Piloto de un ensayo de prebióticos y probióticos en lactantes pequeños con desnutrición aguda grave

Objetivos específicos:

Evaluar la respuesta del microbioma a la suplementación con probióticos (con y sin prebióticos) en lactantes menores de 6 meses con desnutrición aguda severa y comparar la respuesta del microbioma con lactantes sanos suplementados con probióticos.

Sitio del estudio: El estudio se llevará a cabo en el Hospital Dhaka del Centro Internacional para la Investigación de Enfermedades Diarreicas, Bangladesh (icddr,b). La institución posee una atención clínica bien equipada, así como instalaciones de laboratorio capaces de realizar todas las pruebas clínicas.

Población de estudio:

Grupo 1 (SAM) Grupo 2 (no desnutridos)

Intervención:

Bifidobacterium longum subesp. infantis (EVC001) con y sin suplementos prebióticos durante 28 días se proporcionarán en el estudio.

Hay varios estudios en el mundo en desarrollo donde se usaron prebióticos y probióticos en la desnutrición aguda severa y entre los bebés en riesgo. Seguridad de Bifidobacterium longum subsp. infantis (EVC001) es evidente en la literatura publicada, así como en los informes de seguridad (Smilowitz et al., 2017; Sheridan et al., 2017; Grenov et al., 2017; Panigrahi er al., 2017; Kerac et al., 2009) . El estudio IMPRINT, un ensayo clínico de fase I, determinó la seguridad y la tolerabilidad de complementar a los lactantes amamantados con B. infantis (EVC001) (Smilowitz et al., 2017). La seguridad de los prebióticos (LNnT) fue evaluada por el Panel de Productos Dietéticos, Nutrición y Alergias (NDA) de la EFSA (Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria) y el panel concluyó que el LNnT es seguro para los bebés. La Asociación Científica Internacional de Probióticos y Prebióticos (ISAPP) recomendó que un objetivo atractivo para las intervenciones clínicas conducirá a nuevos enfoques que combatan la desnutrición (Sheridan et al., 2017). Un estudio realizado en Uganda con probióticos en niños hospitalizados con SAM reveló que los probióticos pueden desempeñar un papel en el seguimiento de niños hospitalizados con SAM en la fase ambulatoria, ya que mostró una reducción significativa de la duración de la diarrea (Grenov et al., 2017). En la India rural se observó una reducción significativa de sepsis con cultivo positivo y cultivo negativo e infecciones del tracto respiratorio inferior en bebés con el uso de simbióticos (Kerac et al., 2009). El estudio PRONUT no demostró ningún caso de bacteriemia relacionada con probióticos. La respuesta de la microbiota a los probióticos puede diferir según la dieta o la geografía.

Armas de prueba:

3 brazos de tratamiento para bebés con SAM:

• Placebo (lactosa)
• B. infantis solo (Bif)
• B. infantis + prebiótico Lacto-N-neotetraosa [LNnT] (Bif+prebiótico) Cada brazo se asignará para recibir la dieta de atención estándar (F-75 durante la fase aguda del tratamiento de SAM, F-100 durante la estadía en el hospital para rehabilitación y fórmula infantil estandarizada al alta). La aleatorización para la asignación del tratamiento se realizará en una proporción de 1:1 utilizando la estratificación por edad (2 a 3,9 meses frente a 4 a 6 meses) para garantizar la participación equitativa de los lactantes por grupos de edad. La asignación se logrará mediante el uso de bloques aleatorios permutados de tamaño 3. En total, se inscribirán 54 participantes con 18 bebés (9+9) asignados en cada brazo de tratamiento.

El prebiótico se utilizará en forma de LNnT (Lacto-N-neotetraosa, que se produce por fermentación y es químicamente idéntico al LNnT presente en la leche materna humana. LNnT contiene un enlace específico que B. infantis puede descomponer mientras que otras bacterias no pueden. En el ensayo in vitro, cuando el medio de crecimiento contiene 50 % o más de LNnT, se favorece el crecimiento de B. infantis, pero se inhibe el crecimiento de Bacteroides y E.coli. La distribución de las glicosilhidrolasas necesarias para consumir esta estructura es rara entre Proteobacteria (incluida Campylobacter) en su conjunto y está ausente entre Bacteroides y, por lo tanto, LNnT no debería contribuir a la alimentación cruzada, incluso en ausencia de injerto de B. infantis.

El objetivo de seleccionar a los niños no desnutridos es ver si la microbiota alterada de los bebés con SAM se recupera a un nivel más alto de B. infantis, similar a los niveles observados en bebés sanos amamantados que tienen una enfermedad aguda y son tratados con un antibiótico.

Tamaño de la muestra:

Para el piloto, tendremos 18 bebés por brazo de tratamiento, un total de 54 bebés SAM. También inscribiremos a 18 bebés no desnutridos para el tratamiento abierto de B. infantis. Un total de 72 bebés será la población de estudio para este piloto.

Incluso si los participantes del estudio caen o desarrollan alguna infección adquirida en el hospital o se deterioran, tenemos que completar 18 casos evaluables en cada brazo.

Procedimiento de recopilación de datos de referencia: el médico del estudio examinará los criterios de elegibilidad del estudio a todos los niños con SAM y sin SAM dentro de los grupos de edad definidos. Se invitará a los padres/cuidadores de aquellos que cumplan con los requisitos, en aplicación de los criterios de inclusión y exclusión, a dar su consentimiento para la inscripción de sus hijos en el estudio. Al firmar un consentimiento informado por escrito, después de proporcionar información sobre el estudio y sus intervenciones, explicando los posibles beneficios y riesgos, y la naturaleza voluntaria de la participación junto con el derecho a retirar a los niños en cualquier momento después del consentimiento inicial sin proporcionar ninguna razón, los niños serán inscrito por el médico del estudio. El formulario de registro clínico se utilizará para recopilar información relevante, como el historial médico, incluida la naturaleza y la duración de la enfermedad, la medicación para la enfermedad actual; características sociodemográficas como edad, sexo, religión, edad de los padres con educación, ocupación de los padres, uso de combustible y antecedentes de tabaquismo, ingreso familiar mensual, número de hermanos, etc. También se recopilaría información sobre la práctica de alimentación del niño, como antecedentes de lactancia materna, fórmula u otra alimentación complementaria y estado de inmunización; Se registrarán antecedentes familiares de tuberculosis, infección reciente de las vías respiratorias de cualquier miembro de la familia y antecedentes médicos del niño.

Para el seguimiento a largo plazo, se utilizará un CRF separado para recopilar información sobre el peso, la altura, el MUAC, la alimentación y el historial de comorbilidad. Los asistentes de investigación de campo visitarán las casas de los inscritos y recopilarán la información requerida después de obtener el consentimiento por escrito de los padres o cuidadores.

Administración:

Grupo 1 (niños con SAM): los bebés con SAM elegibles serán tratados para la fase de estabilización en la Unidad de estancia más prolongada del Hospital Dhaka de icddr,b. Se seguirá el protocolo de tratamiento estandarizado para niños con SAM y diarrea (desarrollado en icddr,b y alineado con las pautas de la OMS; Ahmed et al Lancet 1999). Los elementos clave incluyen alimentación inicial de 2 horas con F-75 (la fórmula de inicio recomendada, 130 ml/kg por día), ácido fólico, vitamina A, ampicilina más gentamicina, monitoreo y control de temperatura y glucosa en sangre. Antes de iniciar los antibióticos, se obtendrán muestras de heces de referencia (mediante un catéter fecal si es necesario).

La fase de estabilización dura en promedio 4 días en nuestra experiencia. La finalización de la fase de estabilización se caracteriza por un apetito satisfactorio, sin necesidad de alimentación por sonda nasogástrica, buen estado clínico general, ausencia de diarrea, deshidratación, fiebre, hipotermia o taquipnea.

Los bebés que están estabilizados se transfieren a la NRU al recibir el consentimiento por escrito del cuidador. Los bebés estabilizados se asignarán al azar a los 3 brazos de tratamiento una vez que hayan completado el ciclo de antibióticos de 5 a 7 días. El Dietista Senior del Hospital prepara la dieta (F-100) y los suministros a la URN. F-100 se administra a 130 ml/kg por día cada 2 horas durante los primeros 2 días, y luego se administra cada 3 horas y se aumenta gradualmente en 10 ml en cada porción hasta que quede algo de alimento. Se recomienda la lactancia materna entre tomas. La cantidad de leche materna consumida se estimará mediante el pesaje de prueba de los bebés.

Los cuidadores serán capacitados para brindar estimulación psicosocial a los infantes, actividad que se realiza de manera rutinaria en la URN. Esto se hace hablando o cantando a los bebés, actividad física específica para la edad y jugando con juguetes locales.

Medición de la ingesta de leche materna mediante pesaje de prueba siguiendo el método estándar publicado (Islam et al., 2006):

Recogida de leche materna:

Dado que este estudio investigará el injerto de bifidobacterias que está relacionado con la disponibilidad de HMO en la leche materna, recolectaremos 10 ml de leche materna en condiciones asépticas y se analizará el contenido de HMO.

Este análisis se realizará en laboratorios que tengan un historial de realización de estos ensayos.

Además, también realizaremos análisis de microbiota de muestras de leche materna recolectadas. Esto se debe a que es probable que la microbiota de la leche materna influya en la colonización por otros organismos y en el kilometraje intestinal del lactante.

La leche materna se recolectará del seno entre las 07:00 y las 11:00 h, y se pedirá a las mujeres que no se alimenten ni se extraigan del seno del estudio durante al menos 2 horas antes de la recolección de la muestra. Antes de la recolección de la muestra, se limpiará el seno con un hisopo yodado. Se recolectará una extracción mamaria completa utilizando un kit de recolección estéril de un solo uso (Hygienikit®; Ameda, Cary, IL, EE. UU.) y un extractor de leche eléctrico (Modelo SMR-B-R; Ameda-Egnell, Inc.). La leche se colocará inmediatamente en hielo.

Bif (8.000 millones de CFU/dosis única diaria-), Bif (8.000 millones de CFU/dosis única diaria-) + Prebiótico (1g/6h-4g/día), y placebo (lactosa 625mg) estarán disponibles en formato polvo en sobres contenidos dentro de kits de alimentación marcados con números de código únicos que coinciden con el código de aleatorización de cada bebé. El contenido del sobre se administrará a un lactante una vez al día para sobres de Bif y placebo mezclados con 5 ml de fórmula infantil o leche materna y cada preparación de 200 ml de F-100 se disolverá en un sobre de prebiótico (LNnT). Los cuidadores, pero no el personal del estudio, estarán cegados a la asignación del tratamiento.

La dosis y la dispensación de LNnT se derivarán en última instancia de la revisión de la literatura reciente, así como de la experiencia de los expertos que trabajan en este campo. El objetivo es estimular tanto como sea posible las condiciones naturales de disponibilidad de HMO en la leche materna.

Los kits de alimentación (sobres) que se han asignado a los bebés asignados al azar se refrigerarán o almacenarán congelados hasta que se utilicen mientras el participante esté hospitalizado. Los kits de alimentación que aún no se han asignado a un bebé se almacenarán en un congelador del hospital con control continuo de la temperatura. El probiótico almacenado en el congelador (-20°C ± 5°C) se puede utilizar hasta la fecha de caducidad impresa en el sobre (1 año a partir de la fecha de envasado). Se puede almacenar hasta 31 días en el refrigerador (4°C ± 5°C). El prebiótico (LNnT) es estable a temperatura ambiente, pero se puede almacenar en el refrigerador o congelador con el probiótico.

Grupo 2 (niños no desnutridos): Los bebés elegibles no desnutridos serán tratados según el protocolo del hospital. En definitiva, son ingresados ​​en la Unidad de Larga Estancia o en su caso en la UCI. El hospital ha definido protocolos de tratamiento para diarrea acuosa aguda, neumonía y neumonía grave, diarrea persistente, sepsis grave, trastornos electrolíticos e infecciones adquiridas en el hospital. Los niños serán tratados en el hospital según estos protocolos. Los bebés amamantados exclusivamente continuarán con leche materna. Otros se complementan con fórmula infantil modificada cada 2-3 horas. La cantidad de leche materna consumida se estimará mediante el pesaje de prueba de los bebés. El tratamiento con Bif comenzará el día de la finalización del ciclo de antibióticos y se administrará a los lactantes de la misma manera que en el Grupo 1. El contenido del sobre se mezclará con una cucharadita de fórmula infantil o leche materna y se alimentará al bebé.

Incluso si los participantes del estudio caen o desarrollan alguna infección adquirida en el hospital o se deterioran, tenemos que completar 18 casos evaluables en cada brazo.

El alta hospitalaria:

El alta se realizará si el lactante con MAS ha alcanzado un peso para la longitud >-3, si es posible ≥ -2 Z-score, y en caso de desnutrición edematosa cuando el edema se resuelva y el lactante prospere y esté clínicamente bien. Los lactantes no desnutridos serán dados de alta cuando cumplan con los criterios de alta hospitalaria. Para entonces, los cuidadores habrán sido capacitados para la preparación y administración de alimentos y suplementos.

Seguimiento:

Los asistentes de investigación realizarán un seguimiento de los bebés con SAM mediante visitas domiciliarias dos veces por semana hasta 8 semanas después de la aleatorización. Los bebés no desnutridos recibirán un seguimiento a través de visitas domiciliarias dos veces por semana hasta que se complete la suplementación y luego una vez por semana hasta 6 semanas después de la aleatorización. Durante dichas visitas, se repondrán las raciones de fórmula infantil (para lactantes SAM) y suplementos (ambos grupos), se observará la ingesta real de la dieta o se verificará la cantidad dada y el método de reconstitución, y se registrará la morbilidad en un caso personalizado. formulario de registro. Debido a que el suplemento de B. infantis debe mantenerse fresco para mantener una viabilidad óptima, los asistentes de investigación llevarán el suplemento a las visitas domiciliarias en cajas aisladas o hieleras con hielo o paquetes de gel congelado. Aunque es probable que el suplemento alcance la temperatura ambiente entre visitas, no se espera que la pérdida de viabilidad afecte significativamente la colonización de B. infantis en el intestino. Se proporcionará una nevera en miniatura a cada participante durante el período de estudio y se indicará a cada padre que mantenga el suplemento en estos recipientes hasta su uso.

Los bebés que aún no han alcanzado un peso para la talla ≥ -1 Z-score a las 8 semanas posteriores a la aleatorización (fin de las visitas domiciliarias) pueden continuar llevándolo al icddr,b para pesarlo y medirlo y para recoger las raciones de fórmula. de forma rutinaria hasta que se logre un peso por longitud ≥ -1 Z.

Se llevará a cabo un seguimiento a largo plazo para evaluar la antropometría de los participantes inscritos.

Coleccion de muestra:

Las muestras fecales se recolectarán de la siguiente manera.

• Hisopos de heces (para análisis de microbioma) (13 veces en SAM, 11 veces en no SAM)

  • Al ingreso, previo al tratamiento antibiótico
  • Después de la estabilización, antes de la aleatorización y la suplementación
  • Día 2 de suplementación
  • Día 4 de suplementación
  • Día 7 de suplementación
  • Día 10 de suplementación (o último día en NRU si se da de alta antes)
  • Día 14 de suplementación (en NRU o recogido por asistente de investigación en visita domiciliaria)
  • Día 21 de suplementación (recogido por asistente de investigación en visita domiciliaria)
  • Día 28 de suplementación (recogido por auxiliar de investigación en visita domiciliaria)
  • 1 semana después de la suplementación (recogido por el asistente de investigación en la visita domiciliaria)
  • 2 semanas después de la suplementación (recogido por el asistente de investigación en la visita domiciliaria)
  • 3 semanas después de la suplementación (recogido por el asistente de investigación en la visita domiciliaria): solo SAM
  • 4 semanas después de la suplementación (recogido por el asistente de investigación en la visita domiciliaria): solo SAM

• Trozos de heces o muestras de heces de catéter (para pH y marcadores inflamatorios) en el hospital [solo bebés SAM]:

  • Al ingreso, previo al tratamiento antibiótico
  • Después de la estabilización, antes de la aleatorización y la suplementación
  • Día 7 de suplementación'
  • Día 10 de suplementación (o último día en NRU si se da de alta antes)
  • Día 28 de suplementación (recogida por auxiliar de investigación en visita domiciliaria)
  • 4 semanas posteriores a la suplementación (recopilados por el asistente de investigación en la visita domiciliaria)

• Trozos de heces o muestras de heces de catéter (para pH y marcadores inflamatorios) en el hospital [solo bebés no desnutridos]:

  • Al ingreso, previo al tratamiento antibiótico
  • Después del inicio de la suplementación, al alta hospitalaria
  • Día 28 de suplementación (recogida por auxiliar de investigación en visita domiciliaria)
  • 2 semanas posteriores a la suplementación (recopilados por el asistente de investigación en la visita domiciliaria)

Recogida de muestras de heces en el hospital:

Todos los niños serán evaluados en el Hospital de Dhaka, icddr,b de acuerdo con los criterios de inclusión y exclusión mencionados anteriormente. El personal de investigación examinará a estos niños antes de la administración de un antibiótico. Antes de la recolección de muestras de heces, se obtendrá el consentimiento por escrito del tutor legal.

Las heces deben recogerse recientemente de cada niño. Las muestras deben dividirse en alícuotas inmediatamente en crioviales de 2 ml preetiquetados y en el contenedor (~-70 ⁰C) tan pronto como sea posible después de la recolección, idealmente menos de 15 minutos después de la recolección. Después de la recolección y antes de la alícuota, el recipiente de recolección de heces debe mantenerse en hielo (húmedo). Idealmente, los crioviales se llenarían hasta aproximadamente 2/3 de su capacidad. Dos veces a la semana, estas muestras crioconservadas se transportarán al laboratorio de nivel de bioseguridad en el hospital icddr,b de Dhaka para almacenarlas en un congelador a -80 ⁰C. Para evitar la descongelación, los viales se transferirán del remitente al congelador de -80⁰ lo más rápido posible mientras se transfieren a las cajas del congelador. Estas cajas del congelador no se retirarán del congelador -80⁰ hasta que se entreguen a World Courier para su envío a EE. UU.

Medidas para garantizar la mejor recuperación posible de bacterias y su viabilidad:

1. Los remitentes deben estar completamente cargados antes del día de recolección y se mantendrá un registro de la cantidad de veces que se abrirán.
2. Los transportistas necesitan alrededor de 12 horas después de agregar nitrógeno líquido para cargarse por completo. Por lo tanto, recargaremos (llenaremos) los cargadores al final de cada día y luego desecharemos el nitrógeno líquido restante no absorbido a la mañana siguiente antes de usarlos.
3. Los cargadores se pesarán antes de cargar, después de cargar (es decir, a la mañana siguiente después de verter el N2 no absorbido) y luego nuevamente al final de cada día, para saber cuánto nitrógeno líquido queda en el recipiente. Esto nos permitirá estimar cuánto N2 líquido se necesita cada vez que recargamos y con qué frecuencia se necesita.

Toma de muestras de heces en el Hospital y de la Comunidad:

Las muestras de heces se recolectarán como se menciona en el cronograma. Una vez que los participantes sean dados de alta de la NRU, el hisopo de heces se recolectará dentro de un período de dos días de la hora programada.

Para la recolección de heces, se informará al cuidador principal del niño/participante un día antes de la recolección planificada de heces. Un personal de investigación capacitado recolectará la primera muestra de heces fresca disponible del niño el día del muestreo programado.

Durante la recolección en el Hospital y en la comunidad, el personal de investigación recibirá los tubos de hisopos de heces etiquetados (que contienen tampón de estabilización), hisopos envueltos individualmente (con punto de ruptura), un marcador criogénico y bolsas de plástico.

En el Hospital, se indicará a las madres/cuidadores que notifiquen al personal de investigación tan pronto como el niño defeque. Luego, el personal de investigación hará lo siguiente:

• Limpie el pañal sucio del bebé, recolectando suficiente muestra de heces para cubrir completamente la cabeza del hisopo.
• Coloque el hisopo en el tubo de recolección de tapa verde debidamente etiquetado y rompa la cabeza del hisopo en el punto de ruptura; la cabeza del hisopo permanecerá en el tubo.
• Selle bien el tubo y agítelo enérgicamente para asegurar la distribución de las heces dentro del tampón de estabilización.
• Usando el marcador criogénico provisto (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4000221), escriba la fecha en que se recolectó la materia fecal en la etiqueta del tubo.
• Repita el hisopado con un segundo hisopo limpio y el tubo duplicado con tapa verde.
• Vuelva a colocar los tubos con tapa verde en las bolsas de plástico provistas y guárdelos a temperatura ambiente hasta que los recoja el trabajador de la salud.

Se recopilará información sobre la ingesta de antibióticos para cada participante durante el estudio. En el momento de la recolección de cada muestra, le preguntaremos a la madre u otro cuidador sobre cualquier enfermedad durante los últimos 14 días y si ha sido tratada. La naturaleza del medicamento se verificará mediante la inspección física del medicamento, la prescripción y preguntando el nombre o si el medicamento era un polvo que había que reconstituir.

Toma de muestras de saliva de la madre:

Haremos el "ensayo de fenotipado del estado secretor" en la saliva de las madres para ver el estado secretor de las madres para detectar el estado HMO y vincularlo con la microbiota de los bebés.

Procedimiento de recogida de muestras de saliva

1. Las madres deben lavarse las manos y enjuagarse la boca con agua fría y escupir el agua por completo.
2. Retirarán el muestreador con cuidado de tocar solo el mango.
3. La madre sostendrá el mango del tubo de muestreo de Oracle como si fuera un cepillo de dientes, se lo introducirá en la boca y frotará una esponja contra sus encías durante un minuto. Asegúrate de que la esponja esté completamente saturada.
4. sin tocar la esponja, insertarán la muestra en el tubo original de Oracol, bajarán la esponja y cerrarán la tapa herméticamente.
5. La madre devolverá el tubo de muestra de Oracle al personal del estudio (quien etiquetará y refrigerará los tubos si las muestras no se procesarán el mismo día).

Recolección y transporte de muestras fecales de la comunidad Cada trabajador de salud comunitario capacitado será responsable de cierto número de recolecciones de heces por mes. Ella se comunicará con la madre por teléfono celular y llegará a la casa del niño temprano en la mañana con un cargador de nitrógeno de mesa y recolectará el hisopo de heces.

La recolección inicial de muestras fecales debe hacerse en un recipiente estéril adecuado, después de lo cual el trabajador de campo debe transferir alícuotas más pequeñas de materia fecal (dentro de los 20 minutos posteriores a la defecación) en tubos crioseguros estériles de 2 ml preetiquetados. Las etiquetas de los tubos deben incluir como mínimo la identificación de la muestra del participante (SID) y la fecha de recolección.

Usando guantes de látex limpios y desechables, los trabajadores de la salud llenarán cada vial criogénico de 2 ml aproximadamente de la mitad a dos tercios con una espátula esterilizada y taparán herméticamente. No se agregarán a la muestra tampones, conservantes ni aditivos. Se tomarán precauciones durante el uso de viales con tapón de rosca y no se sobrellenarán, ya que esto minimizará la posibilidad de contaminación cruzada de las muestras durante el transporte y el almacenamiento.

Luego, colocarán los viales tapados en "cargadores secos" precargados con nitrógeno líquido inmediatamente para transportarlos de regreso al laboratorio. Aunque es difícil, las muestras deben transferirse a contenedores secos dentro de los 20 minutos posteriores a la defecación. En el laboratorio, el personal capacitado vaciará los viales del contenedor seco en un cubo de hielo seco para evitar que se descongelen mientras clasifica y transfiere los viales a cajas de congelación de 9x9 para un almacenamiento y transporte a largo plazo.

Informes:

La información se registrará en el Formulario de recolección de campo de heces (SFC).

Investigaciones:

Pruebas realizadas en icddrb:

• determinar el pH fecal en el laboratorio del hospital
• Pruebas de niveles de mieloperoxidasa y otros biomarcadores en muestras fecales

Pruebas realizadas por Evolve Biosystems:

• Secuenciación de última generación, metagenómica y análisis q PCR de muestras
• Pruebas relacionadas con la inmunidad: análisis multiplex de citocinas/analitos inflamatorios y relacionados con la inmunidad
• IL-10, TGF beta, IL-2, TNF alfa, IL-17, IL-22, IL-8, IL-6, IP-10
• ELISA para sCD83, sTLR2 y lipocalina 2 fecal

Taburete PH:

El pH de las heces se medirá para evaluar el cambio desde el inicio en el pH de las heces durante la suplementación.

Mieloperoxidasa:

La mieloperoxidasa es un marcador específico de la actividad de los neutrófilos. Se eligió porque no está elevado en la leche materna o en las heces de los niños amamantados como lo están la lactoferrina y la calprotectina (Dorosko et al., 2008) y los niveles de MPO en las heces se han correlacionado con la actividad de la enfermedad en la enfermedad inflamatoria intestinal evaluada tanto por endoscopia y parámetros bioquímicos (SAIKI T, 1998). El estudio MAL-ED ya ha demostrado el papel de la MPO como marcador de la función intestinal (McCormick et al., 2017).

Mediremos la concentración de este biomarcador mediante un ELISA comercial.

Secuenciación de próxima generación: En los últimos años, se han establecido varias tecnologías de secuenciación de próxima generación (Shendure & Ji, 2008) que además permiten analizar una gran cantidad de microorganismos en diferentes entornos (Tringe et al., 2005) y el cuerpo humano. (Ding & Schloss, 2014, incluido el intestino humano (Methé et al., 2012).

El análisis de secuencias de 16S rDNA y la metagenómica son dos técnicas eficaces de secuenciación de ADN, y ambas se han utilizado para estudiar comunidades microbianas intestinales no cultivadas. El análisis de la secuencia del ADNr 16S se centra en la secuenciación del gen del ADNr 16S conservado presente en todos los microbios (Woese & Fox, 1977) y ha establecido una serie de conexiones novedosas entre la composición de la microbiota intestinal y la enfermedad (Blaser et al., 2013). La investigación basada en la secuencia 16S rDNA es una técnica para revelar "¿quién está ahí?" en una comunidad microbiana determinada, mientras que la secuenciación metagenómica de escopeta podrá responder a la pregunta complementaria de "¿qué pueden hacer?" (Lepage et al., 2012). Se realizará la secuenciación de próxima generación para detectar el injerto del organismo, especialmente B. infantis, después de la intervención en bebés gravemente desnutridos y compararlo con niños bien nutridos.

Metagenómica:

La metagenómica fue descrita por primera vez en 1998 por Handelsman y Rodon (Handelsman et al., 1998) y se convirtió en otro enfoque de secuenciación de ADN para estudiar la comunidad microbiana intestinal compleja. Su objetivo es catalogar todos los genes de una comunidad mediante la secuenciación aleatoria de todo el ADN extraído de la muestra (Qin et al., 2010). En primer lugar, el ADN total de todos los microorganismos se extrae de muestras fecales. Antes de ser secuenciadas, las muestras de ADN total se cortan al azar mediante un enfoque de "escopeta". Luego, las secuencias completas se analizan para obtener perfiles de especies basados ​​en marcadores filogenéticos (16S rDNA) (Sunagawa et al., 2010) o perfiles genómicos basados ​​en genomas completos (Tringe et al., 2005). La metagenómica desempeña un papel en la comprensión del microbioma intestinal humano, incluida la diversidad del microbioma intestinal, la identificación de nuevos genes y la determinación de la etiología de la disbiosis funcional (Wang et al., 2015). Se realizará la composición inicial de la microbiota intestinal (análisis metagenómico) y la colonización de Bifidobacterium (abundancia relativa) mediante análisis metagenómico durante/después de la suplementación.

qPCR: la PCR en tiempo real se realizará para la detección cuantitativa del organismo en el ADN extraído directamente de la muestra de heces. Se realizará la colonización de B. infantis por qPCR durante y después de la suplementación (con y sin prebióticos).

Citocinas:

Cualquier citocina que se produzca localmente como resultado de la inflamación intestinal puede filtrarse a la luz intestinal y aparecer en las heces. Un gran infiltrado inflamatorio en la mucosa intestinal enferma provoca un aumento de citocinas en las heces. Haremos ensayos de citoquinas para detectar inflamación intestinal. Mediremos en muestras de heces Interleucina-10 (IL-10), Factor de crecimiento transformante-β (TGF-β), Interleucina-2 (IL-2), Factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), Interleucina-17 ( IL-17), interleucina-22 (IL-22), interleucina-8 (IL-8), interleucina-6 (IL-6), proteína 10 inducida por interferón gamma (IP-10).

ELISA para sCD83, sTLR2:

Una forma soluble de CD83 se libera de las células dendríticas activadas y los linfocitos B y es detectable en sueros humanos normales (Hock et al., 2001). Los receptores tipo Toll (TLR) son una clase de receptores de reconocimiento de patrones (PRR) que desempeñan un papel clave en la inmunidad innata y desencadenan una respuesta inmunitaria específica. Se ha detectado sTLR2 en fluidos humanos, como plasma, leche materna, saliva y líquido amniótico, así como en sobrenadantes de monocitos cultivados (LeBouder et al., 2003; Kuroishi et al., 2007; Dulay et al., 2009). aislará sCD83 y sTLR2 de muestras de heces de bebés desnutridos.

Lipocalina fecal 2:

Esta glicoproteína se expresa en varias células y se ha asociado con gránulos primarios y secundarios de neutrófilos humanos (Roudkenar et al., 2007). La regulación al alza de Lcn-2 se observa en condiciones que dañan los tejidos, como infecciones, lesiones renales, cáncer, colitis ulcerosa y lesiones por quemaduras, donde se produce la producción de radicales libres (Chassaing et al., 2012). Lipocalin-2 se correlaciona menos estrechamente con los marcadores de neutrófilos, puede proporcionar un marcador complementario de alteración o daño de células epiteliales (Prata et al., 2016). Haremos la prueba tanto para los bebés desnutridos como para los bien alimentados para detectar daños en los enterocitos.

Microbiota de leche materna y análisis HMO:

Hay varios estudios donde se evaluaron el análisis de la leche materna (Williams et al., 2017) y la comunidad bacteriana en la leche materna (Hunt et al., 2011). En este estudio, el análisis de microbiota se realizará con análisis de secuencia de ADNr 16S. La medición de HMO se realizará para conocer el nivel de LnNT.

Procedimiento de procesamiento de datos:

• Los cuestionarios se escanearán visualmente poco después de la entrevista y se marcarán por omisiones, inconsistencias o errores que se abordarán de inmediato.
• Se usará SPSS y los datos se ingresarán después de crear una plantilla para cada archivo de ingreso de datos con controles lógicos y de consistencia apropiados.
• Los datos se ingresarán continuamente a medida que se generen en el hospital y el laboratorio.
• Los datos se validarán mediante una serie de controles lógicos y de rango, produciendo estadísticas y tablas de resumen.
• Además, los investigadores comprobarán el 50 % del CRF (y todas las variables).
• Los datos se copiarán inmediatamente en los discos duros de dos computadoras tan pronto como se complete la verificación de datos.

Cálculo del tamaño de la muestra y variable(s) de resultado (primaria y secundaria):

Para el estudio piloto, inscribiremos a 18 bebés SAM por brazo de tratamiento y 18 niños adicionales sin desnutrición, por lo tanto, un total de 72 bebés.

Análisis de datos Los datos se ingresarán en los formularios de registro clínico (CRF) previamente probados utilizando SPSS (versión 20.0, Armonk, NY) y finalmente se limpiarán con verificación repetida. Para conocer el resultado de la suplementación con prebióticos y probióticos en los niños de nuestro estudio para datos distribuidos normalmente, realizaremos ANOVA y, en caso de distribución no normal de las mediciones, se utilizarán pruebas no paramétricas equivalentes como la prueba H de Kruskal-Wallis y post hoc apropiados. se realizará una prueba para el análisis de subgrupos, si es necesario. Una probabilidad inferior a 0,05 se considerará estadísticamente significativa y la fuerza de la asociación se determinará mediante el cálculo de la razón de posibilidades (OR) y los intervalos de confianza (IC) del 95 %. Si ocurre alguna muerte, realizaremos una autopsia verbal y evaluaremos los factores asociados de muerte mediante el mismo plan analítico.

Plan de Monitoreo de la Seguridad de los Datos (DSMP) El monitoreo de la seguridad de los datos se realizará de manera rigurosa a lo largo del curso del estudio. Todos los formularios serán revisados ​​por el médico del estudio después de la inscripción y la recopilación de datos, seguido por el supervisor para comprobar que estén completos, legibles y coherentes internamente. La administración de prebióticos y probióticos en el hospital se realizará en presencia del médico del estudio. Todos los aspectos del acceso, el procesamiento y la interpretación de muestras también se realizarán de acuerdo con los SOP.

Acuerdos de colaboración icddr,b realizará el estudio en colaboración con Evolve BioSystems, Inc. USA, una empresa privada establecida en California por académicos de renombre internacional que investigan el microbioma intestinal infantil y su asociación crítica con la leche materna humana.