Pilot af et præbiotisk og probiotisk forsøg med små spædbørn med alvorlig akut underernæring

Specifikke mål:

At evaluere mikrobiomresponsen på probiotisk tilskud (med og uden præbiotika) hos spædbørn under 6 måneder med alvorlig akut underernæring og at sammenligne mikrobiomresponsen med raske spædbørn suppleret med probiotika.

Studiested: Undersøgelsen vil blive udført på Dhaka Hospital i International Center for Diarrheal Disease Research, Bangladesh (icddr,b). Institutionen råder over veludstyret klinisk pleje samt laboratoriefaciliteter, der er i stand til at udføre alle de kliniske tests.

Undersøgelsespopulation:

Gruppe 1 (SAM) Gruppe 2 (ikke-underernæret)

Intervention:

Bifidobacterium longum subsp. infantis (EVC001) med og uden præbiotisk tilskud i 28 dage vil blive givet i undersøgelsen.

Der er flere undersøgelser i udviklingslandene, hvor præbiotika og probiotika blev brugt til alvorlig akut underernæring og blandt udsatte spædbørn. Sikkerhed for Bifidobacterium longum subsp. infantis (EVC001) fremgår af offentliggjort litteratur såvel som sikkerhedsrapporter (Smilowitz et al., 2017; Sheridan et al., 2017; Grenov et al., 2017; Panigrahi et al., 2017; Kerac et al., 2009) . IMPRINT-studiet, et fase I klinisk forsøg, fastslog sikkerheden og tolerabiliteten ved at supplere ammede spædbørn med B. infantis (EVC001) (Smilowitz et al., 2017). Sikkerheden ved præbiotika (LNnT) blev evalueret af EFSA (European Food Safety Authority) Panel for Diætetiske Produkter, Ernæring og Allergier (NDA) relaterede fødevarer, og panelet konkluderede, at LNnT er sikkert for spædbørn. International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics (ISAPP) anbefalede, at et attraktivt mål for kliniske interventioner vil føre til nye tilgange, der bekæmper fejlernæring (Sheridan et al., 2017). En undersøgelse afholdt i Uganda med probiotika hos indlagte SAM-børn afslørede, at probiotika kan have en rolle i opfølgningen af ​​indlagte børn med SAM i ambulant fase, da det viste signifikant reduktion af diarrévarigheden (Grenov et al., 2017). I landdistrikterne i Indien blev der observeret signifikant reduktion for kultur-positive og kultur-negative sepsis og nedre luftvejsinfektioner hos spædbørn med brug af symbiotika (Kerac et al., 2009). PRONUT-undersøgelsen viste ikke noget tilfælde af probiotisk relateret bakteriemi. Mikrobiotas reaktion på probiotika kan variere efter kost eller geografi.

Prøvevåben:

3 behandlingsarme til spædbørn med SAM:

• Placebo (laktose)
• B. infantis alene (Bif)
• B. infantis + præbiotisk Lacto-N-neotetraose [LNnT] (Bif+præbiotisk) Hver arm vil blive tildelt til at modtage standardbehandlingsdiæten (F-75 under akutfasebehandlingen af ​​SAM, F-100 under hospitalsophold til ernæringsmæssige formål) rehabilitering og standardiseret modermælkserstatning ved udskrivelse). Randomisering til behandlingstildeling vil blive udført i forholdet 1:1 ved brug af stratificering efter alder (2-3,9 måneder vs. 4-6 måneder) for at sikre ligelig deltagelse af spædbørn efter aldersgrupper. Tildeling opnås ved at bruge tilfældige permuterede blokke størrelse 3. I alt vil 54 deltagere blive tilmeldt med 18 spædbørn (9+9) tildelt i hver behandlingsarm.

Præbiotikum vil blive brugt i form af LNnT (Lacto-N-neotetraose, som produceres ved gæring og er kemisk identisk med LNnT, der findes i human modermælk. LNnT indeholder en specifik binding, som B. infantis kan nedbryde, mens andre bakterier ikke kan. I in vitro-assayet, når vækstmediet indeholder 50 % eller mere af LNnT, understøttes væksten af ​​B. infantis, men væksten af ​​Bacteroides og E. coli hæmmes. Fordelingen af ​​de glycosylhydrolaser, der er nødvendige for at forbruge denne struktur, er sjælden blandt Proteobakterier (inklusive Campylobacter) som helhed og fraværende blandt Bacteroides, og derfor bør LNnT ikke bidrage til krydsfodring, selv i fravær af B. infantis-engraftment.

Formålet med at udvælge de ikke-underernærede børn er at se, om den forstyrrede mikrobiota hos SAM-spædbørn kommer sig til et højere niveau af B. infantis, svarende til de niveauer, der ses hos raske ammede spædbørn, der har en akut sygdom og behandles med et antibiotikum.

Prøvestørrelse:

Til piloten vil vi have 18 spædbørn pr. behandlingsarm, i alt 54 SAM-spædbørn. Vi vil også tilmelde 18 ikke-underernærede spædbørn til den åbne B. infantis-behandling. I alt 72 spædbørn vil være undersøgelsespopulationen for denne pilot.

Selvom undersøgelsesdeltagere falder eller udvikler en hospitalserhvervet infektion eller forværres, skal vi gennemføre 18 evaluerbare tilfælde i hver arm.

Grundlæggende dataindsamlingsprocedure: Alle SAM- og ikke-SAM-børn inden for de definerede aldersgrupper vil blive screenet for undersøgelsesberettigelseskriterier af undersøgelseslægen. Forældre/behandlende omsorgsgivere til dem, der opfylder berettigelsen, vil i henhold til inklusions- og eksklusionskriterierne blive opfordret til at give deres samtykke til optagelse af deres børn i undersøgelsen. Efter at have underskrevet et skriftligt informeret samtykke, efter at have givet oplysninger om undersøgelsen og dens interventioner, forklare mulige fordele og risici samt frivillig karakter af deltagelse sammen med retten til at trække børn tilbage på et hvilket som helst tidspunkt efter det oprindelige samtykke uden at give nogen grund, vil børn blive indskrevet af studielægen. Klinisk journalformular vil blive brugt til at indsamle relevante oplysninger såsom sygehistorie, herunder arten og varigheden af ​​sygdom, medicin for nuværende sygdom; sociodemografiske karakteristika såsom alder, køn, religion, forældrenes alder med uddannelse, forældrenes beskæftigelse, brændstofforbrug og rygehistorie, månedlig familieindkomst, antal søskende osv. Der vil også blive indsamlet oplysninger om barnets fodringspraksis, såsom historie med amning, modermælkserstatning eller anden supplerende ernæring og immuniseringsstatus; familiehistorie med tuberkulose, nylig luftvejsinfektion hos ethvert familiemedlem og tidligere sygehistorie for barnet vil blive registreret.

Til langtidsopfølgning vil separat CRF blive brugt til at indsamle information om vægt, højde, MUAC, fodring og co-morbiditetshistorie. Feltforskningsassistenter vil besøge de tilmeldtes huse og indsamle de nødvendige oplysninger efter skriftligt samtykke fra forældre eller omsorgsperson.

Ledelse:

Gruppe 1 (børn med SAM): Berettigede SAM-spædbørn vil blive behandlet til stabiliseringsfasen i Longer Stay Unit på Dhaka Hospital i icddr,b. Den standardiserede behandlingsprotokol for børn med SAM og diarré (udviklet ved icddr,b og tilpasset WHOs retningslinjer; Ahmed et al Lancet 1999) vil blive fulgt. Nøgleelementer omfatter indledningsvis 2 timers fodring med F-75 (den anbefalede startformel, 130 ml/kg pr. dag), folinsyre, vitamin A, Ampicillin plus Gentamicin, temperatur- og blodsukkerovervågning og -kontrol. Inden påbegyndelse af antibiotika vil der blive udtaget baseline-afføringsprøver (med fækal kateter om nødvendigt).

Stabiliseringsfasen varer i gennemsnit 4 dage efter vores erfaring. Afslutning af stabiliseringsfasen er karakteriseret ved en tilfredsstillende appetit, intet behov for nasogastrisk sondeernæring, god almen klinisk tilstand, fravær af diarré, dehydrering, feber, hypotermi eller takypnø.

Spædbørn, der er stabiliseret, overføres til NRU efter at have modtaget skriftligt samtykke fra omsorgspersonen. Stabiliserede spædbørn vil blive randomiseret til de 3 behandlingsarme, når de har afsluttet 5-7 dages antibiotikakur. Hospitalets Seniordiætist forbereder diæten (F-100) og leverer til NRU. F-100 dispenseres med 130 ml/kg pr. dag hver 2. time de første 2 dage, og gives derefter hver 3. time og øges gradvist med 10 ml ved hver portion, indtil der er noget foder tilbage. Amning opfordres til mellem fodringerne. Mængden af ​​indtaget modermælk vil blive estimeret ved testvejning af spædbørn.

Omsorgspersoner vil blive uddannet til at give psykosocial stimulering til spædbørn, en aktivitet, der udføres rutinemæssigt i NRU. Dette gøres ved at tale eller synge til spædbørnene, aldersspecifik fysisk aktivitet og leg med lokalt legetøj.

Måling af modermælksindtag ved testvejning efter offentliggjort standardmetode (Islam et al., 2006):

Indsamling af modermælk:

Da denne undersøgelse vil undersøge indpodningen af ​​bifidobakterier, som er forbundet med tilgængeligheden af ​​HMO'er i modermælk, vil vi indsamle 10 ml modermælk under aseptisk tilstand og vil blive analyseret for HMO-indhold.

Denne analyse vil blive udført i laboratorier, der har en track record for at udføre disse assays.

Derudover vil vi også udføre mikrobiotaanalyse af indsamlede modermælksprøver. Dette skyldes, at modermælksmikrobiota sandsynligvis vil påvirke koloniseringen af ​​andre organismer og spædbarnets tarmkørsel.

Modermælk vil blive opsamlet fra brystet mellem kl. 07.00 og 11.00, og kvinder vil blive bedt om ikke at spise eller udpumpe fra undersøgelsesbrystet i mindst 2 timer før prøvetagning. Før prøveudtagning vil brystet blive renset med en jodpind. En komplet brystekspression vil blive indsamlet ved hjælp af et sterilt engangsopsamlingskit (Hygienikit®; Ameda, Cary, IL, USA) og en elektrisk brystpumpe (Model SMR-B-R; Ameda-Egnell, Inc.). Mælk vil straks blive lagt på is.

Bif (8 milliarder CFU/daglig enkeltdosis-), Bif (8 milliarder CFU/daglig enkeltdosis-) + præbiotikum (1gm/6hourly-4gm/dag) og placebo (lactose 625mg) vil være tilgængelige i pulverformat i poser indeholdt i fodringssæt mærket med unikke kodenumre, der matcher randomiseringskoden for hvert spædbarn. Posens indhold vil blive indgivet til et spædbarn én gang dagligt for Bif og placebo-poser blandet med 5 ml modermælkserstatning eller modermælk, og hvert præparat på 200 ml F-100 én præbiotisk (LNnT) pose vil blive opløst. Pårørende, men ikke studiepersonale, vil blive blindet for behandlingsopgave.

Dosis og dispensering af LNnT vil i sidste ende blive afledt af gennemgang af nyere litteratur samt erfaringer fra eksperter, der arbejder på dette område. Målet er så meget som muligt at stimulere de naturlige betingelser for tilgængelighed af HMO'er i modermælk.

De ernæringssæt (poser), der er blevet tildelt randomiserede spædbørn, vil blive nedkølet eller opbevaret frosset, indtil de bruges, mens deltageren er indlagt. Ernæringssæt, der endnu ikke er blevet tildelt et spædbarn, vil blive opbevaret i en hospitalsfryser med kontinuerlig temperaturovervågning. Probiotika opbevaret i fryseren (-20°C ± 5°C) kan bruges indtil udløbsdatoen trykt på brevet (1 år fra emballagedatoen). Det kan opbevares i op til 31 dage i køleskabet (4°C ± 5°C). Præbiotikaet (LNnT) er stabilt ved stuetemperatur, men kan opbevares i køleskab eller fryser sammen med probiotikaet.

Gruppe 2 (ikke-underernærede børn): Berettigede ikke-underernærede spædbørn vil blive behandlet i henhold til hospitalets protokol. Kort fortalt er de indlagt på Længere Opholdsafdelingen eller om nødvendigt på intensivafdelingen. Hospitalet har defineret behandlingsprotokoller for akut vandig diarré, lungebetændelse og svær lungebetændelse, vedvarende diarré, svær sepsis, elektrolytforstyrrelser og hospitalserhvervede infektioner. Børn vil blive behandlet på hospitalet i henhold til disse protokoller. Spædbørn, der udelukkende ammes, vil fortsætte med modermælk. Andre suppleres med modificeret modermælkserstatning hver 2.-3. time. Mængden af ​​indtaget modermælk vil blive estimeret ved testvejning af spædbørn. Behandling med Bif starter på dagen for afslutningen af ​​antibiotikakuren og vil blive givet til spædbørn på samme måde som gruppe 1. Posens indhold blandes med en teskefuld modermælkserstatning eller modermælk og gives til spædbarnet.

Selvom undersøgelsesdeltagere falder eller udvikler en hospitalserhvervet infektion eller forværres, skal vi gennemføre 18 evaluerbare tilfælde i hver arm.

Udskrivelse fra hospital:

Udskrivelsen vil ske, hvis spædbarnet med SAM har opnået en vægt-i-længde >-3, om muligt ≥ -2 Z-score, og i tilfælde af ødematøs underernæring, når ødemet forsvinder, og når spædbarnet trives og klinisk godt. Ikke-underernærede spædbørn vil blive udskrevet, når de opfylder hospitalsudskrivningskriterierne. Inden da vil plejepersonalet være uddannet til mad- og kosttilskudsforberedelse og administration.

Opfølgning:

Spædbørn med SAM vil blive fulgt op gennem hjemmebesøg af forskningsassistenter to gange hver uge indtil 8 uger efter randomisering. Ikke-underernærede spædbørn vil blive fulgt gennem hjemmebesøg to gange om ugen, indtil tilskuddet er afsluttet, og derefter en gang om ugen indtil 6 uger efter randomisering. Under sådanne besøg vil rationerne af modermælkserstatning (for SAM-spædbørn) og kosttilskud (begge grupper) blive genopfyldt, det faktiske indtag af kosten vil blive observeret eller den indgivne mængde og rekonstitueringsmetoden verificeret, og sygelighed registreret på et tilpasset tilfælde registreringsformular. Fordi B. infantis-tilskuddet skal opbevares køligt for at opretholde optimal levedygtighed, vil forskningsassistenter medbringe tilskuddet til hjemmebesøg i isolerede kasser eller kølere med is eller frosne gelpakker. Selvom tilskuddet sandsynligvis vil varme op til stuetemperatur mellem besøgene, forventes det ikke, at levedygtighedstabet vil påvirke koloniseringen af ​​B. infantis i tarmen væsentligt. Et miniaturekøleskab vil blive udleveret til hver deltager i undersøgelsesperioden, og hver forælder vil blive instrueret i at opbevare tilskuddet i disse beholdere indtil brug.

Spædbørn, der endnu ikke har opnået en vægt-for-længde ≥ -1 Z-score 8 uger efter randomisering (afslutning af hjemmebesøg), kan fortsætte med at bringe spædbarnet til icddr,b for vejning og måling og for at afhente modermælksrationerne rutinemæssigt indtil en vægt-for-længde ≥ -1 Z er opnået.

En langsigtet opfølgning vil blive udført for at vurdere antropometrien af ​​tilmeldte deltagere.

Samling af prøver:

Fækale prøver vil blive indsamlet som følger.

• Afføringsprøver (til mikrobiomanalyse) (13 gange i SAM, 11 gange i ikke-SAM)

  • Ved indlæggelse, forud for antibiotikabehandling
  • Efter stabilisering, før randomisering og supplering
  • Dag 2 af tilskud
  • Dag 4 af tilskud
  • Dag 7 af tilskud
  • Dag 10 af tilskud (eller sidste dag i NRU, hvis udskrevet tidligere)
  • Dag 14 i tilskud (i NRU eller afhentet af forskningsassistent ved hjemmebesøg)
  • Dag 21 af tilskud (afhentes af forskningsassistent ved hjemmebesøg)
  • Dag 28 med tilskud (afhentes af forskningsassistent ved hjemmebesøg)
  • 1 uge efter tilskud (afhentes af forskningsassistent ved hjemmebesøg)
  • 2 uger efter tilskud (hentes af forskningsassistent ved hjemmebesøg)
  • 3 uger efter tilskud (afhentes af forskningsassistent ved hjemmebesøg): Kun SAM
  • 4 uger efter tilskud (afhentes af forskningsassistent ved hjemmebesøg): Kun SAM

• Afføringsstykker eller kateterafføringsprøver (til pH og inflammatoriske markører) på hospital [kun SAM-spædbørn]:

  • Ved indlæggelse, forud for antibiotikabehandling
  • Efter stabilisering, før randomisering og supplering
  • Dag 7 af tilskud'
  • Dag 10 af tilskud (eller sidste dag i NRU, hvis udskrevet tidligere)
  • Dag 28 af tilskud (indsamlet af forskningsassistent ved hjemmebesøg)
  • 4 uger efter tilskud (indsamlet af forskningsassistent ved hjemmebesøg)

• Afføringsstykker eller kateterafføringsprøver (til pH og inflammatoriske markører) på hospital [kun ikke-underernærede spædbørn]:

  • Ved indlæggelse, forud for antibiotikabehandling
  • Efter start af tilskud, ved hospitalsudskrivning
  • Dag 28 af tilskud (indsamlet af forskningsassistent ved hjemmebesøg)
  • 2 uger efter tilskud (indsamlet af forskningsassistent ved hjemmebesøg)

Indsamling af afføringsprøve på hospitalet:

Alle børn vil blive screenet fra Dhaka Hospital, icddr,b i henhold til ovennævnte inklusions- og eksklusionskriterier. Forskningspersonale vil screene disse børn før administration af et antibiotikum. Inden afhentning af afføringsprøver vil der blive taget skriftligt samtykke fra værge.

Afføring skal hentes frisk fra hvert barn. Prøverne skal straks fordeles i præ-mærkede 2 ml kryoglas og i afsenderen (~-70⁰C) så hurtigt som muligt efter afhentning, ideelt set mindre end 15 minutter efter afhentning. Efter opsamling og før alikvotering skal afføringsbeholderen holdes på (våd) is. Ideelt set ville kryobalerne være fyldt til ca. 2/3. To gange om ugen vil disse kryokonserverede prøver blive transporteret til Biosafety Level Laboratory i icddr,b Dhaka Hospital til opbevaring i -80⁰C fryser. For at forhindre optøning overføres hætteglassene fra afsenderen til -80⁰ fryseren så hurtigt som muligt, mens de overføres til frysebokse. Disse frysebokse vil ikke blive fjernet fra -80⁰ fryseren, før de er afleveret til World Courier for forsendelse til USA.

Foranstaltninger til at sikre bedst mulig genopretning af bakterier og deres levedygtighed:

1. Afsendere bør være fuldt opladet inden afhentningsdagen, og der vil blive vedligeholdt et register over det antal gange, de vil blive åbnet.
2. Afsendere skal bruge omkring 12 timer efter at have tilføjet flydende nitrogen for at blive fuldt opladet. Derfor vil vi genoplade (fylde) afsendere ved slutningen af ​​hver dag og derefter hælde eventuelt resterende uabsorberet flydende nitrogen fra næste morgen, inden vi bruger dem.
3. Sendere vil blive vejet før opladning, efter opladning (dvs. næste morgen efter at have hældt eventuel uabsorberet N2 fra) og derefter igen ved slutningen af ​​hver dag for at vide, hvor meget flydende nitrogen der er tilbage i beholderen. Dette vil give os mulighed for at estimere, hvor meget flydende N2 der er behov for, hver gang vi genoplader, og hvor ofte det er nødvendigt.

Indsamling af afføringspinde på hospitalet og fra Fællesskabet:

Afføringsprøver vil blive indsamlet som nævnt i tidsplanen. Når deltagerne er udskrevet fra NRU, vil afføringspodningen blive indsamlet inden for et to-dages vindue fra det planlagte tidspunkt.

Ved afhentning af afføring vil barns/deltagers primære vicevært blive informeret en dag før planlagt afføring. Et uddannet forskningspersonale vil indsamle den første tilgængelige friske afføringsprøve fra barnet på dagen for den planlagte prøvetagning.

Under indsamling på hospitalet og i samfundet vil forskningspersonalet blive forsynet med de mærkede afføringspinderør (indeholdende stabiliseringsbuffer), individuelt indpakkede podepinde (med brudpunkt), en kryogen markør og plastikposer.

På Hospitalet vil mødrene/plejerne blive instrueret i at underrette forskningspersonalet, så snart barnet har afføring. Derefter vil forskningspersonalet gøre følgende:

• Vat babyens snavsede ble, og opsaml nok afføringsprøve til helt at belægge podepindens hoved.
• Anbring podepinden i det passende mærkede opsamlingsrør med grøn top, og klik podepinden af ​​ved brudpunktet - podepinden forbliver i røret.
• Forsegl røret tæt og ryst kraftigt for at sikre fordeling af afføringen i stabiliseringsbufferen.
• Ved at bruge den medfølgende kryogene markør (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4000221), skriv datoen hvor afføringen blev samlet på etiketten på røret.
• Gentag podningen med en anden ren vatpind og det duplikatrør med grøn toppet.
• Placer rør med grønt toppe tilbage i de medfølgende plastikposer og opbevar ved stuetemperatur, indtil de afhentes af sundhedspersonalet.

Oplysninger om antibiotikaindtag vil blive indsamlet for hver deltager i løbet af undersøgelsen. På tidspunktet for hver prøvetagning vil vi bede mor eller anden omsorgsperson om enhver sygdom inden for de sidste 14 dage, og om den er behandlet. Lægemidlets art vil blive verificeret ved fysisk inspektion af lægemidlet, recepten og ved at spørge om navnet, eller om lægemidlet var et pulver, der skulle rekonstitueres.

Spytprøvesamling fra mor:

Vi vil udføre "Secretor status phenotyping assay" i mødres spyt for at se mødres sekretorstatus for at påvise HMO-status samt forbindelse med spædbørns mikrobiota.

Spytprøvetagningsprocedure

1. Mødre skal vaske hænder og skylle munden med koldt vand og spytte vand helt ud.
2. De vil fjerne prøveudtageren og være forsigtig med kun at røre ved håndtaget.
3. Mor holder Oracle-prøverøret i håndtaget som en tandbørste og indsætter i munden og gnider en svamp mod hendes tandkød i et minut. Sørg for, at svampen er fuldstændig mættet.
4. uden at røre svampen, vil de indsætte prøveudtageren i det originale Oracol-rør, svampe ned og lukke låget tæt.
5. Mor vil give Oracle prøvetagningsrøret tilbage til undersøgelsespersonalet (som vil mærke og nedkøle rørene, hvis prøverne ikke vil blive behandlet samme dag).

Indsamling og transport af afføringsprøver fra lokalsamfundet. Hver uddannet sundhedsarbejder vil være ansvarlig for et vist antal afføringsudtagninger om måneden. Hun vil kontakte mor over mobiltelefon og ankomme til barnets hus tidligt om morgenen med en nitrogenafsender på bænken og samle afføringsvaberen.

Indledende indsamling af fækale prøver bør foretages i en passende steril beholder, hvorefter mindre portioner af fækalt materiale skal overføres af feltarbejderen (inden for 20 minutter efter afføring) til præ-mærkede, sterile 2 ml kryosikre rør. Røretiketter skal som minimum indeholde deltagerens prøve-id (SID) og datoen for afhentning.

Iført rene latexhandsker til engangsbrug fylder sundhedspersonalet hvert 2 ml kryo-hætteglas ca. en halv til to tredjedele op med en steril spatel og hætten tæt. Eventuelle buffere, konserveringsmidler eller tilsætningsstoffer vil ikke blive tilsat prøven. Der vil blive taget forholdsregler under brug af hætteglas med skruelåg og ikke overfyldning af dem, da dette vil minimere risikoen for krydskontaminering af prøver under transport og opbevaring.

Derefter vil de placere de lukkede hætteglas i flydende nitrogen på forhånd ladede "tør afsendere" med det samme for at transportere tilbage til laboratoriet. Selvom det er vanskeligt, skal prøverne overføres til tørre afsendere inden for 20 minutter efter afføring. I laboratoriet vil uddannet personale tømme hætteglassene fra tørafsenderen i en spand tøris for at forhindre optøning, mens hætteglassene sorteres og overføres til 9x9 frysebokse til længere tids opbevaring og transport.

Rapportering:

Oplysningerne vil blive registreret på Stool Field Collection Form (SFC).

Undersøgelser:

Test udført på icddrb:

• bestemmelse af fækal pH i hospitalslaboratoriet
• Test af myeloperoxidase og andre biomarkørniveauer i fækale prøver

Test udført af Evolve Biosystems:

• Next Generation Sequencing, Metagenomics og q PCR analyser af prøver
• Immun-relaterede tests- Multiplex analyse af inflammatoriske og immun-relaterede cytokiner/analytter
• IL-10, TGF beta, IL-2, TNF alfa, IL-17, IL-22, IL-8, IL-6, IP-10
• ELISA'er for sCD83, sTLR2 og fækalt lipocalin 2

Taburet PH:

Afføringens PH vil blive målt for at vurdere ændringen fra baseline i afføringens pH under tilskud.

Myeloperoxidase:

Myeloperoxidase er en specifik markør for neutrofil aktivitet. Det blev valgt, fordi det ikke er forhøjet i modermælk eller i afføringen hos ammede børn, ligesom lactoferrin og calprotectin (Dorosko et al., 2008), og afførings MPO-niveauer er blevet korreleret med sygdomsaktivitet ved inflammatorisk tarmsygdom, vurderet både ved endoskopisk og biokemiske parametre (SAIKI T, 1998). MAL-ED-studie har allerede vist MPO's rolle som en markør for tarmfunktion (McCormick et al., 2017).

Vi vil måle denne biomarkørkoncentration ved en kommerciel ELISA.

Next Generation Sequencing: I de senere år er der etableret flere næste-generations sekventeringsteknologier (Shendure & Ji, 2008), som yderligere gør det muligt at analysere et stort antal mikroorganismer i forskellige miljøer (Tringe et al., 2005) og menneskekroppen steder (Ding & Schloss, 2014, herunder den menneskelige tarm (Methé et al., 2012).

16S rDNA-sekvensanalyse og metagenomi er to effektive DNA-sekventeringsteknikker, og begge er blevet brugt til at studere ukultiverede tarmmikrobielle samfund. 16S rDNA-sekvensanalyse fokuserer på sekventering af det konserverede 16S rDNA-gen, der er til stede i alle mikrober (Woese & Fox, 1977) og har etableret en række nye forbindelser mellem intestinal mikrobiotasammensætning og sygdom (Blaser et al., 2013). Forskningen baseret på 16S rDNA-sekvens er en teknik til at afsløre "hvem er der?" i et givet mikrobielt samfund, mens shotgun metagenomisk sekventering vil være i stand til at besvare det komplementære spørgsmål om "hvad kan de gøre?" (Lepage et al., 2012). Næste generations sekventering vil blive udført for at detektere indplantning af organismer, især B. infantis efter intervention i alvorligt underernærede spædbørn og sammenligne det med velernærede børn.

Metagenomics:

Metagenomics blev først beskrevet i 1998 af Handelsman og Rodon (Handelsman et al., 1998) og blev en anden DNA-sekventeringstilgang til at studere det komplekse tarmmikrobielle samfund. Det har til formål at katalogisere alle gener fra et samfund ved tilfældig sekventering af alt DNA ekstraheret fra prøven (Qin et al., 2010). For det første ekstraheres det samlede DNA fra alle mikroorganismer fra fækale prøver. Inden de sekventeres, klippes de samlede DNA-prøver tilfældigt ved hjælp af en "shotgun"-tilgang. De omfattende sekvenser analyseres derefter for at opnå enten artsprofiler baseret på fylogenetiske markører (16S rDNA) (Sunagawa et al., 2010) eller genomiske profiler baseret på hele genomer (Tringe et al., 2005). Metagenomics spiller en rolle i forståelsen af ​​det menneskelige tarmmikrobiom, herunder mangfoldigheden af ​​tarmmikrobiomet, identifikation af nye gener og bestemmelse af ætiologien af ​​funktionel dysbiose (Wang et al., 2015). Baseline sammensætning af tarmmikrobiota (metagenomisk analyse) og Bifidobacterium kolonisering (relativ overflod) ved metagenomisk analyse under/efter tilskud vil blive udført.

qPCR: Real-time PCR vil blive udført til kvantitativ påvisning af organisme i DNA direkte ekstraheret fra afføringsprøve. B. infantis kolonisering med qPCR under og efter tilskud (med og uden præbiotika) vil blive udført.

Cytokiner:

Ethvert cytokin, der produceres lokalt som følge af tarmbetændelse, kan lække ind i tarmlumen og dukke op i afføringen. Stort inflammatorisk infiltrat i den syge slimhinde i tarmen forårsager forhøjede cytokiner i afføringen. Vi vil lave cytokinanalyser for at opdage tarmbetændelse. Vi vil måle i afføringsprøver Interleukin-10 (IL-10), Transforming Growth Factor-β (TGF-β), Interleukin-2 (IL-2), Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α), Interleukin-17 ( IL-17), Interleukin-22 (IL-22), Interleukin-8 (IL-8), Interleukin-6 (IL-6), Interferon Gamma-induceret protein 10 (IP-10).

ELISA'er for sCD83, sTLR2:

En opløselig form af CD83 frigives fra aktiverede dendritiske celler og B-lymfocytter og kan påvises i normale humane sera (Hock et al., 2001). Toll-lignende receptorer (TLR'er) er en klasse af mønstergenkendelsesreceptorer (PRR'er), der spiller en nøglerolle i medfødt immunitet og udløser et specifikt immunrespons. sTLR2 er blevet påvist i humane væsker, såsom plasma, modermælk, spyt og fostervand samt i supernatant af dyrkede monocytter (LeBouder et al., 2003; Kuroishi et al., 2007; Dulay et al., 2009). vil isolere sCD83 og sTLR2 fra afføringsprøver fra underernærede spædbørn.

Fækalt lipocalin 2:

Dette glycoprotein udtrykkes i flere celler og er blevet forbundet med primære og sekundære granula af humane neutrofiler (Roudkenar et al., 2007). Opregulering af Lcn-2 observeres ved vævsskadelige tilstande såsom infektion, nyreskade, cancer, colitis ulcerosa og forbrændingsskader, hvor der opstår produktion af frie radikaler (Chassaing et al., 2012). Lipocalin-2 korrelerer mindre tæt med neutrofile markører, det kan give en komplementær markør for epitelcelleafbrydelse eller beskadigelse (Prata et al., 2016). Vi vil lave testen for både underernærede og velernærede spædbørn for at opdage enterocytskader.

Modermælksmikrobiota og HMO-analyse:

Der er flere undersøgelser, hvor modermælksanalyse (Williams et al., 2017) og bakteriefællesskab i modermælk (Hunt et al., 2011) blev vurderet. I denne undersøgelse vil mikrobiotaanalyse blive udført med 16S rDNA-sekvensanalyse. HMO-måling vil blive udført for at kende LnNT-niveauet.

Databehandlingsprocedure:

• Spørgeskemaer vil blive visuelt scannet kort efter interviewet og markeret for udeladelser, uoverensstemmelser eller fejl, som vil blive rettet med det samme
• SPSS vil blive brugt, og data vil blive indtastet efter oprettelse af en skabelon for hver dataindtastningsfil med passende logiske og konsistenstjek
• Data vil løbende blive indtastet, efterhånden som dataene genereres på hospital og laboratorium
• Data vil blive valideret ved en række logiske kontroller og rækkeviddetjek, der producerer opsummerende statistikker og tabeller
• Derudover vil 50 % CRF (og alle variabler) blive kontrolleret af investigator(er).
• Data vil straks blive kopieret til harddiskene på to computere, så snart dataverifikationen er afsluttet.

Prøvestørrelsesberegning og udfald (primære og sekundære) variable(r):

Til pilotstudiet vil vi indskrive 18 SAM-spædbørn pr. behandlingsarm og yderligere 18 ikke-underernærede børn, således i alt 72 spædbørn.

Dataanalyse Data vil blive indtastet i de præ-testede Clinical Record Forms (CRF'er) ved hjælp af SPSS (20.0 version, Armonk, NY) og til sidst renset med gentagen kontrol. For at kende resultatet af præbiotisk og probiotisk tilskud hos vores undersøgelsesbørn for normalfordelte data vil vi udføre ANOVA, og i tilfælde af ikke-normal fordeling af målinger vil tilsvarende ikke-parametriske test som Kruskal-Wallis H test blive brugt og passende post hoc test vil blive udført for undergruppeanalysen, hvis det kræves. En sandsynlighed på mindre end 0,05 vil blive betragtet som statistisk signifikant, og associationsstyrken vil blive bestemt ved at beregne odds ratio (OR) og 95 % konfidensintervaller (CI). Hvis et dødsfald indtræffer, vil vi udføre verbal obduktion og evaluere de tilknyttede dødsfaktorer ved den samme analytiske plan.

Datasikkerhedsovervågningsplan (DSMP) Datasikkerhedsovervågning vil blive udført strengt i løbet af undersøgelsen. Alle formularer vil blive gennemgået af undersøgelseslæge efter tilmelding og dataindsamling efterfulgt af supervisor for fuldstændighed, læsbarhed og intern konsistens. Administration af præbiotika og probiotika på hospitalet vil ske i nærværelse af undersøgelseslægen. Alle aspekter af prøvetiltrædelse, behandling og fortolkning vil også blive udført i henhold til SOP'er.

Collaborative Arrangements icddr,b vil udføre undersøgelsen i samarbejde med Evolve BioSystems, Inc. USA, en privat virksomhed etableret i Californien af ​​internationalt anerkendte akademikere, der forsker i spædbørns tarmmikrobiom og dets kritiske forbindelse med human modermælk.