Súlyos, akut alultápláltságban szenvedő fiatal csecsemőkben végzett prebiotikum- és probiotikum-kísérlet kísérlete

Konkrét célok:

A probiotikum-kiegészítésre (prebiotikummal és anélkül) adott mikrobiomválasz értékelése súlyos akut alultápláltságban szenvedő 6 hónaposnál fiatalabb csecsemőknél, valamint a mikrobiomválasz összehasonlítása probiotikummal kiegészített egészséges csecsemőkével.

A vizsgálat helyszíne: A vizsgálatot a Banglades-i Hasmenéses Betegségkutató Nemzetközi Központ dakkai kórházában végzik (icddr,b). Az intézmény jól felszerelt klinikai ellátással, valamint minden klinikai vizsgálat elvégzésére alkalmas laboratóriumi berendezéssel rendelkezik.

Vizsgálati populáció:

1. csoport (SAM) 2. csoport (nem alultáplált)

Közbelépés:

Bifidobacterium longum subsp. infantis (EVC001) 28 napig tartó prebiotikum-kiegészítéssel és anélkül is biztosítják a vizsgálatban.

A fejlődő világban számos tanulmány létezik, amelyekben prebiotikumot és probiotikumot alkalmaztak súlyos akut alultápláltság esetén és a veszélyeztetett csecsemők körében. A Bifidobacterium longum subsp. infantis (EVC001) a publikált irodalomból és biztonsági jelentésekből is kitűnik (Smilowitz et al., 2017; Sheridan et al., 2017; Grenov et al., 2017; Panigrahi er al., 2017; Kerac et al., 2009). . Az I. fázisú klinikai vizsgálat, az IMPRINT Study meghatározta a szoptatott csecsemők B. infantis-szal (EVC001) történő kiegészítésének biztonságosságát és tolerálhatóságát (Smilowitz et al., 2017). A prebiotikum (LNnT) biztonságosságát az EFSA (Európai Élelmiszerbiztonsági Hatóság) Diétás Termékekkel, Táplálkozással és Allergiával (NDA) kapcsolatos élelmiszerekkel foglalkozó testülete értékelte, és a testület arra a következtetésre jutott, hogy az LNnT biztonságos a csecsemők számára. A Probiotikumok és Prebiotikumok Nemzetközi Tudományos Szövetsége (ISAAPP) azt javasolta, hogy a klinikai beavatkozások vonzó célpontja új megközelítésekhez vezessen az alultápláltság elleni küzdelemben (Sheridan és mtsai, 2017). Egy Ugandában végzett vizsgálat probiotikumot alkalmazva In hospitalized SAM gyermekeknél feltárta, hogy a probiotikumnak szerepe lehet a járóbeteg-fázisban lévő SAM-ban szenvedő kórházi gyermekek nyomon követésében, mivel jelentős mértékben csökkentette a hasmenés időtartamát (Grenov et al., 2017). A vidéki Indiában szignifikáns csökkenést figyeltek meg a tenyészet-pozitív és tenyészet-negatív szepszis és az alsó légúti fertőzések csecsemőknél szimbiotikus alkalmazása mellett (Kerac et al., 2009). A PRONUT vizsgálat egyetlen esetben sem mutatott ki probiotikumhoz kapcsolódó bakteémiát. A mikrobiota válasza a probiotikumokra étrendtől vagy földrajzi elhelyezkedéstől függően eltérő lehet.

Próbafegyverek:

3 kezelési kar SAM-ban szenvedő csecsemők számára:

• Placebo (laktóz)
• B. infantis egyedül (Bif)
• B. infantis + prebiotikus Lakto-N-neotetraóz [LNnT] (Bif+prebiotikum) Mindegyik karhoz hozzá kell rendelni a standard gondozási diétát (F-75 a SAM akut fázisú kezelése során, F-100 a kórházi tartózkodás alatt táplálkozási céllal) rehabilitáció és standardizált anyatej-helyettesítő tápszer a hazabocsátáskor). A kezelések kiosztásának véletlenszerűsítése 1:1 arányban történik, életkor szerinti rétegzéssel (2-3,9 hónap vs. 4-6 hónap), hogy biztosítsák a csecsemők korcsoportonkénti egyenlő részvételét. Az elosztás 3-as véletlenszerű permutált blokkok használatával történik. Összesen 54 résztvevőt vesznek fel, 18 csecsemővel (9+9) mindegyik kezelési karban.

A prebiotikumot LNnT (lakto-N-neotetraóz, fermentációval állítják elő, és kémiailag azonos az emberi anyatejben jelenlévő LNnT-vel) formájában fogják használni. Az LNnT egy specifikus kötést tartalmaz, amelyet a B. infantis képes lebontani, míg más baktériumok nem. Az in vitro vizsgálatban, amikor a táptalaj 50% vagy több LNnT-t tartalmaz, a B. infantis növekedése támogatott, de a Bacteroides és az E. coli növekedése gátolt. Az ennek a szerkezetnek a fogyasztásához szükséges glikozil-hidrolázok megoszlása ​​ritka a Proteobaktériumok (beleértve a Campylobacter) egészét, és hiányzik a Bacteroides között, ezért az LNnT nem járulhat hozzá a kereszteződéshez, még B. infantis beültetés hiányában sem.

A nem alultáplált gyermekek kiválasztásának célja, hogy megvizsgáljuk, hogy a SAM csecsemők károsodott mikrobiotája magasabb B. infantis szintre áll-e vissza, hasonlóan ahhoz, amit akut betegségben szenvedő, antibiotikummal kezelt egészséges anyatejjel táplált csecsemőknél tapasztaltunk.

Minta nagysága:

A kísérlet során kezelőkaronként 18 csecsemő, összesen 54 SAM csecsemő lesz. 18 nem alultáplált csecsemőt is beírunk a nyílt B. infantis kezelésre. Összesen 72 csecsemő lesz a kísérleti populáció.

Még akkor is, ha a vizsgálatban résztvevők elesnek vagy kifejlődnek a kórházban szerzett fertőzések vagy állapotuk állapota, mindegyik karon 18 értékelhető esetet kell teljesítenünk.

Kiindulási adatgyűjtési eljárás: A meghatározott korcsoportokba tartozó összes SAM és nem SAM gyermeket a vizsgálati alkalmassági kritériumok szempontjából a vizsgálati orvos megvizsgálja. A jogosultságot teljesítők szüleit/gondozóit, a felvételi és kizárási kritériumok alkalmazásában, felkérik, hogy adják meg hozzájárulásukat gyermekeik vizsgálatba való felvételéhez. Az írásos beleegyező nyilatkozat aláírásakor, a vizsgálatról és annak beavatkozásairól való tájékoztatást, a lehetséges előnyök és kockázatok ismertetését, a részvétel önkéntes jellegét, valamint a gyermeket a kezdeti hozzájárulást követően bármikor indoklás nélkül visszavonhatják. a vizsgálati orvos által felvett. A Clinic Record Form a releváns információk gyűjtésére szolgál, mint például a kórtörténet, beleértve a betegség jellegét és időtartamát, az aktuális betegség gyógyszeres kezelését; szocio-demográfiai jellemzők, mint például életkor, nem, vallás, szülői életkor és iskolai végzettség, szülők foglalkozása, üzemanyag-használat és dohányzás múltja, havi családi jövedelem, testvérek száma stb. Információkat gyűjtenek a gyermekek etetési gyakorlatáról is, például a szoptatás történetéről, a tápszerről vagy más kiegészítő táplálásról és az immunizálási állapotról; rögzítésre kerül a családi tuberkulózis, bármely családtag közelmúltbeli légúti fertőzése és a gyermek korábbi kórtörténete.

A hosszú távú nyomon követéshez külön CRF-et használnak a súlyra, magasságra, MUAC-ra, táplálkozásra és társbetegségekre vonatkozó információk gyűjtésére. A helyszíni kutatási asszisztensek meglátogatják a beiratkozottak házát, és összegyűjtik a szükséges információkat, miután megkapták a szülők vagy a gondozók írásos hozzájárulását.

Menedzsment:

1. csoport (SAM-ban szenvedő gyermekek): A jogosult SAM-csecsemőket a stabilizációs fázisban kezelik az icddr,b. dhakai kórház Hosszabb tartózkodási osztályán. A SAM-ban szenvedő és hasmenésben szenvedő gyermekek standardizált kezelési protokollját követik (az icddr,b-ben fejlesztették ki és a WHO irányelveihez igazítják; Ahmed és mtsai, Lancet 1999). A kulcsfontosságú elemek között szerepel kezdetben 2 órás etetés F-75-tel (ajánlott kezdő tápszer, napi 130 ml/kg), folsav, A-vitamin, ampicillin és gentamicin, valamint a hőmérséklet és a vércukorszint monitorozása és ellenőrzése. Az antibiotikum-kezelés megkezdése előtt székletmintákat vesznek (ha szükséges, székletkatéterrel).

A stabilizációs szakasz tapasztalataink szerint átlagosan 4 napig tart. A stabilizációs fázis befejeződését kielégítő étvágy jellemzi, nincs szükség nasogastricus szondás táplálásra, jó általános klinikai állapot, hasmenés hiánya, kiszáradás, láz, hipotermia vagy tachypnea.

A stabilizált csecsemők átkerülnek az NRU-ba, miután megkapták a gondozó írásos hozzájárulását. A stabilizált csecsemőket véletlenszerűen besorolják a 3 kezelési karba, miután befejezték az 5-7 napos antibiotikum-kúrát. A Kórház vezető dietetikusa elkészíti az étrendet (F-100) és ellátja az NRU-t. Az F-100-at az első 2 napban 2 óránként napi 130 ml/ttkg adagban adagolják, majd ezt követően 3 óránként adják be, és fokozatosan 10 ml-rel növelik minden adagnál, amíg egy kis takarmány nem marad. A szoptatást a szoptatások között javasoljuk. Az elfogyasztott anyatej mennyiségét a csecsemők tesztmérésével becsülik meg.

A gondozókat kiképezik arra, hogy pszichoszociális stimulációt nyújtsanak a csecsemőknek, ez a tevékenység rutinszerűen történik az NRU-ban. Ez úgy történik, hogy beszélünk vagy énekelünk a csecsemőkkel, korspecifikus fizikai aktivitással és helyi játékokkal játszunk.

Az anyatej bevitelének mérése tesztméréssel a publikált szabványos módszer szerint (Islam et al., 2006):

Az anyatej összegyűjtése:

Mivel ez a tanulmány a Bifidobaktériumok beágyazódását vizsgálja, amely összefüggésben áll a HMO-k anyatejben való hozzáférhetőségével, 10 ml anyatejet fogunk összegyűjteni aszeptikus körülmények között, és megvizsgáljuk a HMO-tartalmat.

Ezt az elemzést olyan laboratóriumokban végzik el, amelyek már rendelkeznek e vizsgálatok elvégzésével.

Emellett az összegyűjtött anyatejminták mikrobiota elemzését is elvégezzük. Ennek az az oka, hogy az anyatej mikrobiota valószínűleg befolyásolja más organizmusok kolonizációját és a csecsemő bélrendszeri futásteljesítményét.

Az anyatejet az emlőből 07:00 és 11:00 óra között gyűjtik össze, és a nőket arra kérik, hogy a mintavétel előtt legalább 2 órával ne tápláljanak vagy fejtsenek ki a vizsgált mellből. A mintavétel előtt a mellet jódos törlőkendővel megtisztítják. A teljes mellkifejezést egyszer használatos, steril gyűjtőkészlettel (Hygienikit®; Ameda, Cary, IL, USA) és elektromos mellszívóval (SMR-B-R modell; Ameda-Egnell, Inc.) gyűjtjük össze. A tej azonnal jégre kerül.

A Bif (8 milliárd CFU/napi egyszeri adag-), a Bif (8 milliárd CFU/napi egyszeri adag-) + Prebiotikum (1gm/6óránként-4gm/nap) és a placebo (625mg laktóz) por formában, tasakban lesz elérhető. az egyes csecsemők véletlenszerű besorolási kódjával megegyező egyedi kódszámokkal jelölt etetőkészletekben. A tasak tartalmát naponta egyszer adják be egy csecsemőnek, 5 ml tápszerrel vagy anyatejjel keverve Bif és placebo tasakok, és minden 200 ml F-100 készítményt egy prebiotikus (LNnT) tasakot fel kell oldani. A gondozókat, de nem a vizsgálati személyzetet, nem látják el a kezelési megbízástól.

Az LNnT dózisát és adagolását végső soron a legújabb szakirodalom áttekintése, valamint az ezen a területen dolgozó szakértők tapasztalatai alapján határozzák meg. A cél az, hogy a lehető legnagyobb mértékben ösztönözzék a HMO-k elérhetőségének természetes feltételeit az anyatejben.

A randomizált csecsemőkhöz rendelt etetőkészleteket (tasakokat) hűtőszekrényben vagy fagyasztva tárolják, amíg a résztvevő kórházba kerül. Azokat az etetőkészleteket, amelyeket még nem rendeltek hozzá egy csecsemőhöz, kórházi fagyasztóban tárolják, folyamatos hőmérséklet-felügyelet mellett. A fagyasztóban (-20°C ± 5°C) tárolt probiotikum a tasakon feltüntetett lejárati időig (a csomagolástól számított 1 évig) használható fel. Legfeljebb 31 napig tárolható hűtőszekrényben (4°C ± 5°C). A prebiotikum (LNnT) szobahőmérsékleten stabil, de hűtőszekrényben vagy fagyasztóban tárolható a probiotikummal együtt.

2. csoport (nem alultáplált gyermekek): A jogosult nem alultáplált csecsemőket a kórházi protokoll szerint kezelik. Röviden: felveszik őket a hosszabb tartózkodási osztályra, vagy szükség esetén az intenzív osztályra. A kórház meghatározta a kezelési protokollokat az akut vizes hasmenés, a tüdőgyulladás és a súlyos tüdőgyulladás, a tartós hasmenés, a súlyos szepszis, az elektrolit-rendellenességek és a kórházban szerzett fertőzések kezelésére. A gyermekeket a kórházban kezelik ezen protokollok szerint. A kizárólag anyatejjel táplált csecsemők továbbra is anyatejet kapnak. Másokat 2-3 óránként módosított anyatej-helyettesítő tápszerrel egészítenek ki. Az elfogyasztott anyatej mennyiségét a csecsemők tesztmérésével becsülik meg. A Bif-kezelést az antibiotikum-kúra befejezésének napján kezdik meg, és a csecsemőknek az 1. csoporttal megegyező módon kapják meg. A tasak tartalmát összekeverik egy teáskanál csecsemőtápszerrel vagy anyatejjel, és megetetik a csecsemővel.

Még akkor is, ha a vizsgálatban résztvevők elesnek vagy kifejlődnek a kórházban szerzett fertőzések vagy állapotuk állapota, mindegyik karon 18 értékelhető esetet kell teljesítenünk.

Kibocsátás a kórházból:

Az elbocsátásra akkor kerül sor, ha a SAM-ban szenvedő csecsemő testtömeg-hosszúsága > -3, ha lehetséges ≥ -2 Z-pontszám, ödémás alultápláltság esetén pedig az ödéma megszűnésekor, és ha a csecsemő jól van és jól van klinikailag. A nem alultáplált csecsemőket akkor bocsátják haza, ha teljesítik a kórházi elbocsátási kritériumokat. Addigra a gondozókat kiképezik az étrend-kiegészítők elkészítésére és beadására.

Nyomon követés:

A SAM-ban szenvedő csecsemőket a kutatási asszisztensek otthoni látogatáson követik nyomon hetente kétszer, egészen a randomizációt követő 8 hétig. A nem alultáplált csecsemőket hetente kétszer otthoni látogatáson követik a kiegészítés befejezéséig, majd hetente egyszer a randomizálást követő 6 hétig. Az ilyen látogatások során az anyatej-helyettesítő tápszer (SAM csecsemők számára) és a táplálékkiegészítők (mindkét csoport) pótlása, a táplálék tényleges bevitele, illetve a beadott mennyiség és a feloldás módjának ellenőrzése, valamint a megbetegedések személyre szabott eseten történő rögzítése. rekordforma. Mivel a B. infantis táplálékkiegészítőt hűvösen kell tartani az optimális életképesség megőrzése érdekében, a kutatási asszisztensek szigetelt dobozokban vagy hűtőben, jéggel vagy fagyasztott gélcsomagolással viszik a kiegészítőt otthoni látogatásokra. Bár a kiegészítő valószínűleg szobahőmérsékletre melegszik fel a látogatások között, nem várható, hogy az életképesség elvesztése jelentősen befolyásolja a B. infantis bélben való megtelepedését. Minden résztvevőnek egy mini hűtőszekrényt biztosítunk a tanulmányi időszakra, és minden szülőt utasítunk arra, hogy a kiegészítőt a felhasználásig ezekben a tartályokban tartsa.

Azok a csecsemők, akik a véletlen besorolást követő 8 hétig (az otthoni vizitek végén) még nem értek el a testtömeg-hosszúsághoz képest ≥ -1 Z-pontszámot, továbbra is vihetik a csecsemőt az icddr,b-be súlymérésre és mérésre, valamint a tápszer-adagok felvételére. rutinszerűen mindaddig, amíg el nem éri a ≥ -1 Z súly/hosszúságot.

Hosszú távú nyomon követést végeznek a beiratkozott résztvevők antropometriájának felmérésére.

Minta kollekció:

A székletmintákat az alábbiak szerint gyűjtjük.

• Széklettamponok (mikrobióm-elemzéshez) (13-szor SAM-ban, 11-szer nem SAM-ban)

  • Felvételkor, antibiotikumos kezelés előtt
  • Stabilizálás után, randomizálás és kiegészítés előtt
  • A kiegészítés 2. napja
  • A kiegészítés 4. napja
  • A kiegészítés 7. napja
  • A pótlás 10. napja (vagy az utolsó nap az NRU-ban, ha korábban bocsátják ki)
  • A pótlás 14. napja (az NRU-ban, vagy a kutatóasszisztens felveszi otthoni látogatáskor)
  • A kiegészítés 21. napja (a kutató asszisztens veszi fel otthoni látogatáskor)
  • A kiegészítés 28. napja (a kutató asszisztens veszi fel otthoni látogatáskor)
  • 1 héttel a kiegészítés után (a kutató asszisztens veszi fel otthoni látogatáskor)
  • 2 héttel a táplálékkiegészítés után (a kutató asszisztens veszi fel otthoni látogatáskor)
  • 3 héttel a kiegészítés után (a kutató asszisztens felveszi otthoni látogatáskor): csak SAM
  • 4 héttel a kiegészítés után (a kutató asszisztens felveszi otthoni látogatáskor): csak SAM

• Székletdarabkák vagy katéteres székletminták (pH és gyulladásos markerek esetén) kórházban [csak SAM-csecsemőknél]:

  • Felvételkor, antibiotikumos kezelés előtt
  • Stabilizálás után, randomizálás és kiegészítés előtt
  • Kiegészítés 7. napja
  • A pótlás 10. napja (vagy az utolsó nap az NRU-ban, ha korábban bocsátják ki)
  • A pótlás 28. napja (a kutató asszisztens gyűjti össze otthoni látogatáskor)
  • 4 héttel a kiegészítés után (a kutató asszisztens gyűjti össze otthoni látogatáson)

• Székletdarabkák vagy katéteres székletminták (pH és gyulladásos markerek esetén) kórházban [csak nem alultáplált csecsemőknél]:

  • Felvételkor, antibiotikumos kezelés előtt
  • A pótlás megkezdése után, a kórházi elbocsátáskor
  • A pótlás 28. napja (a kutató asszisztens gyűjti össze otthoni látogatáskor)
  • 2 héttel a kiegészítés után (a kutató asszisztens gyűjti össze otthoni látogatáson)

Székletminta gyűjtése a kórházban:

Minden gyermeket a Dhaka Kórházból (icddr,b) szűrnek a fent említett felvételi és kizárási kritériumok szerint. A kutatók átvizsgálják ezeket a gyerekeket az antibiotikum beadása előtt. A székletminta vétele előtt a törvényes gyámtól írásos hozzájárulást kell kérni.

A székletet minden gyermektől frissen kell gyűjteni. A mintákat a begyűjtés után a lehető leghamarabb, ideális esetben kevesebb, mint 15 perccel előre felcímkézett 2 ml-es kriovialokba kell aliquot részekre osztani, majd a szállítóba (~-70 ⁰C). A begyűjtés után és az alikvot felosztás előtt a székletgyűjtő edényt (nedves) jégen kell tartani. Ideális esetben a kriovialokat körülbelül 2/3-ig töltik meg. Hetente kétszer ezeket a mélyhűtött mintákat az icddr,b Dhaka Hospital Biosafety Level Laboratóriumába szállítják, ahol -80 °C-os fagyasztóban tárolják. A kiolvadás megelőzése érdekében az injekciós üvegeket a lehető leggyorsabban a feladótól a -80⁰-es fagyasztóba szállítják, miközben a fagyasztódobozokba töltik. Ezeket a fagyasztódobozokat addig nem távolítják el a -80⁰ fagyasztóból, amíg át nem adják őket a World Couriernek az USA-ba történő szállítás céljából.

Intézkedések a baktériumok lehető legjobb helyreállításának és életképességének biztosítására:

1. A feladókat az átvétel napja előtt teljesen fel kell tölteni, és nyilvántartást vezetnek a felnyitások számáról.
2. A feladóknak körülbelül 12 órára van szükségük a folyékony nitrogén hozzáadása után, hogy teljesen feltöltődjenek. Ezért minden nap végén újratöltjük (megtöltjük) a szállítókat, majd másnap reggel használat előtt leöntjük a maradék fel nem szívódott folyékony nitrogént.
3. A feladókat a töltés előtt, a töltés után (azaz másnap reggel a fel nem szívódott N2 kiöntése után), majd minden nap végén újra megmérik, hogy megtudják, mennyi folyékony nitrogén maradt a tartályban. Ez lehetővé teszi számunkra, hogy megbecsüljük, mennyi folyékony N2-re van szükség minden alkalommal, amikor újratöltjük, és milyen gyakran van szükség erre.

Széklettampon gyűjtés a kórházban és a közösségből:

A székletmintákat az ütemtervben leírtak szerint vesszük. Miután a résztvevőket kiengedték az NRU-ból, a széklettamponot a tervezett időponttól számított két napon belül le kell venni.

A székletgyűjtésről a gyermek/résztvevő elsődleges gondozóját egy nappal a tervezett székletgyűjtés előtt értesítik. Egy képzett kutatószemélyzet a tervezett mintavétel napján veszi az első rendelkezésre álló friss székletmintát a gyermektől.

A Kórházban és a közösségben történő gyűjtés során a kutatószemélyzet megkapja a felcímkézett széklettampon tubusokat (stabilizáló puffert tartalmazó), egyedileg csomagolt tamponokat (törésponttal), kriogén markert és műanyag zacskókat.

A Kórházban az anyák/gondozók utasítást kapnak, hogy azonnal értesítsék a kutatószemélyzetet, amint a gyermek kiürül. Ezután a kutatószemélyzet a következőket fogja tenni:

• Törölje le a baba szennyezett pelenkáját, és gyűjtsön annyi székletmintát, hogy a tampon fejét teljesen bevonja.
• Helyezze a tampont a megfelelően felcímkézett zöld tetejű gyűjtőcsőbe, és pattintsa le a tampont a töréspontnál – a tampont a csőben marad.
• Szorosan zárja le a csövet, és erőteljesen rázza fel, hogy biztosítsa a széklet eloszlását a stabilizáló pufferben.
• A mellékelt kriogén marker használatával (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4000221), írja fel a cső címkéjére a székletgyűjtés dátumát.
• Ismételje meg a törlést egy második tiszta pálcikával és a duplikált zöld tetejű csővel.
• Helyezze vissza a zöld tetejű csöveket a mellékelt műanyag zacskókba, és tárolja szobahőmérsékleten, amíg az egészségügyi dolgozó fel nem veszi.

A vizsgálat során minden résztvevőről információkat gyűjtenek az antibiotikum-bevitelről. Minden mintavételkor megkérdezzük az anyát vagy más gondozónőt az elmúlt 14 napban előforduló bármely betegségről és arról, hogy kezelték-e. A gyógyszer jellegét a gyógyszer fizikai vizsgálatával, a felírással és a név megkérdezésével igazolják, vagy azt, hogy a gyógyszer por volt-e, amelyet fel kell készíteni.

Nyálminta gyűjtés anyától:

Elvégezzük a "Secretor status fenotipizálási vizsgálatot" az anyák nyálában, hogy lássuk az anyák szekréciós státuszát a HMO státusz kimutatása, valamint a csecsemők mikrobiótájával való kapcsolat.

A nyálminta gyűjtési eljárása

1. Az anyáknak kezet kell mosniuk, szájukat hideg vízzel ki kell öblíteni, a vizet teljesen ki kell köpni.
2. Eltávolítják a mintavevőt, ügyelve arra, hogy csak a fogantyút érintsék.
3. Anya fogkefeként fogja a fogantyút az Oracle mintavevő csövet, majd a szájába dugja, és egy percig szivaccsal dörzsöli az ínyét. Győződjön meg arról, hogy a szivacs teljesen telített.
4. a szivacs érintése nélkül behelyezik a mintavevőt az eredeti Oracol csőbe, szivaccsal lefelé, és szorosan lezárják a fedelet.
5. Anya visszaadja az Oracle mintavevő csövet a vizsgálati személyzetnek (akik felcímkézik és lehűtik a csöveket, ha a mintákat nem dolgozzák fel ugyanazon a napon).

Székletminták gyűjtése és szállítása a közösségből Minden képzett közösségi egészségügyi dolgozó felelős bizonyos számú székletgyűjtésért havonta. Mobiltelefonon felveszi a kapcsolatot az anyjával, és kora reggel megérkezik a gyermek házához egy asztali nitrogénszállítóval, és összegyűjti a széklettamponot.

A székletminták kezdeti gyűjtését egy megfelelő steril edényben kell elvégezni, majd a székletanyag kisebb alikvotjait a terepmunkásnak (a székletürítést követő 20 percen belül) előre felcímkézett, steril, 2 ml-es kriobiztos csövekbe kell áthelyeznie. A csövek címkéinek minimálisan tartalmazniuk kell a résztvevő mintaazonosítóját (SID) és a begyűjtés dátumát.

Az egészségügyi dolgozók tiszta, eldobható latex kesztyűt viselve minden 2 ml-es kriofiolát körülbelül fél-kétharmadáig megtöltenek steril spatulával és szorosan lezárva. Semmilyen puffert, tartósítószert vagy adalékanyagot nem adunk a mintához. Óvintézkedéseket kell tenni a csavaros kupakkal ellátott fiolák használata során, és nem szabad túltölteni őket, mivel ez minimalizálja a minták keresztszennyeződésének lehetőségét a szállítás és tárolás során.

Ezután a kupakkal lezárt injekciós üvegeket folyékony nitrogénnel előre feltöltött „száraz szállítókba” helyezik, és azonnal visszaszállítják a laboratóriumba. Bár nehéz, a mintákat a székletürítést követő 20 percen belül száraz szállítóba kell szállítani. A laboratóriumban képzett személyzet üríti ki a fiolákat a száraz feladóból egy vödörbe szárazjégbe, hogy megakadályozza a kiolvadást a válogatás során, és a fiolákat 9x9-es fagyasztóládákba helyezi át hosszabb távú tárolás és szállítás céljából.

Jelentés:

Az információkat az SFC (Sool Field Collection Form) rögzíti.

Vizsgálatok:

Az icddrb-n végrehajtott tesztek:

• széklet pH meghatározása kórházi laborban
• A mieloperoxidáz és más biomarkerszintek vizsgálata székletmintákban

Az Evolve Biosystems által végzett tesztek:

• Következő generációs szekvenálás, metagenomika és minták q PCR elemzései
• Immunrendszeri vizsgálatok – Gyulladásos és immunrendszerrel kapcsolatos citokinek/analitok multiplex elemzése
• IL-10, TGF béta, IL-2, TNF alfa, IL-17, IL-22, IL-8, IL-6, IP-10
• Az sCD83, sTLR2 és a széklet lipocalin 2 ELISA-vizsgálatai

széklet PH:

A széklet pH-értékét megmérik, hogy felmérjék a széklet pH-jának alapértékhez viszonyított változását a kiegészítés során.

Mieloperoxidáz:

A mieloperoxidáz a neutrofil aktivitás specifikus markere. Azért választották, mert nem emelkedik meg az anyatejben vagy a szoptatott gyermekek székletében, ahogy a laktoferrin és a kalprotektin (Dorosko és mtsai, 2008), és a széklet MPO-szintje összefüggést mutatott a gyulladásos bélbetegségben szenvedő betegség aktivitásával, mind endoszkópos vizsgálattal. és biokémiai paraméterek (SAIKI T, 1998). A MAL-ED tanulmány már kimutatta az MPO szerepét a bélműködés markereként (McCormick et al., 2017).

Ezt a biomarker koncentrációt kereskedelmi ELISA-val mérjük.

Következő generációs szekvenálás: Az elmúlt években számos új generációs szekvenálási technológia született (Shendure & Ji, 2008), amelyek lehetővé teszik számos mikroorganizmus elemzését különböző környezetekben (Tringe et al., 2005) és az emberi testben. helyek (Ding & Schloss, 2014, beleértve az emberi bélrendszert is (Methé et al., 2012).

A 16S rDNS-szekvencia-analízis és a metagenomika két hatékony DNS-szekvenálási technika, és mindkettőt használták a nem tenyésztett bélmikrobiális közösségek tanulmányozására. A 16S rDNS szekvenciaelemzés az összes mikrobában jelenlévő konzervált 16S rDNS gén szekvenálására összpontosít (Woese & Fox, 1977), és számos új összefüggést hozott létre a bélmikrobióta összetétele és a betegség között (Blaser et al., 2013). A 16S rDNS szekvencián alapuló kutatás egy olyan technika, amely felfedi "ki van ott?" egy adott mikrobiális közösségben, míg a shotgun metagenomikus szekvenálás képes lesz választ adni a "mit tehetnek?" (Lepage et al., 2012). A súlyosan alultáplált csecsemőkben végzett beavatkozás után következő generációs szekvenálást végeznek a szervezet, különösen a B. infantis beágyazódásának kimutatására, és összehasonlítják azt jól táplált gyerekekkel.

Metagenomika:

A metagenomikát először Handelsman és Rodon írta le 1998-ban (Handelsman et al., 1998), és ez egy másik DNS-szekvenálási megközelítés lett a komplex bélmikrobiális közösség tanulmányozására. Célja a közösség összes génjének katalogizálása a mintából kinyert összes DNS véletlenszerű szekvenálása révén (Qin et al., 2010). Először is, az összes mikroorganizmus teljes DNS-ét kivonják a székletmintákból. Szekvenálás előtt a teljes DNS-mintákat véletlenszerűen lenyírják egy "sörétes" megközelítéssel. Az átfogó szekvenciákat ezután elemzik, hogy vagy filogenetikai markereken (16S rDNS) alapuló fajprofilokat (Sunagawa és mtsai, 2010), vagy teljes genomokon alapuló genomiális profilokat kapjanak (Tringe és mtsai, 2005). A metagenomika szerepet játszik az emberi bélmikrobióma megértésében, beleértve a bélmikrobióma sokféleségét, az új gének azonosítását és a funkcionális dysbiosis etiológiájának meghatározását (Wang és mtsai, 2015). A bél mikrobióta kiindulási összetételét (metagenomiás analízis) és a bifidobaktériumok kolonizációját (relatív abundancia) metagenomikus elemzéssel a kiegészítés alatt/után elvégzik.

qPCR: Valós idejű PCR-t végeznek a szervezet kvantitatív kimutatására a székletmintából közvetlenül kivont DNS-ben. B. infantis kolonizáció qPCR-rel a kiegészítés alatt és után (prebiotikumokkal és anélkül) történik.

Citokinek:

Bármely citokin, amely a bélgyulladás következtében lokálisan termelődik, kiszivároghat a bél lumenébe, és megjelenhet a székletben. A bél megbetegedett nyálkahártyájának nagy gyulladásos beszűrődése megemelkedett citokineket okoz a székletben. Citokin vizsgálatokat végzünk a bélgyulladás kimutatására. Székletmintákban mérjük az Interleukin-10 (IL-10), Transforming Growth Factor-β (TGF-β), Interleukin-2 (IL-2), Tumor Necrosis Faktor-α (TNF-α), Interleukin-17 ( IL-17), Interleukin-22 (IL-22), Interleukin-8 (IL-8), Interleukin-6 (IL-6), Interferon Gamma Induced Protein 10 (IP-10).

ELISA-vizsgálatok sCD83, sTLR2 esetén:

A CD83 oldható formája felszabadul az aktivált dendritikus sejtekből és B-limfocitákból, és kimutatható normál humán szérumban (Hock et al., 2001). A Toll-like receptorok (TLR-ek) a mintázatfelismerő receptorok (PRR-ek) egy osztálya, amelyek kulcsszerepet játszanak a veleszületett immunitásban, és specifikus immunválaszt váltanak ki. Az sTLR2-t humán folyadékokban, például plazmában, anyatejben, nyálban és magzatvízben, valamint tenyésztett monociták felülúszójában mutatták ki (LeBouder és mtsai, 2003; Kuroishi et al., 2007; Dulay és mtsai, 2009). alultáplált csecsemők székletmintáiból izolálja az sCD83-at és az sTLR2-t.

Széklet lipocalin 2:

Ez a glikoprotein számos sejtben expresszálódik, és a humán neutrofil primer és másodlagos granulátumaihoz kapcsolták (Roudkenar et al., 2007). Az Lcn-2 felszabályozása olyan szövetkárosító állapotok esetén figyelhető meg, mint például fertőzés, vesekárosodás, rák, fekélyes vastagbélgyulladás és égési sérülés, ahol szabad gyökök termelése következik be (Chassaing et al., 2012). A lipocalin-2 kevésbé szorosan korrelál a neutrofil markerekkel, komplementer markere lehet a hámsejt megszakítására vagy károsodására (Prata et al., 2016). Mind az alultáplált, mind a jól táplált csecsemőknél elvégezzük a tesztet az enterocita károsodás kimutatására.

Anyatej mikrobiota és HMO elemzés:

Számos tanulmányban az anyatej analízisét (Williams et al., 2017) és az anyatejben lévő baktérium közösséget (Hunt et al., 2011) értékelték. Ebben a tanulmányban a mikrobiota elemzést 16S rDNS szekvencia analízissel végezzük. A HMO mérést az LnNT szint ismeretéhez végezzük.

Adatkezelési eljárás:

• A kérdőíveket nem sokkal az interjú után vizuálisan beszkenneljük, és megjelöljük a hiányosságokat, következetlenségeket vagy hibákat, amelyeket azonnal orvosolunk.
• Az SPSS használatára és az adatok bevitelére minden adatbeviteli fájlhoz egy sablon létrehozása után kerül sor, megfelelő logikai és konzisztencia ellenőrzésekkel
• Az adatok bevitele folyamatosan történik, miközben az adatok a kórházban és a laboratóriumban készülnek
• Az adatokat logikai és tartományellenőrzések sorozata fogja érvényesíteni, összefoglaló statisztikákat és táblázatokat készítve
• Ezenkívül a CRF 50%-át (és az összes változót) a vizsgáló(k) ellenőrzik.
• Az adatok azonnal átmásolódnak két számítógép merevlemezére, amint az adatok ellenőrzése befejeződik.

A mintaméret számítása és az eredmény (elsődleges és másodlagos) változó(k):

A kísérleti vizsgálathoz kezelési ágonként 18 SAM-csecsemőt, valamint további 18 nem alultáplált gyermeket veszünk fel, így összesen 72 csecsemőt.

Adatelemzés Az adatok az SPSS segítségével (20.0-s verzió, Armonk, NY) bekerülnek az előzetesen tesztelt klinikai nyilvántartási űrlapokba (CRF), majd ismételt ellenőrzéssel megtisztítják. Annak érdekében, hogy megismerjük a prebiotikus és probiotikus kiegészítés eredményét vizsgált gyermekeinkben a normális eloszlású adatokhoz, ANOVA-t végzünk, és nem normális mérési eloszlás esetén ekvivalens nem paraméteres teszteket, például Kruskal-Wallis H tesztet alkalmazunk, és megfelelő post hoc szükség esetén tesztet végeznek az alcsoport elemzéshez. A 0,05-nél kisebb valószínűséget statisztikailag szignifikánsnak tekintjük, és az asszociáció erősségét az esélyhányados (OR) és a 95%-os konfidenciaintervallumok (CI) kiszámításával kell meghatározni. Ha bármilyen haláleset következik be, szóbeli boncolást végzünk, és ugyanazzal az analitikai tervvel értékeljük a halálhoz kapcsolódó tényezőket.

Adatbiztonsági Monitoring Terv (DSMP) Az adatbiztonsági monitoringot szigorúan elvégzik a vizsgálat során. Minden űrlapot a vizsgálati orvos felülvizsgál a beiratkozás és az adatgyűjtés után, majd a felügyelő a teljesség, olvashatóság és belső következetesség szempontjából. A prebiotikum és probiotikum beadása a kórházban a vizsgálati orvos jelenlétében történik. A mintavétel, -feldolgozás és -értelmezés minden vonatkozását szintén a szabványos működési előírásoknak megfelelően kell elvégezni.

A Collaborative Arrangements icddr,b a tanulmányt az Evolve BioSystems, Inc. USA-val együttműködve végzi el, egy magánvállalkozással, amelyet Kaliforniában alapítottak nemzetközileg elismert akadémikusok, akik a csecsemőbél mikrobiomáját és annak az emberi anyatejjel való kritikus kapcsolatát kutatják.