Prebiootti- ja probioottikokeen pilotti nuorilla vauvoilla, joilla on vakava akuutti aliravitsemus

Erityistavoitteet:

Arvioida mikrobiomivastetta probioottien lisäravinnoksi (prebioottien kanssa ja ilman) alle 6 kuukauden ikäisillä vauvoilla, joilla on vakava akuutti aliravitsemus, ja verrata mikrobiomivastetta terveisiin probiootilla täydennettyihin imeväisiin.

Tutkimuspaikka: Tutkimus suoritetaan kansainvälisen ripulitautien tutkimuskeskuksen Dhakan sairaalassa, Bangladeshissa (icddr,b). Laitoksella on hyvin varusteltu kliininen hoito sekä laboratoriotilat, joissa voidaan suorittaa kaikki kliiniset testit.

Tutkimuspopulaatio:

Ryhmä 1 (SAM) Ryhmä 2 (ei aliravittu)

Interventio:

Bifidobacterium longum subsp. infantis (EVC001) prebioottisen lisäravinteen kanssa ja ilman sitä 28 päivän ajan tarjotaan tutkimuksessa.

Kehitysmaissa on useita tutkimuksia, joissa prebioottia ja probioottia on käytetty vakavassa akuutissa aliravitsemuksessa ja riskiryhmään kuuluvien vauvojen keskuudessa. Bifidobacterium longum subsp. infantis (EVC001) käy ilmi julkaistusta kirjallisuudesta sekä turvallisuusraporteista (Smilowitz ym., 2017; Sheridan et al., 2017; Grenov et al., 2017; Panigrahi er al., 2017; Kerac et al., 2009) . IMPRINT Study, vaiheen I kliininen tutkimus, määritti rintaruokittujen imeväisten B. infantis (EVC001) -lisäyksen turvallisuuden ja siedettävyyden (Smilowitz et al., 2017). Prebiootin (LNnT) turvallisuuden arvioi EFSA:n (European Food Safety Authority) ruokavaliovalmisteita, ravintoa ja allergioita käsittelevä paneeli (NDA) ja päätteli, että LNnT on turvallinen imeväisille. Kansainvälinen probioottien ja prebioottien tieteellinen liitto (ISAAPP) suositteli, että houkutteleva kohde kliinisille interventioille johtaa uusiin lähestymistapoihin aliravitsemuksen torjumiseksi (Sheridan et al., 2017). Ugandassa tehdyssä tutkimuksessa, jossa käytettiin probioottia sairaalassa olevilla SAM-lapsilla, paljastui, että probiootilla voi olla merkitystä avohoitovaiheessa olevien SAM-potilaiden sairaalahoidossa, koska se osoitti ripulin keston merkittävää lyhenemistä (Grenov et al., 2017). Intian maaseudulla havaittiin merkittävää vähentymistä viljelypositiivisessa ja -negatiivisessa sepsiksessä ja alempien hengitysteiden infektioissa vauvoilla symbioottisten lääkkeiden käytön yhteydessä (Kerac et al., 2009). PRONUT-tutkimus ei osoittanut yhtään probioottiperäistä bakteremiatapausta. Mikrobiootan vaste probiooteille voi vaihdella ruokavalion tai maantieteellisen sijainnin mukaan.

Kokeiluaseet:

3 hoitovartta vauvoille, joilla on SAM:

• Plasebo (laktoosi)
• B. infantis yksin (Bif)
• B. infantis + prebiootti Lakto-N-neotetraoosi [LNnT] (Bif+prebiootti) Kukin käsi saa normaalin hoitoruokavalion (F-75 SAM:n akuutin vaiheen hoidon aikana, F-100 sairaalahoidon aikana kuntoutus ja standardoitu äidinmaidonkorvike kotiutuksen yhteydessä). Hoidon jakamista varten satunnaistaminen tehdään suhteessa 1:1 käyttämällä iän mukaista ositusta (2-3,9 kuukautta vs. 4-6 kuukautta), jotta varmistetaan imeväisten tasapuolinen osallistuminen ikäryhmittäin. Jakaminen suoritetaan käyttämällä satunnaisia ​​permutoituja lohkoja, joiden koko on 3. Yhteensä 54 osallistujaa otetaan mukaan ja 18 vauvaa (9+9) jaetaan kuhunkin hoitoryhmään.

Prebioottia käytetään LNnT:n muodossa (lakto-N-neotetraoosi, jota tuotetaan fermentoimalla ja joka on kemiallisesti identtinen ihmisen rintamaidossa olevan LNnT:n kanssa. LNnT sisältää erityisen sidoksen, jonka B. infantis voi hajottaa, kun taas muut bakteerit eivät. In vitro -määrityksessä, kun kasvualusta sisältää 50 % tai enemmän LNnT:tä, B. infantis -bakteerin kasvua tuetaan, mutta Bacteroidesin ja E. colin kasvua estetään. Tämän rakenteen kuluttamiseen tarvittavien glykosyylihydrolaasien jakautuminen on harvinaista proteobakteereiden (mukaan lukien kampylobakteerien) joukossa kokonaisuudessaan, ja se puuttuu Bacteroides-bakteerien joukosta, joten LNnT:n ei pitäisi edistää ristiinsyöttämistä edes ilman B. infantis -siirrettä.

Aliravittumattomien lasten valinnan tavoitteena on selvittää, palautuuko SAM-vauvojen häiriintynyt mikrobiota korkeammalle B. infantis -tasolle, joka on samanlainen kuin terveillä rintaruokituilla, joilla on akuutti sairaus ja joita hoidetaan antibiootilla.

Otoskoko:

Pilotissa meillä on 18 vauvaa hoitohaarassa, yhteensä 54 SAM-vauvaa. Otamme myös 18 ei-aliravittua vauvaa avoimeen B. infantis -hoitoon. Tämän pilotin tutkimuspopulaatiossa on yhteensä 72 vauvaa.

Vaikka tutkimuksen osallistujat putoaisivat tai saisivat sairaalassa saadun infektion tai heikkenevät, meidän on suoritettava 18 arvioitavaa tapausta kussakin käsivarressa.

Perustietojen keruumenettely: Tutkimuslääkäri seuloa kaikki SAM- ja ei-SAM-lapset määritellyissä ikäryhmissä tutkimukseen kelpoisuuskriteerien osalta. Kelpoisuusvaatimukset täyttävien vanhempia/hoitajia pyydetään antamaan suostumuksensa lastensa ottamiseen mukaan tutkimukseen. Allekirjoitettuaan kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen, annettuaan tiedot tutkimuksesta ja sen interventioista, selitettyään mahdolliset edut ja riskit, osallistumisen vapaaehtoisuus sekä oikeus vetää lapsi pois milloin tahansa alkuperäisen suostumuksen jälkeen ilman syytä, lapset tutkimuslääkärin ilmoittama. Clinical Record Form -lomaketta käytetään keräämään asiaankuuluvia tietoja, kuten sairaushistoriaa, mukaan lukien sairauden luonne ja kesto, lääkitys nykyiseen sairauteen; sosio-demografiset ominaisuudet, kuten ikä, sukupuoli, uskonto, vanhempien ikä ja koulutus, vanhempien ammatti, polttoaineen käyttö ja tupakointihistoria, perheen kuukausitulot, sisarusten määrä jne. Tietoja kerättäisiin myös lasten ruokintakäytännöistä, kuten rintaruokintahistoriasta, korvikkeesta tai muusta täydentävästä ruokinnasta ja immunisaatiosta; suvussa tuberkuloosi, perheenjäsenten äskettäinen hengitystieinfektio ja lapsen aiempi sairaushistoria kirjataan.

Pitkän aikavälin seurantaa varten käytetään erillistä CRF:ää keräämään tietoja painosta, pituudesta, MUAC:sta, ruokinnasta ja rinnakkaissairauksista. Kenttätutkimusassistentit vierailevat ilmoittautuneiden kodeissa ja keräävät tarvittavat tiedot saatuaan kirjallisen suostumuksen vanhemmilta tai huoltajilta.

Hallinto:

Ryhmä 1 (lapset, joilla on SAM): Tukikelpoisia SAM-vauvoja hoidetaan stabilointivaihetta varten Dhakan sairaalan pidempiaikaisessa osastossa icddr,b. Noudatetaan standardoitua hoitoprotokollaa lapsille, joilla on SAM ja ripuli (kehitetty icddr,b:ssä ja mukautettu WHO:n ohjeisiin; Ahmed et al Lancet 1999). Keskeisiä elementtejä ovat aluksi 2 tunnin ruokinta F-75:llä (suositeltu aloitusvalmiste, 130 ml/kg päivässä), foolihappo, A-vitamiini, ampisilliini ja gentamysiini, lämpötilan ja verensokerin seuranta ja valvonta. Ennen antibioottien aloittamista otetaan ulostenäytteet (tarvittaessa ulostekatetrin avulla).

Stabilointivaihe kestää kokemuksemme mukaan keskimäärin 4 päivää. Stabilointivaiheen päättymiseen on tyypillistä tyydyttävä ruokahalu, nenä-mahaletkuruokinnan tarve, hyvä yleinen kliininen tila, ripulin puuttuminen, kuivuminen, kuume, hypotermia tai takypnea.

Vauvat, jotka ovat vakiintuneet, siirretään NRU:lle hoitajan kirjallisen suostumuksen saatuaan. Stabiloidut lapset satunnaistetaan kolmeen hoitoryhmään, kun he ovat saaneet päätökseen 5–7 päivän antibioottikuurin. Sairaalan vanhempi ravitsemusterapeutti valmistaa ruokavalion (F-100) ja toimittaa sen NRU:lle. F-100:aa annostellaan 130 ml/kg päivässä 2 tunnin välein ensimmäisten 2 päivän ajan ja sen jälkeen 3 tunnin välein ja lisätään vähitellen 10 ml:lla jokaisella annoksella, kunnes rehua on jäljellä. Imetystä kannustetaan imetysten välillä. Nautitun äidinmaidon määrä arvioidaan imeväisten koepunnituksella.

Omaishoitajat koulutetaan tarjoamaan psykososiaalista stimulaatiota vauvoille, mikä tapahtuu rutiininomaisesti NRU:ssa. Tämä tapahtuu puhumalla tai laulamalla vauvoille, ikäkohtaista fyysistä aktiivisuutta ja leikkiä paikallisilla leluilla.

Rintamaidon saannin mittaaminen punnituskokeella noudattamalla julkaistua standardimenetelmää (Islam et al., 2006):

Rintamaidon keräys:

Koska tässä tutkimuksessa tutkitaan Bifidobacteria -bakteerien istuttamista, joka liittyy HMO:iden saatavuuteen rintamaidossa, keräämme 10 ml rintamaitoa aseptisissa olosuhteissa ja analysoimme HMO-pitoisuuden.

Tämä analyysi suoritetaan laboratorioissa, joilla on kokemusta näiden määritysten suorittamisesta.

Lisäksi teemme kerätyille rintamaitonäytteille myös mikrobiotaanalyysin. Tämä johtuu siitä, että rintamaidon mikrobiota vaikuttaa todennäköisesti muiden organismien kolonisaatioon ja vauvan suolistomatkaan.

Äidinmaito kerätään rinnasta klo 07.00 - 11.00, ja naisia ​​pyydetään olemaan syöttämättä tai lypsyttämättä tutkimusrintaa vähintään 2 tuntia ennen näytteenottoa. Ennen näytteenottoa rinta puhdistetaan jodipuikolla. Täydellinen rintojen ilmentyminen kerätään käyttämällä kertakäyttöistä, steriiliä keräyssarjaa (Hygienikit®; Ameda, Cary, IL, USA) ja sähköistä rintapumppua (malli SMR-B-R; Ameda-Egnell, Inc.). Maito laitetaan heti jäälle.

Bif (8 miljardia CFU/päivä kerta-annos-), Bif (8 miljardia CFU/päivä kerta-annos-) + prebiootti (1gm/6tunti-4gm/vrk) ja lumelääke (laktoosi 625mg) ovat saatavilla jauhemuodossa pusseissa. ruokintasarjoissa, jotka on merkitty yksilöllisillä koodinumeroilla, jotka vastaavat kunkin lapsen satunnaiskoodia. Pussin sisältö annetaan lapselle kerran päivässä Bif- ja plasebopusseihin sekoitettuna 5 ml:n äidinmaidonkorvikkeeseen tai rintamaitoon, ja jokainen 200 ml:n F-100 valmiste liuotetaan yksi prebiootti (LNnT) -pussi. Omaishoitajat, mutta ei tutkimushenkilöstö, sokeutuvat hoitomääräyksiin.

LNnT:n annos ja annostelu määräytyvät viime kädessä viimeaikaisen kirjallisuuden tarkastelun sekä tällä alalla työskentelevien asiantuntijoiden kokemusten perusteella. Tavoitteena on stimuloida mahdollisimman paljon luonnollisia olosuhteita HMO:iden saatavuudelle äidinmaidossa.

Satunnaistetuille vauvoille osoitetut ruokintapakkaukset (pussit) säilytetään jääkaapissa tai säilytetään pakastettuina, kunnes osallistuja on sairaalahoidossa. Syöttöpakkaukset, joita ei ole vielä osoitettu vauvalle, säilytetään sairaalan pakastimessa, jossa lämpötilaa valvotaan jatkuvasti. Pakastimessa (-20°C ± 5°C) säilytetty probiootti on käyttökelpoinen pussiin painettuun viimeiseen käyttöpäivään asti (1 vuosi pakkauspäivästä). Sitä voidaan säilyttää jääkaapissa 31 päivää (4°C ± 5°C). Prebiootti (LNnT) on stabiili huoneenlämmössä, mutta sitä voidaan säilyttää jääkaapissa tai pakastimessa probiootin kanssa.

Ryhmä 2 (ei-aliravitut lapset): Tukikelpoisia ei-aliravittuja imeväisiä käsitellään sairaalan protokollan mukaisesti. Lyhyesti sanottuna heidät otetaan pidemmän oleskelun osastolle tai tarvittaessa teho-osastolle. Sairaalalla on määritelty hoitoprotokollat ​​akuutin vetisen ripulin, keuhkokuumeen ja vaikean keuhkokuumeen, jatkuvan ripulin, vaikean sepsiksen, elektrolyyttihäiriöiden ja sairaalainfektioiden hoitoon. Lapsia hoidetaan sairaalassa näiden protokollien mukaisesti. Vain rintaruokitut lapset jatkavat äidinmaidon syöntiä. Toisia täydennetään muunnetulla äidinmaidonkorvikkeella 2-3 tunnin välein. Nautitun äidinmaidon määrä arvioidaan imeväisten koepunnituksella. Bif-hoito aloitetaan antibioottikuurin päättymispäivänä ja se annetaan imeväisille samalla tavalla kuin ryhmä 1. Pussin sisältö sekoitetaan teelusikalliseen äidinmaidonkorviketta tai rintamaitoa ja syötetään lapselle.

Vaikka tutkimuksen osallistujat putoaisivat tai saisivat sairaalassa saadun infektion tai heikkenevät, meidän on suoritettava 18 arvioitavaa tapausta kussakin käsivarressa.

Päästää sairaalasta:

Kotiuttaminen suoritetaan, jos vauva, jolla on SAM, on saavuttanut painon/pituuden > -3, jos mahdollista ≥ -2 Z-pisteen, ja turvotuksen aliravitsemuksen tapauksessa, kun turvotus häviää ja kun vauva kukoistaa ja kliinisesti voi hyvin. Aliravittumattomat imeväiset kotiutetaan, kun he täyttävät sairaalasta lähtökriteerit. Siihen mennessä omaishoitajat on koulutettu ruoan ja lisäravinteiden valmistukseen ja antamiseen.

Seuranta:

Tutkimusavustajat seuraavat vauvoja, joilla on SAM, kotikäynneillä kahdesti viikossa 8 viikkoa satunnaistamisen jälkeen. Ei-aliravittuja vauvoja seurataan kotikäynneillä kahdesti viikossa, kunnes täydennys on suoritettu, ja sitten kerran viikossa kuuden viikon ajan satunnaistamisen jälkeen. Tällaisten käyntien aikana äidinmaidonkorvikkeen (SAM-vauvoille) ja ravintolisien (molemmat ryhmät) annoksia täydennetään, ruokavalion todellista saantia tarkkaillaan tai annettu määrä ja liuottamistapa tarkistetaan ja sairastuvuus kirjataan räätälöityyn tapaukseen. tietuelomake. Koska B. infantis -lisä on pidettävä viileässä optimaalisen elinkelpoisuuden ylläpitämiseksi, tutkimusavustajat tuovat lisäravinteen kotikäynteihin eristettyissä laatikoissa tai jäähdyttimissä, joissa on jäätä tai pakastegeelipakkauksia. Vaikka ravintolisä todennäköisesti lämpenee huoneenlämpötilaan käyntien välillä, ei odoteta, että elinkelpoisuuden menetys vaikuttaa merkittävästi B. infantis -bakteerin kolonisaatioon suolistossa. Jokaiselle osallistujalle tarjotaan minijääkaappi opintojakson ajaksi ja jokaista vanhempaa ohjeistetaan säilyttämään lisäosa näissä astioissa käyttöön asti.

Vauvat, jotka eivät ole vielä saavuttaneet paino-pituusarvoa ≥ -1 Z-pisteitä 8 viikkoon satunnaistamisen jälkeen (kotikäyntien lopussa), voivat jatkaa vauvan viemistä icddr,b:lle punnitsemista ja mittaamista varten sekä annoksen ottamista rutiininomaisesti, kunnes saavutetaan paino-pituus ≥ -1 Z.

Pitkän aikavälin seuranta suoritetaan ilmoittautuneiden osallistujien antropometrian arvioimiseksi.

Näytekokoelma:

Ulostenäytteet kerätään seuraavasti.

• Ulostenäytteet (mikrobiomianalyysiä varten) (13 kertaa SAM:ssa, 11 kertaa ei-SAM:ssa)

  • Vastaanoton yhteydessä ennen antibioottihoitoa
  • Stabiloinnin jälkeen, ennen satunnaistamista ja täydentämistä
  • Täydennyspäivä 2
  • Lisäyksen päivä 4
  • Täydennyspäivä 7
  • 10. täydennyspäivä (tai viimeinen päivä NRU:ssa, jos kotiutetaan aikaisemmin)
  • 14. täydennyspäivä (NRU:ssa tai tutkimusavustajan noutaa kotikäynnillä)
  • Täydennyspäivä 21 (tutkija-avustaja kotikäynnillä)
  • 28. täydennyspäivä (tutkija-avustaja noutaa kotikäynnillä)
  • 1 viikko täydennyksen jälkeen (tutkija-assistentti hakee kotikäynnillä)
  • 2 viikkoa täydennyksen jälkeen (tutkija-avustaja noutaa kotikäynnillä)
  • 3 viikkoa täydennyksen jälkeen (tutkija-avustaja kotikäynnillä): vain SAM
  • 4 viikkoa täydennyksen jälkeen (tutkija-avustaja kotikäynnillä): vain SAM

• Ulostepalat tai katetrin ulostenäytteet (pH- ja tulehdusmerkkiaineet) sairaalassa [vain SAM-lapset]:

  • Vastaanoton yhteydessä ennen antibioottihoitoa
  • Stabiloinnin jälkeen, ennen satunnaistamista ja täydentämistä
  • 7. täydennyspäivä"
  • 10. täydennyspäivä (tai viimeinen päivä NRU:ssa, jos kotiutetaan aikaisemmin)
  • 28. täydennyspäivä (tutkija-assistentin kerää kotikäynnillä)
  • 4 viikkoa täydennyksen jälkeen (kotikäynnillä tutkimusassistentti kerää)

• Ulostepalat tai katetrin ulostenäytteet (pH- ja tulehdusmerkkiaineet) sairaalassa [vain ei-aliravitut lapset]:

  • Vastaanoton yhteydessä ennen antibioottihoitoa
  • Lisähoidon aloittamisen jälkeen sairaalasta kotiutettuna
  • 28. täydennyspäivä (tutkija-assistentin kerää kotikäynnillä)
  • 2 viikkoa täydennyksen jälkeen (kotikäynnillä tutkimusassistentti kerää)

Ulostenäytteen otto sairaalassa:

Kaikki lapset seulotaan Dhakan sairaalasta, icddr,b:stä edellä mainittujen mukaanotto- ja poissulkemiskriteerien mukaisesti. Tutkimushenkilöstö seuloo nämä lapset ennen antibiootin antamista. Ennen ulostenäytteiden ottoa tulee laillisen huoltajan kirjallinen suostumus.

Uloste tulee kerätä juuri jokaiselta lapselta. Näytteet on jaettava välittömästi esileimatuihin 2 ml:n kryovialeihin ja lähettäjälle (~-70 ⁰C) mahdollisimman nopeasti keräämisen jälkeen, mieluiten alle 15 minuutin kuluttua keräämisestä. Keräyksen jälkeen ja ennen erien jakamista ulosteiden keräysastia tulee pitää (märällä) jäällä. Ihannetapauksessa kryoviaalit olisivat täytetty noin 2/3 täyteen. Kaksi kertaa viikossa nämä kylmäsäilytetyt näytteet kuljetetaan bioturvallisuustason laboratorioon icddr,b Dhakan sairaalaan säilytettäväksi -80 ⁰C pakastimessa. Sulamisen estämiseksi injektiopullot siirretään lähettäjältä -80⁰ pakastimeen mahdollisimman nopeasti samalla kun ne siirretään pakastelaatikoihin. Näitä pakastelaatikoita ei poisteta -80⁰ pakastimesta ennen kuin ne on luovutettu World Courierille lähetettäväksi Yhdysvaltoihin.

Toimenpiteet bakteerien parhaan mahdollisen talteenoton ja niiden elinkelpoisuuden varmistamiseksi:

1. Lähettäjien tulee olla täynnä ennen noutopäivää, ja niiden avaamiskertojen määrästä pidetään kirjaa.
2. Lähettäjät tarvitsevat noin 12 tuntia nestemäisen typen lisäämisen jälkeen latautuakseen täyteen. Siksi lataamme (täytämme) lähettäjät uudelleen jokaisen päivän lopussa ja kaadamme jäljelle jääneen imeytymättömän nestetypen pois seuraavana aamuna ennen niiden käyttöä.
3. Lähettäjät punnitaan ennen lataamista, latauksen jälkeen (eli seuraavana aamuna imeytymättömän N2:n poistamisen jälkeen) ja sitten uudelleen jokaisen päivän lopussa, jotta tiedetään, kuinka paljon nestemäistä typpeä on jäljellä säiliössä. Tämän avulla voimme arvioida, kuinka paljon nestemäistä N2:ta tarvitaan joka kerta, kun lataamme ja kuinka usein sitä tarvitaan.

Vanupuikkojen kerääminen ulosteesta sairaalassa ja yhteisöstä:

Ulostenäytteet otetaan aikataulun mukaisesti. Kun osallistujat on poistettu NRU:sta, ulostepuikko kerätään kahden päivän kuluessa aikataulun mukaisesta ajasta.

Ulosteiden keräämisestä tiedotetaan lapsen/osallistujan ensisijaiselle huoltajalle päivää ennen suunniteltua ulosteiden keräämistä. Koulutettu tutkimushenkilöstö ottaa ensimmäisen saatavilla olevan tuoreen ulostenäytteen lapselta suunnitellun näytteenottopäivänä.

Sairaalassa ja yhteisössä tapahtuvan keräyksen aikana tutkimushenkilöstö saa käyttöönsä merkityt ulostepuikkoputket (sisältävät stabilointipuskuria), yksittäin käärittyjä vanupuikkoja (murtopisteellä), kryogeeninen merkkiaine ja muovipussit.

Sairaalassa äitejä/hoitajia ohjeistetaan ilmoittamaan tutkimushenkilökunnalle heti, kun lapsi ulostaa. Sitten tutkimushenkilöstö tekee seuraavaa:

• Pyyhkäise vauvan likainen vaippa ja ota tarpeeksi ulostenäytettä, jotta puikkopää peittyy kokonaan.
• Aseta vanupuikko asianmukaisesti merkittyyn vihreäpäälliseen keräysputkeen ja napsauta vanupuikko irti katkeamiskohdasta – vanupuikko jää putkeen.
• Sulje putki tiiviisti ja ravista voimakkaasti varmistaaksesi, että uloste jakautuu stabilointipuskurissa.
• Mukana toimitetun kryogeenisen markkerin avulla (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4000221), kirjoita putken etikettiin päivämäärä, jolloin uloste kerättiin.
• Toista pyyhkäisy toisella puhtaalla vanupuikolla ja kaksoisputkella, jonka päällä on vihreä.
• Aseta vihreäpäälliset putket takaisin mukana toimitettuihin muovipusseihin ja säilytä huoneenlämmössä, kunnes terveydenhuollon työntekijä noutaa ne.

Jokaiselta osallistujalta kerätään tiedot antibioottien saannista tutkimuksen aikana. Jokaisen näytteenoton yhteydessä kysymme äidiltä tai muulta omaishoitajalta mahdolliset sairaudet viimeisen 14 päivän aikana ja onko hoitoa hoidettu. Lääkkeen luonne varmistetaan lääkkeen fyysisellä tarkastuksella, reseptillä ja kysymällä nimeä tai oliko lääke jauhe, joka oli saatettava käyttökuntoon.

Sylkinäytteen keräys äidiltä:

Teemme äitien syljessä "Secretor Status -fenotyping -määrityksen" nähdäksemme äitien erittäjätilan havaitaksemme HMO-tilan sekä yhteyden pikkulasten mikrobiotaan.

Sylkinäytteenottomenettely

1. Äitien tulee pestä kädet ja huuhdella suu kylmällä vedellä ja sylkeä vesi kokonaan ulos.
2. Ne poistavat näytteenottimen varoen koskettamasta vain kahvaa.
3. Äiti pitää kädensijasta Oracle-näytteenottoputkea hammasharjana ja työntyy suuhunsa ja hieroi sienellä ikeniä vasten minuutin ajan. Varmista, että sieni on täysin kyllästynyt.
4. koskematta sieneen, he työntävät näytteenottimen alkuperäiseen Oracol-putkeen, sienellä alaspäin ja sulkevat kannen tiukasti.
5. Äiti antaa Oracle-näytteenottoputken takaisin tutkimushenkilökunnalle (joka merkitsee ja jäähdyttää putket, jos näytteitä ei käsitellä samana päivänä).

Ulostenäytteiden kerääminen ja kuljetus yhteisöstä Jokainen koulutettu paikkakunnan terveydenhuollon työntekijä on vastuussa tietyn määrän ulostekeräyksiä kuukaudessa. Hän ottaa yhteyttä äitiin matkapuhelimella ja saapuu lapsen kotiin aikaisin aamulla typpikuljettajan kanssa ja kerää ulostepuikko.

Ulostenäytteiden ensimmäinen keräys on tehtävä sopivaan steriiliin astiaan, minkä jälkeen kenttätyöntekijän on siirrettävä pienemmät erät ulostemateriaalia (20 minuutin kuluessa ulosteesta) esimerkittyihin, steriileihin 2 ml:n kryosuojallisiin putkiin. Putkien etiketeissä tulee olla vähintään osallistujan näytetunnus (SID) ja keräyspäivämäärä.

Terveydenhuollon työntekijät käyttävät puhtaita, kertakäyttöisiä lateksikäsineitä ja täyttävät jokaisen 2 ml:n kryopullon noin puolesta kahteen kolmasosaan käyttämällä steriiliä lastaa ja korkkia tiukasti. Mitään puskureita, säilöntäaineita tai lisäaineita ei lisätä näytteeseen. Varovaisuutta on noudatettava käytettäessä kierrekorkisia injektiopulloja eikä niitä saa täyttää liikaa, koska tämä minimoi näytteiden ristikontaminaation mahdollisuuden kuljetuksen ja varastoinnin aikana.

Sitten he laittavat korkittuneet injektiopullot nestemäisellä typellä esitäytettyihin "kuivakuljettajiin" välittömästi kuljetettavaksi takaisin laboratorioon. Vaikka näytteet on vaikeaa, ne on siirrettävä kuiville kuljettajille 20 minuutin kuluessa ulostamisen jälkeen. Laboratoriossa koulutettu henkilökunta tyhjentää pullot kuivalähettimestä kuivajääämpäriin estääkseen sulamisen lajittelun aikana ja siirtää pullot 9x9 pakastelaatikoihin pidempään säilytystä ja kuljetusta varten.

Raportointi:

Tiedot kirjataan ulostekeräyslomakkeelle (SFC).

Tutkimukset:

icddrb:llä suoritetut testit:

• ulosteen pH:n määrittäminen sairaalalaboratoriossa
• Myeloperoksidaasin ja muiden biomarkkeritasojen testaus ulostenäytteistä

Evolve Biosystemsin tekemät testit:

• Seuraavan sukupolven sekvensointi, metagenomiikka ja näytteiden q PCR-analyysit
• Immuunijärjestelmään liittyvät testit - Tulehduksellisten ja immuunijärjestelmään liittyvien sytokiinien/analyyttien multipleksianalyysi
• IL-10, TGF beeta, IL-2, TNF-alfa, IL-17, IL-22, IL-8, IL-6, IP-10
• ELISA-testit sCD83:lle, sTLR2:lle ja ulosteen lipokaliinille 2

Jakkara PH:

Ulosteen pH mitataan, jotta voidaan arvioida ulosteen pH:n muutos lähtötasosta täydennyshoidon aikana.

Myeloperoksidaasi:

Myeloperoksidaasi on neutrofiilien aktiivisuuden spesifinen merkki. Se valittiin, koska se ei ole kohonnut rintamaidossa tai rintaruokittujen lasten ulosteissa, kuten laktoferriini ja kalprotektiini (Dorosko et al., 2008) ja ulosteen MPO-tasot on korreloitu sairauden aktiivisuuteen tulehduksellisessa suolistosairaudessa endoskooppisesti arvioituna. ja biokemialliset parametrit (SAIKI T, 1998). MAL-ED-tutkimus on jo osoittanut MPO:n roolin suoliston toiminnan markkerina (McCormick et al., 2017).

Mittaamme tämän biomarkkerin pitoisuuden kaupallisella ELISA:lla.

Seuraavan sukupolven sekvensointi: Viime vuosina on kehitetty useita seuraavan sukupolven sekvensointitekniikoita (Shendure & Ji, 2008), jotka mahdollistavat edelleen suuren määrän mikro-organismien analysoinnin eri ympäristöissä (Tringe et al., 2005) ja ihmiskehossa. paikoissa (Ding & Schloss, 2014, mukaan lukien ihmisen suolisto (Methé et al., 2012).

16S-rDNA-sekvenssianalyysi ja metagenomiikka ovat kaksi tehokasta DNA-sekvensointitekniikkaa, ja molempia on käytetty viljelemättömien suoliston mikrobiyhteisöjen tutkimiseen. 16S-rDNA-sekvenssianalyysi keskittyy kaikissa mikrobeissa esiintyvän konservoituneen 16S-rDNA-geenin sekvensointiin (Woese & Fox, 1977) ja on luonut sarjan uusia yhteyksiä suoliston mikrobiotan koostumuksen ja taudin välillä (Blaser et al., 2013). 16S rDNA -sekvenssiin perustuva tutkimus on tekniikka "kuka siellä on?" tietyssä mikrobiyhteisössä, kun taas haulikon metagenominen sekvensointi pystyy vastaamaan täydentävään kysymykseen "mitä he voivat tehdä?" (Lepage ym., 2012). Seuraavan sukupolven sekvensointi suoritetaan organismin, erityisesti B. infantisin, kiinnittymisen havaitsemiseksi vakavasti aliravittujen imeväisten hoidon jälkeen ja sitä verrataan hyvin ravittuihin lapsiin.

Metagenomiikka:

Handelsman ja Rodon kuvasivat metagenomiikkaa ensimmäisen kerran vuonna 1998 (Handelsman et al., 1998), ja siitä tuli toinen DNA-sekvensointimenetelmä monimutkaisen suoliston mikrobiyhteisön tutkimiseksi. Sen tavoitteena on luetteloida kaikki yhteisön geenit satunnaissekvensoimalla kaikki näytteestä erotettu DNA (Qin et al., 2010). Ensinnäkin kaikkien mikro-organismien kokonais-DNA uutetaan ulostenäytteistä. Ennen sekvensointia kokonais-DNA-näytteet leikataan satunnaisesti "haulikko"-lähestymistavalla. Kattavat sekvenssit analysoidaan sitten joko fylogeneettisiin markkereihin (16S rDNA) perustuvien lajiprofiilien saamiseksi (Sunagawa et al., 2010) tai kokonaisiin genomeihin perustuvien genomiprofiilien saamiseksi (Tringe et al., 2005). Metagenomiikalla on rooli ihmisen suoliston mikrobiomin ymmärtämisessä, mukaan lukien suoliston mikrobiomin monimuotoisuus, uusien geenien tunnistaminen ja funktionaalisen dysbioosin etiologian määrittäminen (Wang et al., 2015). Suoliston mikrobiotan peruskoostumus (metagenominen analyysi) ja bifidobakteerien kolonisaatio (suhteellinen runsaus) tehdään metagenomisella analyysillä täydennyksen aikana/jälkeen.

qPCR: Reaaliaikainen PCR tehdään organismin kvantitatiiviseen havaitsemiseen suoraan ulostenäytteestä uutetusta DNA:sta. B. infantis kolonisaatio qPCR:llä täydennyksen aikana ja sen jälkeen (prebioottien kanssa ja ilman) tehdään.

Sytokiinit:

Mikä tahansa sytokiini, joka muodostuu paikallisesti suoliston tulehduksen seurauksena, voi vuotaa suolen onteloon ja ilmaantua ulosteisiin. Suuri tulehduksellinen infiltraatti sairaassa suolen limakalvossa aiheuttaa kohonneita sytokiinien määrää ulosteessa. Teemme sytokiinimäärityksiä suoliston tulehduksen havaitsemiseksi. Mittaamme ulostenäytteistä Interleukiini-10 (IL-10), Transforming Growth Factor-β (TGF-β), Interleukiini-2 (IL-2), Tuumorinekroositekijä-α (TNF-α), Interleukiini-17 ( IL-17), interleukiini-22 (IL-22), interleukiini-8 (IL-8), interleukiini-6 (IL-6), interferonin gamma-indusoitu proteiini 10 (IP-10).

ELISA-testit sCD83:lle, sTLR2:lle:

CD83:n liukoinen muoto vapautuu aktivoiduista dendriittisoluista ja B-lymfosyyteistä, ja se on havaittavissa normaaleissa ihmisen seerumeissa (Hock et ai., 2001). Toll-like reseptorit (TLR) ovat mallintunnistusreseptorien (PRR) luokka, joilla on keskeinen rooli synnynnäisessä immuniteetissa ja jotka laukaisevat spesifisen immuunivasteen. sTLR2:ta on havaittu ihmisen nesteistä, kuten plasmasta, rintamaidosta, syljestä ja lapsivedestä sekä viljeltyjen monosyyttien supernatantista (LeBouder et al., 2003; Kuroishi et al., 2007; Dulay et al., 2009). eristää sCD83:n ja sTLR2:n aliravittujen vauvojen ulostenäytteistä.

Ulosteen lipokaliini 2:

Tämä glykoproteiini ekspressoituu useissa soluissa, ja se on yhdistetty ihmisen neutrofiilien primaarisiin ja sekundaarisiin rakeisiin (Roudkenar et al., 2007). Lcn-2:n lisääntymistä havaitaan kudosvaurioissa, kuten infektiossa, munuaisvauriossa, syövässä, haavaisessa paksusuolitulehduksessa ja palovammoissa, joissa tapahtuu vapaita radikaaleja (Chassaing et al., 2012). Lipokaliini-2 korreloi vähemmän tiukasti neutrofiilimarkkereiden kanssa, se voi tarjota täydentävän markkerin epiteelisolujen hajoamisesta tai vauriosta (Prata et al., 2016). Teemme testin sekä aliravituille että hyvin ravituille vauvoille enterosyyttivaurion havaitsemiseksi.

Äidinmaidon mikrobiota ja HMO-analyysi:

On olemassa useita tutkimuksia, joissa arvioitiin rintamaidon analyysiä (Williams et al., 2017) ja bakteeriyhteisöä äidinmaidossa (Hunt et al., 2011). Tässä tutkimuksessa mikrobiota-analyysi tehdään 16S-rDNA-sekvenssianalyysillä. HMO-mittaus tehdään LnNT-tason tuntemiseksi.

Tietojenkäsittelymenettely:

• Kyselylomakkeet skannataan visuaalisesti pian haastattelun jälkeen ja niihin merkitään puutteita, epäjohdonmukaisuuksia tai virheitä, jotka korjataan välittömästi
• SPSS:ää käytetään ja tiedot syötetään sen jälkeen, kun jokaiselle tiedonsyöttötiedostolle on luotu malli, jossa on asianmukaiset loogiset ja johdonmukaisuustarkistukset
• Tietoja syötetään jatkuvasti, kun tietoja tuotetaan sairaalassa ja laboratoriossa
• Tiedot validoidaan sarjalla loogisia ja vaihteluvälin tarkistuksia, jotka tuottavat yhteenvetotilastoja ja taulukoita
• Lisäksi tutkija(t) tarkastavat 50 % CRF:stä (ja kaikki muuttujat).
• Tiedot kopioidaan välittömästi kahden tietokoneen kiintolevylle heti, kun tietojen tarkistus on valmis.

Otoskoon laskenta ja tulos (ensisijainen ja toissijainen) muuttuja(t):

Pilottitutkimukseen otetaan mukaan 18 SAM-vauvaa hoitoryhmää kohden ja lisäksi 18 ei-aliravittua lasta, eli yhteensä 72 vauvaa.

Tietojen analysointi Tiedot syötetään esitestattuihin kliinisiin kirjauslomakkeisiin (CRF) käyttäen SPSS:ää (20.0 versio, Armonk, NY) ja lopuksi puhdistetaan toistuvalla tarkistuksella. Tietääksemme prebioottisten ja probioottisten lisäravinteiden tulokset tutkimuslapsillamme normaalisti jakautuneille tiedoille, teemme ANOVA-analyysin, ja jos mittausten jakauma ei ole normaali, käytetään vastaavia ei-parametrisia testejä, kuten Kruskal-Wallis H -testiä, ja asianmukaisia ​​post hoc -testejä. Testi tehdään tarvittaessa alaryhmäanalyysiä varten. Todennäköisyys, joka on pienempi kuin 0,05, katsotaan tilastollisesti merkitseväksi, ja assosiaatioiden vahvuus määritetään laskemalla todennäköisyyssuhde (OR) ja 95 %:n luottamusvälit (CI). Jos joku kuolee, teemme verbaalisen ruumiinavauksen ja arvioimme siihen liittyvät kuolemantekijät saman analyyttisen suunnitelman mukaan.

Tietoturvallisuuden seurantasuunnitelma (DSMP) Tietoturvallisuuden seurantaa suoritetaan tarkasti koko tutkimuksen ajan. Tutkimuslääkäri tarkistaa kaikki lomakkeet ilmoittautumisen ja tiedonkeruun jälkeen, minkä jälkeen ohjaaja tarkistaa niiden täydellisyyden, luettavuuden ja sisäisen johdonmukaisuuden. Prebiootin ja probiootin anto sairaalassa tapahtuu tutkimuslääkärin läsnä ollessa. Kaikki näytteiden liittämiseen, käsittelyyn ja tulkintaan liittyvät näkökohdat suoritetaan myös SOP-ohjeiden mukaisesti.

Collaborative Arrangements icddr,b suorittaa tutkimuksen yhteistyössä Evolve BioSystems, Inc. USA:n kanssa, joka on Kaliforniaan kansainvälisesti tunnettujen akateemioiden perustama yksityinen yritys, joka tutkii vauvan suoliston mikrobiomia ja sen kriittistä yhteyttä ihmisen rintamaitoon.