)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素-17 ( IL-17)、白细胞介素 22 (IL-22)、白细胞介素 8 (IL-8)、白细胞介素 6 (IL-6)、干扰素 Gamma 诱导蛋白 10 (IP-10)。

sCD83、sTLR2 的 ELISA：

CD83 的可溶性形式从活化的树突细胞和 B 淋巴细胞中释放出来，并且在正常人血清中可检测到（Hock 等人，2001）。 Toll 样受体 (TLR) 是一类模式识别受体 (PRR)，在先天免疫中发挥关键作用并触发特异性免疫反应。 sTLR2 已在人体体液中检测到，例如血浆、母乳、唾液和羊水以及培养的单核细胞的上清液（LeBouder 等人，2003 年；Kuroishi 等人，2007 年；Dulay 等人，2009 年）我们将从营养不良婴儿的粪便样本中分离出 sCD83 和 sTLR2。

粪脂运载蛋白 2：

这种糖蛋白在几种细胞中表达，并且与人类嗜中性粒细胞的初级和次级颗粒相关（Roudkenar 等人，2007）。 在感染、肾损伤、癌症、溃疡性结肠炎和烧伤等组织损伤情况下观察到 Lcn-2 的上调，这些情况会产生自由基（Chassaing 等人，2012 年）。 Lipocalin-2 与中性粒细胞标记物的相关性较低，它可能提供上皮细胞破坏或损伤的补充标记物（Prata 等人，2016 年）。 我们将对营养不良和营养良好的婴儿进行测试，以检测肠细胞损伤。

母乳微生物群和 HMO 分析：

有几项研究评估了母乳分析（Williams 等人，2017 年）和母乳中的细菌群落（Hunt 等人，2011 年）。 在这项研究中，微生物群分析将通过 16S rDNA 序列分析来完成。 将进行 HMO 测量以了解 LnNT 水平。

资料处理程序：

• 面试后不久将对问卷进行目视扫描，并标记遗漏、不一致或错误，并立即解决
• 在为每个数据输入文件创建模板并进行适当的逻辑和一致性检查后，将使用 SPSS 并输入数据
• 随着数据在医院和实验室生成，数据将不断输入
• 数据将通过一系列逻辑和范围检查进行验证，生成汇总统计数据和表格
• 此外，研究者将检查 50% CRF（和所有变量）。
• 数据校验完成后，数据会立即复制到两台电脑的硬盘上。

样本量计算和结果（主要和次要）变量：

对于试点研究，我们将在每个治疗组招募 18 名 SAM 婴儿，另外还有 18 名未营养不良的儿童，因此总共有 72 名婴儿。

数据分析数据将使用 SPSS（20.0 版本，Armonk，NY）输入到预先测试的临床记录表（CRF）中，并最终通过反复检查进行清理。 为了了解益生元和益生菌补充剂对我们研究儿童的正态分布数据的结果，我们将执行方差分析，如果测量值非正态分布，将使用等效的非参数检验，如 Kruskal-Wallis H 检验，并进行适当的事后分析如果需要，将对亚组分析进行测试。 小于 0.05 的概率将被视为具有统计学意义，关联强度将通过计算比值比 (OR) 和 95% 置信区间 (CI) 来确定。 如果发生任何死亡，我们将进行口头尸检，并通过相同的分析计划评估死亡的相关因素。

数据安全监控计划 (DSMP) 将在整个研究过程中严格执行数据安全监控。 所有表格将在注册和数据收集后由研究医师审查，然后由主管审查完整性、易读性和内部一致性。 益生元和益生菌在医院的给药将在研究医师在场的情况下进行。 标本加入、处理和解释的所有方面也将根据 SOP 进行。

合作安排 icddr,b 将与 Evolve BioSystems, Inc. USA 合作开展这项研究，Evolve BioSystems, Inc. USA 是一家私营企业，由国际知名院士在加利福尼亚州成立，主要研究婴儿肠道微生物组及其与母乳的重要关联。