Pilot van een prebiotische en probiotische proef bij jonge zuigelingen met ernstige acute ondervoeding

Specifieke doelen:

Om de microbioomrespons op probiotische suppletie (met en zonder prebiotica) te evalueren bij zuigelingen jonger dan 6 maanden met ernstige acute ondervoeding en om de microbioomrespons te vergelijken met gezonde zuigelingen aangevuld met probiotica.

Studieplaats: De studie zal worden uitgevoerd in het Dhaka-ziekenhuis van het International Centre for Diarrheal Disease Research, Bangladesh (icddr,b). De instelling beschikt over goed uitgeruste klinische zorg en laboratoriumfaciliteiten die alle klinische tests kunnen uitvoeren.

Studiepopulatie:

Groep 1 (SAM) Groep 2 (niet ondervoed)

Interventie:

Bifidobacterium longum subsp. infantis (EVC001) met en zonder prebiotische suppletie gedurende 28 dagen zal in de studie worden verstrekt.

Er zijn verschillende onderzoeken in ontwikkelingslanden waar prebiotica en probiotica werden gebruikt bij ernstige acute ondervoeding en bij risicovolle baby's. Veiligheid van Bifidobacterium longum subsp. infantis (EVC001) blijkt uit zowel gepubliceerde literatuur als veiligheidsrapporten (Smilowitz et al., 2017; Sheridan et al., 2017; Grenov et al., 2017; Panigrahi er al., 2017; Kerac et al., 2009) . De IMPRINT-studie, een klinische fase I-studie, bepaalde de veiligheid en verdraagbaarheid van suppletie van zuigelingen die borstvoeding krijgen met B. infantis (EVC001) (Smilowitz et al., 2017). De veiligheid van prebiotica (LNnT) werd beoordeeld door het EFSA-panel (Europese Autoriteit voor voedselveiligheid) voor dieetproducten, voeding en allergieën (NDA) gerelateerd voedsel en het panel concludeerde dat LNnT veilig is voor zuigelingen. De International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics (ISAPP) adviseerde dat een aantrekkelijk doelwit voor klinische interventies zal leiden tot nieuwe benaderingen ter bestrijding van ondervoeding (Sheridan et al., 2017). Een in Oeganda gehouden onderzoek waarbij probiotica werden gebruikt bij SAM-kinderen in het ziekenhuis onthulde dat probiotica een rol kunnen spelen bij de follow-up van gehospitaliseerde kinderen met SAM in de poliklinische fase, aangezien het een significante vermindering van de duur van de diarree liet zien (Grenov et al., 2017). Op het platteland van India werd een significante vermindering waargenomen voor kweekpositieve en kweeknegatieve sepsis en lagere luchtweginfecties bij zuigelingen met gebruik van symbioticum (Kerac et al., 2009). De PRONUT-studie heeft geen enkel geval van probioticumgerelateerde bacteriëmie aangetoond. De reactie van de microbiota op probiotica kan per dieet of geografie verschillen.

Proefwapens:

3 behandelingsarmen voor zuigelingen met SAM:

• Placebo (Lactose)
• B. infantis alleen (Bif)
• B. infantis + prebiotisch Lacto-N-neotetraose [LNnT] (Bif+prebioticum) Elke arm krijgt het standaardzorgdieet toegewezen (F-75 tijdens de acute fasebehandeling van SAM, F-100 tijdens ziekenhuisverblijf voor voedingssupplementen). revalidatie en gestandaardiseerde zuigelingenvoeding bij ontslag). Randomisatie voor behandelingstoewijzing vindt plaats in een verhouding van 1:1 met behulp van stratificatie naar leeftijd (2-3,9 maanden vs. 4-6 maanden) om te zorgen voor gelijke deelname van baby's per leeftijdsgroep. Toewijzing vindt plaats door gebruik te maken van willekeurige gepermuteerde blokken met een grootte van 3. In totaal zullen 54 deelnemers worden ingeschreven met 18 baby's (9+9) toegewezen aan elke behandelingsarm.

Prebioticum zal worden gebruikt in de vorm van LNnT (Lacto-N-neotetraose, dat wordt geproduceerd door fermentatie en chemisch identiek is aan LNnT dat aanwezig is in menselijke moedermelk. LNnT bevat een specifieke koppeling die B. infantis kan afbreken terwijl andere bacteriën dat niet kunnen. Wanneer in de in vitro assay het groeimedium 50% of meer LNnT bevat, wordt de groei van B. infantis ondersteund, maar wordt de groei van Bacteroides en E. coli geremd. De verdeling van de glycosylhydrolasen die nodig zijn om deze structuur te consumeren, is zeldzaam bij Proteobacteriën (inclusief Campylobacter) als geheel, en afwezig bij Bacteroides en daarom zou LNnT niet moeten bijdragen aan kruisvoeding, zelfs als er geen B. infantis-implantatie is.

Het doel van het selecteren van de niet-ondervoede kinderen is om te zien of de verstoorde microbiota van SAM-zuigelingen zich herstelt tot een hoger niveau van B. infantis, vergelijkbaar met de niveaus die worden gezien bij gezonde zuigelingen die borstvoeding krijgen en die een acute ziekte hebben en worden behandeld met een antibioticum.

Steekproefgrootte:

Voor de pilot hebben we 18 baby's per behandelarm, in totaal 54 SAM-baby's. We zullen ook 18 niet-ondervoede baby's inschrijven voor de open-label B. infantis-behandeling. In totaal zullen 72 baby's de onderzoekspopulatie voor deze pilot zijn.

Zelfs als studiedeelnemers een in het ziekenhuis opgelopen infectie laten vallen of ontwikkelen of verslechteren, moeten we 18 evalueerbare gevallen in elke arm voltooien.

Procedure voor het verzamelen van basislijngegevens: Alle SAM- en niet-SAM-kinderen binnen de gedefinieerde leeftijdsgroepen zullen door de onderzoeksarts worden gescreend op geschiktheidscriteria voor de studie. Ouders/begeleidende verzorgers van degenen die voldoen aan de geschiktheid, in toepassing van de inclusie- en exclusiecriteria, zullen worden uitgenodigd om hun toestemming te geven voor de inschrijving van hun kinderen in het onderzoek. Na ondertekening van een schriftelijke geïnformeerde toestemming, na het verstrekken van informatie over de studie en de interventies, uitleg over mogelijke voordelen en risico's, en vrijwillige aard van deelname samen met het recht om kinderen op elk moment terug te trekken na de initiële toestemming zonder opgaaf van reden, zullen kinderen worden ingeschreven door de onderzoeksarts. Klinisch dossierformulier zal worden gebruikt om relevante informatie te verzamelen, zoals medische geschiedenis inclusief aard en duur van de ziekte, medicatie voor de huidige ziekte; sociaal-demografische kenmerken zoals leeftijd, geslacht, religie, leeftijd van de ouders met opleiding, beroep ouders, brandstofverbruik en rookgeschiedenis, maandelijks gezinsinkomen, aantal broers en zussen, enz. Er zou ook informatie worden verzameld over de voedingsgewoonten van het kind, zoals de geschiedenis van borstvoeding, flesvoeding of andere aanvullende voeding, en de immunisatiestatus; familiegeschiedenis van tuberculose, recente luchtweginfectie van familieleden en medische geschiedenis van het kind in het verleden worden geregistreerd.

Voor follow-up op de lange termijn zal een afzonderlijk CRF worden gebruikt om informatie te verzamelen over gewicht, lengte, MUAC, voeding en voorgeschiedenis van comorbiditeit. Veldonderzoeksassistenten bezoeken de huizen van ingeschreven personen en verzamelen de vereiste informatie na schriftelijke toestemming van ouders of verzorgers.

Beheer:

Groep 1 (kinderen met SAM): Zuigelingen die in aanmerking komen voor SAM worden behandeld voor de stabilisatiefase in de Longer Stay Unit van het Dhaka Hospital van icddr,b. Het gestandaardiseerde behandelprotocol voor kinderen met SAM en diarree (ontwikkeld op icddr,b en afgestemd op de WHO-richtlijnen; Ahmed et al Lancet 1999) zal worden gevolgd. Belangrijke elementen zijn aanvankelijk 2 uur per dag voeren met F-75 (de aanbevolen startformule, 130 ml/kg per dag), foliumzuur, vitamine A, ampicilline plus gentamicine, temperatuur- en bloedglucosecontrole en controle. Voorafgaand aan de start van antibiotica, zullen baseline-ontlastingsmonsters worden verkregen (indien nodig met behulp van een fecale katheter).

De stabilisatiefase duurt in onze ervaring gemiddeld 4 dagen. Voltooiing van de stabilisatiefase wordt gekenmerkt door een bevredigende eetlust, geen behoefte aan neussondevoeding, een goede algemene klinische toestand, afwezigheid van diarree, uitdroging, koorts, onderkoeling of tachypneu.

Baby's die gestabiliseerd zijn, worden na schriftelijke toestemming van de verzorger overgebracht naar de NRU. Gestabiliseerde baby's worden gerandomiseerd naar de 3 behandelingsarmen zodra ze de 5-7-daagse antibioticakuur hebben voltooid. De senior diëtist van het ziekenhuis bereidt de voeding (F-100) en levert aan de NRU. F-100 wordt gedurende de eerste 2 dagen om de 2 uur gedoseerd in een dosering van 130 ml/kg per dag, daarna om de 3 uur en geleidelijk verhoogd met 10 ml bij elke portie totdat er wat voer over is. Tussen de voedingen door wordt borstvoeding aangemoedigd. De hoeveelheid geconsumeerde moedermelk wordt geschat door middel van een testweging van zuigelingen.

Verzorgers zullen worden opgeleid om de baby's psychosociale stimulatie te geven, een activiteit die routinematig wordt uitgevoerd in de NRU. Dit wordt gedaan door tegen de baby's te praten of te zingen, leeftijdsspecifieke fysieke activiteit en spelen met plaatselijk speelgoed.

Meting van de inname van moedermelk door middel van testweging volgens de gepubliceerde standaardmethode (Islam et al., 2006):

Moedermelk ophalen:

Aangezien deze studie de aanhechting van Bifidobacteriën zal onderzoeken, wat verband houdt met de beschikbaarheid van HMO's in moedermelk, zullen we 10 ml moedermelk onder aseptische omstandigheden verzamelen en analyseren op HMO-gehalte.

Deze analyse zal worden uitgevoerd in laboratoria die een staat van dienst hebben in het uitvoeren van deze assays.

Daarnaast zullen we ook microbiota-analyses uitvoeren van verzamelde moedermelkmonsters. Dit komt omdat de microbiota van moedermelk waarschijnlijk de kolonisatie door andere organismen en het aantal kilometers in de darmen van de baby beïnvloedt.

Moedermelk wordt tussen 07.00 en 11.00 uur uit de borst gehaald en vrouwen wordt gevraagd om gedurende ten minste 2 uur voorafgaand aan de monsterafname niet te voeden of af te kolven uit de onderzoeksborst. Voorafgaand aan de monsterafname wordt de borst gereinigd met een jodiumstaafje. Er wordt een volledige borstafkolf afgenomen met behulp van een steriele verzamelkit voor eenmalig gebruik (Hygienikit®; Ameda, Cary, IL, VS) en een elektrische borstkolf (Model SMR-B-R; Ameda-Egnell, Inc.). Melk wordt onmiddellijk op ijs geplaatst.

Bif (8 miljard CFU/dagelijkse enkele dosis-), Bif (8 miljard CFU/dagelijkse enkele dosis-) + Prebiotic (1 g/6 uur-4 g/dag) en placebo (lactose 625 mg) zullen beschikbaar zijn in poedervorm in sachets. binnen voedingskits gemarkeerd met unieke codenummers die overeenkomen met de randomisatiecode van elke baby. De inhoud van het sachet wordt eenmaal per dag aan een baby toegediend voor Bif- en placebo-sachets gemengd met 5 ml zuigelingenvoeding of moedermelk en elke bereiding van 200 ml F-100 één prebiotisch (LNnT) sachet wordt opgelost. Mantelzorgers, maar geen studiepersoneel, zullen blind zijn voor de behandelingsopdracht.

De dosis en verstrekking van LNnT zal uiteindelijk worden bepaald op basis van de bestudering van recente literatuur en de ervaring van experts die op dit gebied werkzaam zijn. Het doel is om de natuurlijke beschikbaarheidsvoorwaarden van HMO's in de moedermelk zoveel mogelijk te stimuleren.

De voedingskits (sachets) die aan gerandomiseerde baby's zijn toegewezen, worden gekoeld of ingevroren bewaard totdat ze worden gebruikt terwijl de deelnemer in het ziekenhuis wordt opgenomen. Voedingssets die nog niet aan een baby zijn toegewezen, worden opgeslagen in een ziekenhuisvriezer met continue temperatuurbewaking. Het probioticum dat in de vriezer is bewaard (-20°C ± 5°C) kan worden gebruikt tot de vervaldatum die op het sachet staat gedrukt (1 jaar vanaf de verpakkingsdatum). In de koelkast (4°C ± 5°C) is het tot 31 dagen houdbaar. Het prebioticum (LNnT) is stabiel bij kamertemperatuur, maar kan samen met het probioticum in de koelkast of vriezer worden bewaard.

Groep 2 (niet-ondervoede kinderen): In aanmerking komende niet-ondervoede baby's worden behandeld volgens het ziekenhuisprotocol. Kort gezegd worden ze opgenomen op de Longer Stay Unit of indien nodig op de IC. Het ziekenhuis heeft behandelprotocollen opgesteld voor acute waterige diarree, longontsteking en ernstige longontsteking, aanhoudende diarree, ernstige sepsis, elektrolytenstoornissen en ziekenhuisinfecties. Kinderen worden volgens deze protocollen in het ziekenhuis behandeld. Zuigelingen die uitsluitend borstvoeding krijgen, blijven moedermelk gebruiken. Anderen worden elke 2-3 uur aangevuld met aangepaste zuigelingenvoeding. De hoeveelheid geconsumeerde moedermelk wordt geschat door middel van een testweging van zuigelingen. De behandeling met Bif begint op de dag dat de antibioticakuur is voltooid en wordt op dezelfde manier aan baby's gegeven als in groep 1. De inhoud van het sachet wordt gemengd met een theelepel zuigelingenvoeding of moedermelk en aan de baby gevoerd.

Zelfs als studiedeelnemers een in het ziekenhuis opgelopen infectie laten vallen of ontwikkelen of verslechteren, moeten we 18 evalueerbare gevallen in elke arm voltooien.

Ontslagen uit het ziekenhuis:

Het ontslag vindt plaats als het kind met SAM een gewicht-voor-lengte >-3, indien mogelijk ≥ -2 Z-score heeft bereikt, en in het geval van oedemateuze ondervoeding wanneer het oedeem is verdwenen en wanneer het kind goed en welvarend is. Niet-ondervoede baby's worden ontslagen wanneer ze voldoen aan de ontslagcriteria uit het ziekenhuis. Tegen die tijd zullen de verzorgers getraind zijn in het bereiden en toedienen van voedsel en supplementen.

Opvolgen:

Baby's met SAM zullen tot 8 weken na randomisatie twee keer per week door onderzoeksassistenten worden opgevolgd via huisbezoeken. Niet-ondervoede baby's zullen twee keer per week door middel van huisbezoeken gevolgd worden totdat de suppletie voltooid is en daarna één keer per week tot 6 weken na randomisatie. Tijdens dergelijke bezoeken worden de rantsoenen zuigelingenvoeding (voor SAM-zuigelingen) en supplementen (beide groepen) aangevuld, wordt de daadwerkelijke inname van het dieet geobserveerd of wordt de gegeven hoeveelheid en de reconstitutiemethode geverifieerd, en wordt de morbiditeit geregistreerd op een op maat gemaakt geval formulier opnemen. Omdat het B. infantis-supplement koel moet worden bewaard om optimale levensvatbaarheid te behouden, brengen onderzoeksassistenten het supplement mee naar huisbezoeken in geïsoleerde dozen of koelers met ijs of bevroren gelpacks. Hoewel het supplement tussen de bezoeken waarschijnlijk zal opwarmen tot kamertemperatuur, wordt niet verwacht dat het verlies aan levensvatbaarheid een significante invloed zal hebben op de kolonisatie van B. infantis in de darmen. Elke deelnemer krijgt tijdens de studieperiode een miniatuurkoelkast en elke ouder krijgt de instructie om het supplement in deze containers te bewaren tot gebruik.

Zuigelingen die 8 weken na randomisatie (einde huisbezoeken) nog geen gewicht-voor-lengte ≥ -1 Z-score hebben bereikt, mogen de zuigeling naar icddr,b blijven brengen voor wegen en meten en om de flesvoeding op te halen routinematig totdat een gewicht-voor-lengte ≥ -1 Z is bereikt.

Er zal een follow-up op lange termijn worden uitgevoerd om de antropometrie van de ingeschreven deelnemers te beoordelen.

Voorbeeldverzameling:

Fecale monsters worden als volgt verzameld.

• Ontlastingswabs (voor microbioomanalyse) (13 keer in SAM, 11 keer in niet-SAM)

  • Bij opname, voorafgaand aan een antibioticakuur
  • Na stabilisatie, voorafgaand aan randomisatie en suppletie
  • Dag 2 van suppletie
  • Dag 4 van suppletie
  • Dag 7 van suppletie
  • Dag 10 van suppletie (of laatste dag in NRU indien eerder ontslagen)
  • Dag 14 van suppletie (in NRU of opgehaald door onderzoeksassistent op huisbezoek)
  • Dag 21 van suppletie (op huisbezoek opgehaald door onderzoeksassistent)
  • Dag 28 suppletie (afgehaald door onderzoeksassistent bij huisbezoek)
  • 1 week na suppletie (opgehaald door onderzoeksassistent bij huisbezoek)
  • 2 weken na suppletie (op huisbezoek opgehaald door onderzoeksassistent)
  • 3 weken na suppletie (op huisbezoek opgehaald door onderzoeksassistent): alleen SAM
  • 4 weken na suppletie (op huisbezoek opgehaald door onderzoeksassistent): alleen SAM

• Stukjes ontlasting of fecale kathetermonsters (voor pH en ontstekingsmarkers) in het ziekenhuis [alleen SAM-baby's]:

  • Bij opname, voorafgaand aan een antibioticakuur
  • Na stabilisatie, voorafgaand aan randomisatie en suppletie
  • Dag 7 van suppletie'
  • Dag 10 van suppletie (of laatste dag in NRU indien eerder ontslagen)
  • Dag 28 van suppletie (afgehaald door onderzoeksassistent op huisbezoek)
  • 4 weken na suppletie (verzameld door onderzoeksassistent bij huisbezoek)

• Stukjes ontlasting of fecale kathetermonsters (voor pH en ontstekingsmarkers) in het ziekenhuis [alleen niet-ondervoede baby's]:

  • Bij opname, voorafgaand aan een antibioticakuur
  • Na start suppletie, bij ontslag uit het ziekenhuis
  • Dag 28 van suppletie (afgehaald door onderzoeksassistent op huisbezoek)
  • 2 weken na suppletie (afgehaald door onderzoeksassistent bij huisbezoek)

Afname van stoelgangmonsters in het ziekenhuis:

Alle kinderen worden gescreend vanuit het Dhaka Hospital, icddr,b volgens de bovengenoemde in- en exclusiecriteria. Onderzoeksmedewerkers screenen deze kinderen voordat ze een antibioticum krijgen toegediend. Voor het verzamelen van ontlastingsmonsters wordt schriftelijke toestemming gevraagd aan de wettelijke voogd.

De ontlasting moet bij elk kind vers worden opgehaald. De monsters moeten onmiddellijk na afname worden verdeeld in voorgelabelde cryobuisjes van 2 ml en zo snel mogelijk in de verzender (~-70⁰C), idealiter minder dan 15 minuten na afname. Na verzameling en voorafgaand aan aliquotatie moet het opvangvat voor ontlasting op (nat) ijs worden gehouden. Idealiter zouden de cryoflesjes voor ongeveer 2/3 gevuld zijn. Twee keer per week zullen deze gecryopreserveerde monsters worden vervoerd naar het Biosafety Level Laboratory in het icddr,b Dhaka Hospital voor opslag in een vriezer van -80⁰C. Om ontdooien te voorkomen, worden vials zo snel mogelijk vanuit de shipper naar de -80⁰ vriezer overgebracht en naar vrieskisten. Deze vrieskisten worden pas uit de -80⁰ vriezer gehaald als ze zijn overhandigd aan World Courier voor verzending naar de VS.

Maatregelen om het best mogelijke herstel van bacteriën en hun levensvatbaarheid te waarborgen:

1. De verzenders moeten voor de ophaaldag volledig zijn opgeladen en er wordt een record bijgehouden voor het aantal keren dat ze worden geopend.
2. De shippers hebben na het toevoegen van vloeibare stikstof ongeveer 12 uur nodig om volledig opgeladen te raken. Daarom zullen we de shippers aan het einde van elke dag opnieuw vullen (vullen) en vervolgens de volgende ochtend alle resterende niet-geabsorbeerde vloeibare stikstof afgieten voordat ze worden gebruikt.
3. Shippers worden gewogen voor het opladen, na het opladen (d.w.z. de volgende ochtend na het afgieten van niet-geabsorbeerde N2) en vervolgens opnieuw aan het einde van elke dag, om te weten hoeveel vloeibare stikstof er nog in de container zit. Hierdoor kunnen we inschatten hoeveel vloeibare N2 er nodig is elke keer dat we opladen en hoe vaak dit nodig is.

Ophalen ontlastingsstaafjes in het ziekenhuis en bij de gemeente:

De ontlastingsmonsters worden genomen zoals vermeld in het tijdschema. Zodra deelnemers uit de NRU zijn ontslagen, wordt het uitstrijkje van de ontlasting binnen twee dagen na de geplande tijd opgehaald.

Voor het ophalen van ontlasting wordt de primaire verzorger van het kind/de deelnemer één dag voor de geplande ontlasting geïnformeerd. Een getraind onderzoekspersoneel zal op de dag van de geplande bemonstering het eerste beschikbare verse ontlastingsmonster van het kind verzamelen.

Tijdens de inzameling in het ziekenhuis en in de gemeenschap krijgt het onderzoekspersoneel gelabelde buisjes voor ontlastingsuitstrijkjes (met stabilisatiebuffer), individueel verpakte wattenstaafjes (met breekpunt), een cryogene marker en plastic zakken.

In het ziekenhuis krijgen de moeders/verzorgers de instructie om het onderzoekspersoneel te verwittigen zodra het kind ontlast. Dan doet de onderzoeksstaf het volgende:

• Veeg de vuile luier van de baby schoon en verzamel genoeg ontlasting om de kop van het wattenstaafje volledig te bedekken.
• Plaats het wattenstaafje in het correct gelabelde verzamelbuisje met groene bovenkant en klik de kop van het wattenstaafje eraf bij het breekpunt - de kop van het wattenstaafje blijft in het buisje.
• Sluit de buis goed af en schud krachtig om ervoor te zorgen dat de ontlasting binnen de stabilisatiebuffer wordt verdeeld.
• Gebruik de meegeleverde cryogene marker (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4000221), schrijf de datum waarop de ontlasting is verzameld op het etiket op de tube.
• Herhaal het uitstrijkje met een tweede schoon wattenstaafje en de duplicaatbuis met groene bovenkant.
• Plaats de tubes met groene dop terug in de meegeleverde plastic zakken en bewaar ze bij kamertemperatuur totdat ze worden opgehaald door de gezondheidswerker.

Tijdens het onderzoek zal voor elke deelnemer informatie worden verzameld over de inname van antibiotica. Op het moment van elke monsterafname zullen we de moeder of andere verzorger vragen naar eventuele ziekte gedurende de afgelopen 14 dagen en of deze is behandeld. De aard van het medicijn zal worden geverifieerd door fysieke inspectie van het medicijn, het recept en door te vragen naar de naam of het medicijn een poeder was dat moest worden gereconstitueerd.

Speekselmonsterafname van moeder:

We zullen de "Secretor status fenotyperingstest" doen in het speeksel van moeders om de secretorstatus van moeders te zien om de HMO-status te detecteren, evenals een link met de Microbiota van baby's.

Procedure voor het verzamelen van speekselmonsters

1. Moeders moeten de handen wassen en de mond spoelen met koud water en het water volledig uitspuwen.
2. Ze zullen de sampler verwijderen en voorzichtig zijn om alleen het handvat aan te raken.
3. Moeder zal het handvat van de Oracle-monsterbuis als een tandenborstel vasthouden en in haar mond steken en gedurende een minuut een spons tegen haar tandvlees wrijven. Zorg ervoor dat de spons volledig verzadigd is.
4. zonder de spons aan te raken, zullen ze de sampler in de originele Oracol-buis steken, afsponsen en het deksel stevig sluiten.
5. Moeder zal het Oracle-monsterbuisje teruggeven aan het onderzoekspersoneel (die de buisjes zal labelen en in de koelkast bewaren als de monsters niet op dezelfde dag worden verwerkt).

Verzamelen en transporteren van ontlastingsmonsters van de gemeenschap Elke opgeleide gemeenschapsgezondheidswerker is verantwoordelijk voor een bepaald aantal ontlastingscollecties per maand. Ze zal via de mobiele telefoon contact opnemen met moeder en 's morgens vroeg bij het huis van het kind aankomen met een stikstoftransporter op de werkbank en het uitstrijkje van de ontlasting ophalen.

De eerste afname van fecesmonsters moet worden gedaan in een geschikte steriele container, waarna kleinere hoeveelheden fecaal materiaal door de veldwerker moeten worden overgebracht (binnen 20 minuten na defecatie) in voorgelabelde, steriele cryoveilige buisjes van 2 ml. Buisetiketten moeten minimaal het monster-ID (SID) van de deelnemer en de datum van afname bevatten.

Met schone latex wegwerphandschoenen vullen de gezondheidswerkers elk cryo-flesje van 2 ml voor ongeveer de helft tot tweederde vol met een steriele spatel en een stevige dop. Eventuele buffers, conserveringsmiddelen of additieven worden niet aan het monster toegevoegd. Voorzichtigheid zal worden betracht bij het gebruik van flacons met schroefdop en het niet overvullen ervan, aangezien dit de kans op kruisbesmetting van monsters tijdens transport en opslag minimaliseert.

Daarna plaatsen ze de flesjes met dop onmiddellijk in voorgevulde 'dry shippers' met vloeibare stikstof om terug naar het laboratorium te transporteren. Hoewel dit moeilijk is, moeten de monsters binnen 20 minuten na ontlasting worden overgebracht naar droge vervoerders. In het laboratorium leegt getraind personeel de flacons van de droge verzender in een emmer met droogijs om ontdooien te voorkomen tijdens het sorteren en overbrengen van de flacons naar 9x9 vrieskisten voor opslag en transport op langere termijn.

rapportage:

Informatie zal worden vastgelegd op het Stool Field Collection Form (SFC).

onderzoeken:

Testen uitgevoerd bij icddrb:

• het bepalen van de fecale pH in het ziekenhuislaboratorium
• Testen van myeloperoxidase en andere biomarkerniveaus in fecale monsters

Testen uitgevoerd door Evolve Biosystems:

• Next Generation Sequencing, Metagenomics en q PCR-analyses van monsters
• Immuungerelateerde tests- Multiplexanalyse van inflammatoire en immuungerelateerde cytokines/analyten
• IL-10, TGF bèta, IL-2, TNF alfa, IL-17, IL-22, IL-8, IL-6, IP-10
• ELISA's voor sCD83, sTLR2 en fecaal lipocaline 2

Kruk PH:

De PH van de ontlasting zal worden gemeten om de verandering ten opzichte van de uitgangswaarde in de pH van de ontlasting tijdens suppletie te beoordelen.

Myeloperoxidase:

Myeloperoxidase is een specifieke marker van neutrofielactiviteit. Het werd gekozen omdat het niet verhoogd is in de moedermelk of in de ontlasting van kinderen die borstvoeding krijgen, zoals lactoferrine en calprotectine (Dorosko et al., 2008) en de MPO-spiegels in de ontlasting zijn gecorreleerd met ziekteactiviteit bij inflammatoire darmaandoeningen, zoals beoordeeld door zowel endoscopische en biochemische parameters (SAIKI T, 1998). MAL-ED-onderzoek heeft de rol van MPO als marker van de darmfunctie al aangetoond (McCormick et al., 2017).

We zullen deze biomarkerconcentratie meten met een commerciële ELISA.

Next Generation Sequencing: In de afgelopen jaren zijn er verschillende next-generation sequencing-technologieën ontwikkeld (Shendure & Ji, 2008) die het verder mogelijk maken om een ​​groot aantal micro-organismen in verschillende omgevingen (Tringe et al., 2005) en het menselijk lichaam te analyseren. sites (Ding & Schloss, 2014, inclusief de menselijke darm (Methé et al., 2012).

16S rDNA-sequentieanalyse en metagenomics zijn twee effectieve technieken voor DNA-sequencing, en beide zijn gebruikt om niet-gecultiveerde darmmicrobiële gemeenschappen te bestuderen. 16S rDNA-sequentieanalyse richt zich op de sequentiebepaling van het geconserveerde 16S rDNA-gen dat aanwezig is in alle microben (Woese & Fox, 1977) en heeft een reeks nieuwe verbanden gelegd tussen de samenstelling van de darmmicrobiota en ziekte (Blaser et al., 2013). Het onderzoek op basis van 16S rDNA-sequentie is een techniek om te onthullen "wie is daar?" in een bepaalde microbiële gemeenschap, terwijl shotgun metagenomische sequencing in staat zal zijn om de aanvullende vraag "wat kunnen ze doen?" te beantwoorden. (Lepage et al., 2012). Sequencing van de volgende generatie zal worden uitgevoerd om de enting van organisme, met name B. infantis, te detecteren na interventie bij ernstig ondervoede baby's en dit te vergelijken met goed gevoede kinderen.

Metagenomie:

Metagenomics werd voor het eerst beschreven in 1998 door Handelsman en Rodon (Handelsman et al., 1998) en werd een andere benadering van DNA-sequencing om de complexe darmmicrobiële gemeenschap te bestuderen. Het heeft tot doel alle genen van een gemeenschap te catalogiseren door de willekeurige sequentiebepaling van al het DNA dat uit het monster is geëxtraheerd (Qin et al., 2010). Eerst wordt het totale DNA van alle micro-organismen geëxtraheerd uit fecesmonsters. Alvorens te worden gesequenced, worden totale DNA-monsters willekeurig geschoren door een "shotgun" -benadering. De uitgebreide sequenties worden vervolgens geanalyseerd om ofwel soortprofielen te verkrijgen op basis van fylogenetische markers (16S rDNA) (Sunagawa et al., 2010) of genomische profielen op basis van hele genomen (Tringe et al., 2005). Metagenomics speelt een rol bij het begrijpen van het menselijke darmmicrobioom, inclusief de diversiteit van het darmmicrobioom, het identificeren van nieuwe genen en het bepalen van de etiologie van functionele dysbiose (Wang et al., 2015). Baseline samenstelling van darmmicrobiota (metagenomische analyse) en Bifidobacterium-kolonisatie (relatieve abundantie) door metagenomische analyse tijdens/na suppletie zal worden gedaan.

qPCR: Realtime PCR zal worden uitgevoerd voor kwantitatieve detectie van organismen in DNA dat rechtstreeks uit ontlastingsmonster is geëxtraheerd. B. infantis kolonisatie d.m.v. qPCR tijdens en na suppletie (met en zonder prebiotica) zal worden gedaan.

Cytokinen:

Elke cytokine die lokaal wordt geproduceerd als gevolg van darmontsteking kan in het darmlumen lekken en in de ontlasting verschijnen. Groot inflammatoir infiltraat in het zieke slijmvlies van de darm veroorzaakt verhoogde cytokines in de ontlasting. We zullen cytokine-assays doen om darmontsteking op te sporen. We meten in ontlastingsmonsters Interleukin-10 (IL-10), Transforming Growth Factor-β (TGF-β), Interleukin-2 (IL-2), Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α), Interleukin-17 ( IL-17), Interleukine-22 (IL-22), Interleukine-8 (IL-8), Interleukine-6 ​​(IL-6), Interferon Gamma-Induced Protein 10 (IP-10).

ELISA's voor sCD83, sTLR2:

Een oplosbare vorm van CD83 komt vrij uit geactiveerde dendritische cellen en B-lymfocyten en is detecteerbaar in normale humane sera (Hock et al., 2001). Toll-like receptoren (TLR's) zijn een klasse van patroonherkenningsreceptoren (PRR's) die een sleutelrol spelen bij de aangeboren immuniteit en een specifieke immuunrespons opwekken. sTLR2 is gedetecteerd in menselijke vloeistoffen, zoals plasma, moedermelk, speeksel en vruchtwater, evenals in supernatant van gekweekte monocyten (LeBouder et al., 2003; Kuroishi et al., 2007; Dulay et al., 2009). zal sCD83 en sTLR2 isoleren uit ontlastingsmonsters van ondervoede baby's.

Fecale lipocaline 2:

Dit glycoproteïne wordt in verschillende cellen tot expressie gebracht en is in verband gebracht met primaire en secundaire korrels van menselijke neutrofielen (Roudkenar et al., 2007). Opwaartse regulatie van Lcn-2 wordt waargenomen bij weefselbeschadigende aandoeningen zoals infectie, nierbeschadiging, kanker, colitis ulcerosa en brandwonden waarbij de productie van vrije radicalen plaatsvindt (Chassaing et al., 2012). Lipocaline-2 correleert minder nauw met de neutrofielenmarkers, het kan een complementaire marker zijn voor verstoring of beschadiging van epitheelcellen (Prata et al., 2016). We zullen de test doen voor zowel de ondervoede als de goed gevoede baby's om enterocytschade op te sporen.

Microbiota van moedermelk en HMO-analyse:

Er zijn verschillende onderzoeken waarin moedermelkanalyse (Williams et al., 2017) en de bacteriële gemeenschap in moedermelk (Hunt et al., 2011) werden beoordeeld. In deze studie zal Microbiota-analyse worden gedaan met 16S rDNA-sequentieanalyse. HMO-meting zal worden gedaan om het LnNT-niveau te kennen.

Procedure gegevensverwerking:

• Vragenlijsten worden kort na het interview visueel gescand en gemarkeerd voor omissies, inconsistenties of fouten die onmiddellijk zullen worden aangepakt
• SPSS wordt gebruikt en gegevens worden ingevoerd na het maken van een sjabloon voor elk gegevensinvoerbestand met de juiste logische en consistentiecontroles
• Gegevens worden continu ingevoerd terwijl de gegevens worden gegenereerd in het ziekenhuis en laboratorium
• Gegevens worden gevalideerd door een reeks logische controles en bereikcontroles, die samenvattende statistieken en tabellen opleveren
• Daarnaast wordt 50% CRF (en alle variabelen) gecontroleerd door onderzoeker(s).
• Gegevens worden direct gekopieerd op de harde schijven van twee computers zodra de gegevensverificatie is voltooid.

Steekproefgrootteberekening en resultaat (primaire en secundaire) variabele(n):

Voor de pilootstudie zullen we 18 SAM-baby's per behandelingsarm inschrijven, en nog eens 18 niet-ondervoede kinderen, dus in totaal 72 baby's.

Gegevensanalyse Gegevens worden ingevoerd in de vooraf geteste Clinical Record Forms (CRF's) met behulp van SPSS (versie 20.0, Armonk, NY) en uiteindelijk opgeschoond met herhaalde controle. Om de uitkomst van prebiotische en probiotische suppletie bij onze studiekinderen te kennen voor normaal verdeelde gegevens, zullen we ANOVA uitvoeren en in het geval van een niet-normale verdeling van metingen, zullen gelijkwaardige niet-parametrische tests zoals de Kruskal-Wallis H-test worden gebruikt en passende post hoc Indien nodig wordt er een test gedaan voor de subgroepanalyse. Een waarschijnlijkheid van minder dan 0,05 wordt als statistisch significant beschouwd en de associatiesterkte wordt bepaald door de odds ratio (OR) en 95% betrouwbaarheidsintervallen (BI) te berekenen. Als er een overlijden plaatsvindt, voeren we verbale autopsie uit en evalueren we de bijbehorende factoren van overlijden volgens hetzelfde analytische plan.

Data Safety Monitoring Plan (DSMP) Dataveiligheid Monitoring zal nauwgezet worden uitgevoerd gedurende het onderzoek. Alle formulieren worden na inschrijving en gegevensverzameling door de onderzoeksarts beoordeeld, gevolgd door de supervisor op volledigheid, leesbaarheid en interne consistentie. Toediening van prebiotica en probiotica in het ziekenhuis vindt plaats in aanwezigheid van de onderzoeksarts. Alle aspecten van het verkrijgen, verwerken en interpreteren van specimens zullen ook worden uitgevoerd volgens SOP's.

Samenwerkingsovereenkomsten icddr,b zal de studie uitvoeren in samenwerking met Evolve BioSystems, Inc. USA, een particuliere onderneming die in Californië is opgericht door internationaal gereputeerde academici die onderzoek doen naar het darmmicrobioom van baby's en de cruciale associatie ervan met menselijke moedermelk.