Pilota di una sperimentazione di prebiotici e probiotici in bambini piccoli con grave malnutrizione acuta

Obiettivi specifici:

Valutare la risposta del microbioma all'integrazione di probiotici (con e senza prebiotici) in bambini di età inferiore a 6 mesi con malnutrizione acuta grave e confrontare la risposta del microbioma con neonati sani integrati con probiotici.

Sito dello studio: lo studio sarà condotto presso l'ospedale di Dhaka dell'International Center for Diarrheal Disease Research, Bangladesh (icddr, b). L'istituto possiede un'assistenza clinica ben attrezzata e strutture di laboratorio in grado di eseguire tutti i test clinici.

Popolazione studiata:

Gruppo 1 (SAM) Gruppo 2 (non malnutriti)

Intervento:

Bifidobacterium longum subsp. infantis (EVC001) con e senza integrazione prebiotica per 28 giorni sarà fornito nello studio.

Esistono diversi studi nel mondo in via di sviluppo in cui sono stati utilizzati prebiotici e probiotici nella malnutrizione acuta grave e tra i bambini a rischio. Sicurezza di Bifidobacterium longum subsp. infantis (EVC001) è evidente dalla letteratura pubblicata e dai rapporti sulla sicurezza (Smilowitz et al., 2017; Sheridan et al., 2017; Grenov et al., 2017; Panigrahi er al., 2017; Kerac et al., 2009) . Lo studio IMPRINT, uno studio clinico di fase I, ha determinato la sicurezza e la tollerabilità dell'integrazione di B. infantis nei neonati allattati al seno (EVC001) (Smilowitz et al., 2017). La sicurezza del prebiotico (LNnT) è stata valutata dal gruppo di esperti scientifici sui prodotti dietetici, la nutrizione e le allergie (NDA) dell'EFSA (Autorità europea per la sicurezza alimentare) e il gruppo ha concluso che il LNnT è sicuro per i neonati. L'International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics (ISAPP) ha raccomandato che un obiettivo attraente per gli interventi clinici porterà a nuovi approcci che combattono la malnutrizione (Sheridan et al., 2017). Uno studio condotto in Uganda sull'utilizzo di probiotici nei bambini SAM ospedalizzati ha rivelato che il probiotico può avere un ruolo nel follow-up dei bambini ospedalizzati con SAM in fase ambulatoriale poiché ha mostrato una significativa riduzione della durata della diarrea (Grenov et al., 2017). Nell'India rurale è stata osservata una significativa riduzione della sepsi con coltura positiva e negativa e delle infezioni del tratto respiratorio inferiore nei neonati con l'uso di simbiotici (Kerac et al., 2009). Lo studio PRONUT non ha dimostrato alcun caso di batteriemia correlata ai probiotici. La risposta del microbiota ai probiotici può variare in base alla dieta o all'area geografica.

Armi di prova:

3 bracci di trattamento per neonati con SAM:

• Placebo (lattosio)
• B. infantis da solo (Bif)
• B. infantis + prebiotico Lacto-N-neotetraose [LNnT] (Bif+prebiotico) Ogni braccio sarà assegnato a ricevere la dieta standard di cura (F-75 durante il trattamento della fase acuta della SAM, F-100 durante la degenza ospedaliera per nutrizionale riabilitazione e latte artificiale standardizzato alla dimissione). La randomizzazione per l'assegnazione del trattamento sarà effettuata in rapporto 1:1 utilizzando la stratificazione per età (2-3,9 mesi vs. 4-6 mesi) per garantire un'equa partecipazione dei bambini per gruppi di età. L'assegnazione sarà ottenuta utilizzando una dimensione di blocchi permutati casuali di 3. In totale 54 partecipanti saranno arruolati con 18 neonati (9+9) assegnati in ciascun braccio di trattamento.

Il prebiotico sarà utilizzato sotto forma di LNnT (Lacto-N-neotetraose, che è prodotto dalla fermentazione ed è chimicamente identico al LNnT presente nel latte materno umano. LNnT contiene un legame specifico che B. infantis può abbattere mentre altri batteri no. Nel saggio in vitro, quando il terreno di crescita contiene il 50% o più di LNnT, la crescita di B. infantis è supportata, ma la crescita di Bacteroides ed E.coli è inibita. La distribuzione delle glicosilidrolasi necessarie per consumare questa struttura è rara tra i Proteobacteria (compreso il Campylobacter) nel suo complesso e assente tra i Bacteroides e quindi LNnT non dovrebbe contribuire all'alimentazione incrociata, anche in assenza di attecchimento di B. infantis.

Lo scopo della selezione dei bambini non malnutriti è vedere se il microbiota interrotto dei neonati SAM recupera a livelli più elevati di B. infantis, simili a quei livelli osservati nei neonati sani allattati al seno che hanno una malattia acuta e sono trattati con un antibiotico.

Misura di prova:

Per il progetto pilota, avremo 18 neonati per braccio di trattamento, per un totale di 54 neonati SAM. Arruolaremo anche 18 bambini non malnutriti per il trattamento in aperto di B. infantis. Un totale di 72 bambini sarà la popolazione di studio per questo progetto pilota.

Anche se i partecipanti allo studio abbandonano o sviluppano un'infezione acquisita in ospedale o peggiorano, dobbiamo completare 18 casi valutabili in ciascun braccio.

Procedura di raccolta dei dati di riferimento: tutti i bambini SAM e non SAM all'interno dei gruppi di età definiti saranno sottoposti a screening per i criteri di ammissibilità allo studio dal medico dello studio. I genitori/tutori assistenti di coloro che soddisfano l'idoneità, in applicazione dei criteri di inclusione ed esclusione, saranno invitati a fornire il proprio consenso per l'iscrizione dei propri figli allo studio. Dopo aver firmato un consenso informato scritto, dopo aver fornito informazioni sullo studio e sui suoi interventi, spiegando i possibili benefici e rischi, e la natura volontaria della partecipazione insieme al diritto di ritirare i bambini in qualsiasi momento dopo il consenso iniziale senza fornire alcuna motivazione, i bambini saranno iscritti dal medico dello studio. Il modulo di registrazione clinica verrà utilizzato per raccogliere informazioni pertinenti come la storia medica, inclusa la natura e la durata della malattia, i farmaci per la malattia in corso; caratteristiche socio-demografiche come età, sesso, religione, età dei genitori con istruzione, occupazione dei genitori, consumo di carburante e storia del fumo, reddito familiare mensile, numero di fratelli, ecc. Verrebbero inoltre raccolte informazioni sulla pratica di alimentazione del bambino, come la storia dell'allattamento al seno, la formula o altra alimentazione complementare e lo stato di immunizzazione; la storia familiare di tubercolosi, la recente infezione del tratto respiratorio di qualsiasi membro della famiglia e la storia medica passata del bambino verrebbero registrate.

Per il follow-up a lungo termine verrà utilizzato un CRF separato per raccogliere informazioni su peso, altezza, MUAC, alimentazione e anamnesi di comorbilità. Gli assistenti per la ricerca sul campo visiteranno le case degli iscritti e raccoglieranno le informazioni richieste dopo aver ottenuto il consenso scritto dei genitori o del caregiver.

Gestione:

Gruppo 1 (bambini con SAM): i neonati SAM idonei saranno trattati per la fase di stabilizzazione nell'Unità per soggiorni più lunghi dell'ospedale di Dhaka dell'icddr,b. Verrà seguito il protocollo di trattamento standardizzato per i bambini con SAM e diarrea (sviluppato presso icddr,be allineato alle linee guida dell'OMS; Ahmed et al Lancet 1999). Gli elementi chiave includono inizialmente l'alimentazione ogni 2 ore con F-75 (la formula iniziale raccomandata, 130 ml/kg al giorno), acido folico, vitamina A, ampicillina più gentamicina, monitoraggio e controllo della temperatura e della glicemia. Prima dell'inizio degli antibiotici, verranno prelevati campioni di feci di base (tramite catetere fecale se necessario).

La fase di stabilizzazione dura in media 4 giorni nella nostra esperienza. Il completamento della fase di stabilizzazione è caratterizzato da un appetito soddisfacente, nessuna necessità di alimentazione con sondino nasogastrico, buone condizioni cliniche generali, assenza di diarrea, disidratazione, febbre, ipotermia o tachipnea.

I neonati stabilizzati vengono trasferiti al NRU dopo aver ricevuto il consenso scritto da parte del caregiver. I neonati stabilizzati verranno randomizzati ai 3 bracci di trattamento una volta completato il ciclo di antibiotici di 5-7 giorni. Il dietologo senior dell'ospedale prepara la dieta (F-100) e rifornisce l'NRU. L'F-100 viene erogato a 130 ml/kg al giorno ogni 2 ore per i primi 2 giorni, e successivamente somministrato ogni 3 ore e gradualmente aumentato di 10 ml ad ogni dose fino a quando non rimane del mangime. L'allattamento al seno è incoraggiato tra le poppate. La quantità di latte materno consumato sarà stimata mediante test di pesatura dei neonati.

Gli operatori sanitari saranno addestrati a fornire stimoli psicosociali ai bambini, un'attività che viene svolta di routine nell'NRU. Questo viene fatto parlando o cantando ai bambini, facendo attività fisica specifica per età e giocando con i giocattoli locali.

Misurazione dell'assunzione di latte materno mediante test di pesatura seguendo il metodo standard pubblicato (Islam et al., 2006):

Raccolta del latte materno:

Poiché questo studio esaminerà l'attecchimento dei bifidobatteri che è collegato alla disponibilità di HMO nel latte materno, raccoglieremo 10 ml di latte materno in condizioni asettiche e ne verrà analizzato il contenuto di HMO.

Questa analisi sarà eseguita in laboratori che hanno una comprovata esperienza nell'esecuzione di questi test.

Inoltre, eseguiremo anche l'analisi del microbiota dei campioni di latte materno raccolti. Questo perché è probabile che il microbiota del latte materno influenzi la colonizzazione da parte di altri organismi e il chilometraggio intestinale del neonato.

Il latte materno verrà raccolto dal seno tra le 07:00 e le 11:00 e alle donne verrà chiesto di non nutrirsi o spremere dal seno dello studio per almeno 2 ore prima della raccolta del campione. Prima della raccolta del campione, il seno verrà pulito con un tampone di iodio. Un'espressione completa del seno verrà raccolta utilizzando un kit di raccolta sterile monouso (Hygienikit®; Ameda, Cary, IL, USA) e un tiralatte elettrico (modello SMR-B-R; Ameda-Egnell, Inc.). Il latte verrà immediatamente messo in ghiaccio.

Bif (8 miliardi di CFU/dose singola giornaliera-), Bif (8 miliardi di CFU/dose singola giornaliera-) + Prebiotico (1gm/6ogni ora-4gm/giorno) e placebo (625mg di lattosio) saranno disponibili in formato polvere in bustine contenute all'interno di kit di alimentazione contrassegnati con numeri di codice univoci che corrispondono al codice di randomizzazione di ciascun neonato. Il contenuto della bustina verrà somministrato a un neonato una volta al giorno per bustine Bif e placebo miscelate con 5 ml di latte artificiale o latte materno e ogni preparazione di 200 ml di F-100 verrà sciolta una bustina prebiotica (LNnT). Gli operatori sanitari, ma non il personale dello studio, saranno all'oscuro dell'assegnazione del trattamento.

La dose e l'erogazione di LNnT saranno infine derivate dalla revisione della letteratura recente e dall'esperienza di esperti che lavorano in questo campo. L'obiettivo è quello di stimolare il più possibile le condizioni naturali di disponibilità di HMO nel latte materno.

I kit di alimentazione (bustine) che sono stati assegnati ai neonati randomizzati verranno refrigerati o conservati congelati fino all'utilizzo mentre il partecipante è ricoverato in ospedale. I kit di alimentazione che non sono ancora stati assegnati a un bambino verranno conservati in un congelatore ospedaliero con monitoraggio continuo della temperatura. Il probiotico conservato in freezer (-20°C ± 5°C) può essere utilizzato fino alla data di scadenza stampata sulla bustina (1 anno dalla data di confezionamento). Può essere conservato fino a 31 giorni in frigorifero (4°C ± 5°C). Il prebiotico (LNnT) è stabile a temperatura ambiente, ma può essere conservato in frigorifero o nel congelatore con il probiotico.

Gruppo 2 (bambini non malnutriti): i neonati non malnutriti idonei saranno trattati secondo il protocollo ospedaliero. In breve, vengono ricoverati nel reparto di lunga degenza o, se necessario, in terapia intensiva. L'ospedale ha definito protocolli di trattamento per diarrea acquosa acuta, polmonite e polmonite grave, diarrea persistente, sepsi grave, disturbi elettrolitici e infezioni nosocomiali. I bambini saranno curati in ospedale secondo questi protocolli. I bambini allattati esclusivamente al seno continueranno con il latte materno. Altri sono integrati con latte artificiale modificato ogni 2-3 ore. La quantità di latte materno consumato sarà stimata mediante test di pesatura dei neonati. Il trattamento con Bif inizierà il giorno del completamento del ciclo di antibiotici e sarà somministrato ai neonati con le stesse modalità del Gruppo 1. Il contenuto della bustina verrà miscelato con un cucchiaino di latte artificiale o latte materno e somministrato al neonato.

Anche se i partecipanti allo studio abbandonano o sviluppano un'infezione acquisita in ospedale o peggiorano, dobbiamo completare 18 casi valutabili in ciascun braccio.

Dimissione dall'ospedale:

La dimissione sarà effettuata se il bambino con SAM ha raggiunto un peso per lunghezza >-3, se possibile ≥ -2 Z-score, e in caso di malnutrizione edematosa quando l'edema si risolve e quando il bambino sta bene e sta bene clinicamente. I neonati non malnutriti verranno dimessi quando soddisfano i criteri di dimissione dall'ospedale. A quel punto gli operatori sanitari saranno stati formati per la preparazione e la somministrazione di alimenti e integratori.

Azione supplementare:

I neonati con SAM saranno seguiti attraverso visite domiciliari da assistenti di ricerca due volte alla settimana fino a 8 settimane dopo la randomizzazione. I bambini non malnutriti saranno seguiti attraverso visite domiciliari due volte alla settimana fino al completamento dell'integrazione e poi una volta alla settimana fino a 6 settimane dopo la randomizzazione. Durante tali visite verranno reintegrate le razioni di latte artificiale (per neonati SAM) e integratori (entrambi i gruppi), si osserverà l'effettivo apporto della dieta o si verificherà la quantità data e il metodo di ricostituzione e la morbilità registrata su un caso personalizzato modulo di registrazione. Poiché il supplemento B. infantis deve essere mantenuto fresco per mantenere una vitalità ottimale, gli assistenti di ricerca porteranno il supplemento alle visite domiciliari in scatole isolate o dispositivi di raffreddamento con ghiaccio o gel congelati. Sebbene il supplemento si riscaldi probabilmente a temperatura ambiente tra una visita e l'altra, non si prevede che la perdita di vitalità avrà un impatto significativo sulla colonizzazione di B. infantis nell'intestino. A ciascun partecipante verrà fornito un frigorifero in miniatura per il periodo di studio e ciascun genitore sarà incaricato di conservare l'integratore in questi contenitori fino al momento dell'utilizzo.

I neonati che non hanno ancora raggiunto un punteggio Z di peso per lunghezza ≥ -1 entro 8 settimane dopo la randomizzazione (fine delle visite domiciliari) possono continuare a portare il bambino all'icddr,b per pesare e misurare e per ritirare le razioni di formula su base routinaria fino al raggiungimento di un peso per lunghezza ≥ -1 Z.

Verrà effettuato un follow-up a lungo termine per valutare l'antropometria dei partecipanti iscritti.

Raccolta campioni:

I campioni fecali saranno raccolti come segue.

• Tamponi fecali (per l'analisi del microbioma) (13 volte in SAM, 11 volte in non SAM)

  • Al momento del ricovero, prima del trattamento antibiotico
  • Dopo la stabilizzazione, prima della randomizzazione e dell'integrazione
  • Giorno 2 di integrazione
  • Giorno 4 di integrazione
  • Giorno 7 di integrazione
  • Giorno 10 di integrazione (o ultimo giorno in NRU se dimesso prima)
  • Giorno 14 di integrazione (in NRU o ritirato dall'assistente di ricerca alla visita domiciliare)
  • Giorno 21 di integrazione (raccolto dall'assistente di ricerca alla visita domiciliare)
  • Giorno 28 di integrazione (raccolto dall'assistente di ricerca alla visita domiciliare)
  • 1 settimana dopo l'integrazione (ritirata dall'assistente di ricerca durante la visita domiciliare)
  • 2 settimane dopo l'integrazione (raccolte dall'assistente di ricerca durante la visita domiciliare)
  • 3 settimane dopo l'integrazione (raccolte dall'assistente di ricerca alla visita domiciliare): solo SAM
  • 4 settimane dopo l'integrazione (raccolte dall'assistente di ricerca alla visita domiciliare): solo SAM

• Pezzi di feci o campioni fecali da catetere (per pH e marcatori infiammatori) in ospedale [solo neonati SAM]:

  • Al momento del ricovero, prima del trattamento antibiotico
  • Dopo la stabilizzazione, prima della randomizzazione e dell'integrazione
  • Giorno 7 di integrazione'
  • Giorno 10 di integrazione (o ultimo giorno in NRU se dimesso prima)
  • Giorno 28 di integrazione (raccolto dall'assistente di ricerca alla visita domiciliare)
  • 4 settimane dopo l'integrazione (raccolte dall'assistente di ricerca durante la visita domiciliare)

• Pezzi di feci o campioni fecali da catetere (per pH e marcatori infiammatori) in ospedale [solo neonati non malnutriti]:

  • Al momento del ricovero, prima del trattamento antibiotico
  • Dopo l'inizio della supplementazione, alla dimissione dall'ospedale
  • Giorno 28 di integrazione (raccolto dall'assistente di ricerca alla visita domiciliare)
  • 2 settimane dopo l'integrazione (raccolte dall'assistente di ricerca durante la visita domiciliare)

Raccolta di campioni di feci in ospedale:

Tutti i bambini saranno sottoposti a screening dall'ospedale di Dhaka, icddr, b secondo i criteri di inclusione ed esclusione sopra menzionati. Il personale di ricerca esaminerà questi bambini prima della somministrazione di un antibiotico. Prima della raccolta dei campioni di feci sarà richiesto il consenso scritto del tutore legale.

Le feci dovrebbero essere appena raccolte da ogni bambino. I campioni devono essere aliquotati immediatamente in crioviali da 2 ml pre-etichettati e nello spedizioniere (~-70⁰C) il più rapidamente possibile dopo la raccolta, idealmente meno di 15 minuti dopo la raccolta. Dopo la raccolta e prima dell'aliquotazione, il recipiente di raccolta delle feci deve essere mantenuto su ghiaccio (umido). Idealmente i crioviali dovrebbero essere riempiti fino a circa 2/3. Due volte alla settimana questi campioni crioconservati saranno trasportati al Biosafety Level Laboratory dell'icddr,b Dhaka Hospital per essere conservati in un congelatore a -80⁰C. Per evitare lo scongelamento, le fiale verranno trasferite dallo spedizioniere al congelatore a -80⁰ il più rapidamente possibile durante il trasferimento nelle scatole del congelatore. Queste scatole per congelatore non verranno rimosse dal congelatore -80⁰ fino a quando non saranno consegnate a World Courier per la spedizione negli Stati Uniti.

Misure per garantire il miglior recupero possibile dei batteri e la loro vitalità:

1. I mittenti dovrebbero essere completamente addebitati prima del giorno del ritiro e verrà mantenuto un registro per il numero di volte in cui verranno aperti.
2. I caricatori hanno bisogno di circa 12 ore dopo l'aggiunta di azoto liquido per essere completamente caricati. Pertanto, ricarichiamo (riempiamo) i caricatori alla fine di ogni giornata e poi scarichiamo l'azoto liquido non assorbito rimanente la mattina successiva prima di utilizzarli.
3. I caricatori verranno pesati prima della ricarica, dopo la ricarica (ovvero la mattina successiva dopo aver scaricato l'eventuale N2 non assorbito) e poi di nuovo alla fine di ogni giornata, per sapere quanto azoto liquido rimane nel contenitore. Questo ci consentirà di stimare la quantità di N2 liquido necessaria ogni volta che ricarichiamo e con quale frequenza.

Raccolta dei tamponi fecali in Ospedale e dalla Comunità:

I campioni di feci saranno raccolti come indicato nell'orario. Una volta che i partecipanti vengono dimessi dall'NRU, il tampone fecale verrà raccolto entro una finestra di due giorni dall'orario programmato.

Per la raccolta delle feci, l'assistente principale del bambino/partecipante verrà informato un giorno prima della raccolta programmata delle feci. Uno staff di ricerca qualificato raccoglierà il primo campione di feci fresche disponibile dal bambino il giorno del campionamento programmato.

Durante la raccolta in ospedale e nella comunità, al personale di ricerca verranno fornite le provette per tamponi fecali etichettate (contenenti tampone di stabilizzazione), tamponi confezionati singolarmente (con punto di rottura), un pennarello criogenico e sacchetti di plastica.

In Ospedale, le madri/tutrici saranno incaricate di avvisare il personale di ricerca non appena il bambino defeca. Quindi il personale di ricerca farà quanto segue:

• Tamponare il pannolino sporco del bambino, raccogliendo abbastanza campione di feci per ricoprire interamente la testa del tampone.
• Posizionare il tampone nella provetta di raccolta opportunamente etichettata con il tappo verde e staccare la testa del tampone in corrispondenza del punto di rottura: la testa del tampone rimarrà nella provetta.
• Sigillare bene la provetta e agitare vigorosamente per garantire la distribuzione delle feci all'interno del tampone di stabilizzazione.
• Utilizzando il marcatore criogenico fornito (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4000221), scrivere la data di raccolta delle feci sull'etichetta della provetta.
• Ripetere il tampone con un secondo tampone pulito e la provetta duplicata con il tappo verde.
• Riporre le provette con il tappo verde nelle buste di plastica fornite e conservarle a temperatura ambiente fino al momento del prelievo da parte dell'operatore sanitario.

Le informazioni sull'assunzione di antibiotici saranno raccolte per ciascun partecipante durante lo studio. Al momento di ogni raccolta di campioni, chiederemo alla madre o ad altro assistente qualsiasi malattia negli ultimi 14 giorni e se curata. La natura del medicinale sarà verificata mediante ispezione fisica del medicinale, la prescrizione e chiedendo il nome o se il medicinale fosse una polvere che doveva essere ricostituita.

Raccolta di campioni di saliva dalla madre:

Faremo il "test di fenotipizzazione dello stato del secretore" nella saliva delle madri per vedere lo stato del secretore delle madri per rilevare lo stato HMO e il collegamento con il microbiota dei neonati.

Procedura di raccolta del campione di saliva

1. Le madri dovrebbero lavarsi le mani e sciacquarsi la bocca con acqua fredda e sputare completamente l'acqua.
2. Toglieranno il campionatore facendo attenzione a toccare solo la maniglia.
3. La madre terrà il manico del tubo di campionamento Oracle come uno spazzolino da denti e lo inserirà nella sua bocca e strofinerà una spugna contro le sue gengive per un minuto. Assicurarsi che la spugna sia completamente satura.
4. senza toccare la spugna, inseriranno il campionatore nella provetta Oracol originale, la spugna verso il basso e chiuderanno bene il coperchio.
5. La madre restituirà la provetta del campionatore Oracle al personale dello studio (che etichetterà e conserverà in frigorifero le provette se i campioni non verranno processati lo stesso giorno).

Raccolta e trasporto di campioni fecali dalla comunità Ogni operatore sanitario di comunità addestrato sarà responsabile di un certo numero di raccolte di feci al mese. Contatterà la madre al cellulare e arriverà a casa del bambino la mattina presto con un caricatore di azoto da banco e ritirerà il tampone delle feci.

La raccolta iniziale dei campioni fecali deve essere effettuata in un contenitore sterile adatto, dopodiché piccole aliquote di materiale fecale devono essere trasferite dall'operatore sul campo (entro 20 minuti dalla defecazione) in provette crio-sicure da 2 ml sterili pre-etichettate. Le etichette delle provette devono includere almeno l'ID campione (SID) del partecipante e la data del prelievo.

Indossando guanti in lattice monouso puliti, gli operatori sanitari riempiranno ciascuna crio-fiala da 2 ml per circa metà o due terzi usando una spatola sterile e chiudendo bene il tappo. Eventuali tamponi, conservanti o additivi non verranno aggiunti al campione. Verranno prese precauzioni durante l'uso di fiale con tappo a vite e non riempirle eccessivamente in quanto ciò ridurrà al minimo il potenziale di contaminazione incrociata dei campioni durante il trasporto e la conservazione.

Quindi collocheranno immediatamente le fiale tappate in "carte a secco" precaricate con azoto liquido per il trasporto al laboratorio. Anche se difficile, i campioni devono essere trasferiti a caricatori asciutti entro 20 minuti dalla defecazione. In laboratorio, il personale addestrato svuoterà le fiale dal caricatore secco in un secchio di ghiaccio secco per evitare lo scongelamento durante lo smistamento e il trasferimento delle fiale in scatole freezer 9x9 per la conservazione e il trasporto a lungo termine.

Segnalazione:

Le informazioni saranno registrate su Stool Field Collection Form (SFC).

Indagini:

Test eseguiti presso icddrb:

• determinazione del pH fecale nel laboratorio ospedaliero
• Test della mieloperossidasi e dei livelli di altri biomarcatori nei campioni fecali

Test eseguiti da Evolve Biosystems:

• Next Generation Sequencing, Metagenomics e analisi q PCR dei campioni
• Test immuno-correlati- Analisi multiplex di citochine/analiti infiammatori e immuno-correlati
• IL-10, TGF beta, IL-2, TNF alfa, IL-17, IL-22, IL-8, IL-6, IP-10
• ELISA per sCD83, sTLR2 e lipocalina fecale 2

Feci PH:

Il PH delle feci verrà misurato per valutare la variazione rispetto al basale del pH delle feci durante l'integrazione.

Mieloperossidasi:

La mieloperossidasi è un marcatore specifico dell'attività dei neutrofili. È stato scelto perché non è elevato nel latte materno o nelle feci dei bambini allattati al seno come lo sono la lattoferrina e la calprotectina (Dorosko et al., 2008) e i livelli di MPO nelle feci sono stati correlati con l'attività della malattia nella malattia infiammatoria intestinale valutata sia mediante esame endoscopico e parametri biochimici (SAIKI T, 1998). Lo studio MAL-ED ha già dimostrato il ruolo di MPO come marker della funzione intestinale (McCormick et al., 2017).

Misureremo la concentrazione di questo biomarcatore mediante un ELISA commerciale.

Sequenziamento di nuova generazione: negli ultimi anni sono state stabilite diverse tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (Shendure & Ji, 2008) che rendono ulteriormente possibile l'analisi di un gran numero di microrganismi in diversi ambienti (Tringe et al., 2005) e nel corpo umano siti (Ding & Schloss, 2014, compreso l'intestino umano (Methé et al., 2012).

L'analisi della sequenza del 16S rDNA e la metagenomica sono due efficaci tecniche di sequenziamento del DNA ed entrambe sono state utilizzate per studiare le comunità microbiche intestinali non coltivate. L'analisi della sequenza del 16S rDNA si concentra sul sequenziamento del gene 16S rDNA conservato presente in tutti i microbi (Woese & Fox, 1977) e ha stabilito una serie di nuove connessioni tra la composizione del microbiota intestinale e la malattia (Blaser et al., 2013). La ricerca basata sulla sequenza 16S rDNA è una tecnica per rivelare "chi c'è?" in una data comunità microbica, mentre il sequenziamento metagenomico shotgun sarà in grado di rispondere alla domanda complementare "cosa possono fare?" (Lepage et al., 2012). Il sequenziamento di nuova generazione verrà eseguito per rilevare l'attecchimento dell'organismo, in particolare B. infantis, dopo l'intervento in neonati gravemente malnutriti e confrontandolo con bambini ben nutriti.

Metagenomica:

La metagenomica è stata descritta per la prima volta nel 1998 da Handelsman e Rodon (Handelsman et al., 1998) ed è diventata un altro approccio di sequenziamento del DNA per studiare la complessa comunità microbica intestinale. Mira a catalogare tutti i geni di una comunità mediante il sequenziamento casuale di tutto il DNA estratto dal campione (Qin et al., 2010). In primo luogo, il DNA totale di tutti i microrganismi viene estratto da campioni fecali. Prima di essere sequenziati, i campioni di DNA totale vengono tagliati casualmente con un approccio "fucile da caccia". Le sequenze complete vengono quindi analizzate per ottenere profili di specie basati su marcatori filogenetici (16S rDNA) (Sunagawa et al., 2010) o profili genomici basati su interi genomi (Tringe et al., 2005). La metagenomica svolge un ruolo nella comprensione del microbioma intestinale umano, inclusa la diversità del microbioma intestinale, nell'identificazione di nuovi geni e nella determinazione dell'eziologia della disbiosi funzionale (Wang et al., 2015). Verranno effettuate la composizione di base del microbiota intestinale (analisi metagenomica) e la colonizzazione di Bifidobacterium (abbondanza relativa) mediante analisi metagenomica durante/dopo l'integrazione.

qPCR: la PCR in tempo reale verrà eseguita per il rilevamento quantitativo dell'organismo nel DNA estratto direttamente dal campione di feci. Verrà effettuata la colonizzazione di B. infantis mediante qPCR durante e dopo l'integrazione (con e senza prebiotici).

Citochine:

Qualsiasi citochina prodotta localmente a causa dell'infiammazione intestinale può fuoriuscire nel lume intestinale e apparire nelle feci. Un grande infiltrato infiammatorio nella mucosa malata dell'intestino provoca l'aumento delle citochine nelle feci. Faremo analisi delle citochine per rilevare l'infiammazione intestinale. Misureremo nei campioni di feci l'interleuchina-10 (IL-10), il fattore di crescita trasformante-β (TGF-β), l'interleuchina-2 (IL-2), il fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α), l'interleuchina-17 ( IL-17), Interleuchina-22 (IL-22), Interleuchina-8 (IL-8), Interleuchina-6 (IL-6), Interferon Gamma-Induced Protein 10 (IP-10).

ELISA per sCD83, sTLR2:

Una forma solubile di CD83 viene rilasciata dalle cellule dendritiche attivate e dai linfociti B ed è rilevabile nei normali sieri umani (Hock et al., 2001). I recettori Toll-like (TLR) sono una classe di recettori per il riconoscimento di schemi (PRR) che svolgono un ruolo chiave nell'immunità innata e innescano una risposta immunitaria specifica. sTLR2 è stato rilevato nei fluidi umani, come plasma, latte materno, saliva e liquido amniotico, nonché nel surnatante di monociti in coltura (LeBouder et al., 2003; Kuroishi et al., 2007; Dulay et al., 2009). isolerà sCD83 e sTLR2 da campioni di feci di neonati malnutriti.

Lipocalina fecale 2:

Questa glicoproteina è espressa in diverse cellule ed è stata associata a granuli primari e secondari di neutrofili umani (Roudkenar et al., 2007). La sovraregolazione di Lcn-2 è osservata in condizioni dannose per i tessuti come infezioni, lesioni renali, cancro, colite ulcerosa e ustioni in cui si verifica la produzione di radicali liberi (Chassaing et al., 2012). La lipocalina-2 si correla meno strettamente con i marcatori dei neutrofili, può fornire un marcatore complementare di rottura o danno delle cellule epiteliali (Prata et al., 2016). Faremo il test sia per i bambini malnutriti che per quelli ben nutriti per rilevare il danno degli enterociti.

Microbiota del latte materno e analisi HMO:

Esistono diversi studi in cui sono state valutate l'analisi del latte materno (Williams et al., 2017) e la comunità batterica nel latte materno (Hunt et al., 2011). In questo studio l'analisi del microbiota sarà effettuata con l'analisi della sequenza del 16S rDNA. La misurazione dell'HMO sarà effettuata per conoscere il livello di LnNT.

Procedura di trattamento dei dati:

• I questionari verranno scansionati visivamente subito dopo il colloquio e contrassegnati per omissioni, incongruenze o errori che verranno risolti immediatamente
• Verrà utilizzato SPSS e i dati verranno inseriti dopo aver creato un modello per ciascun file di immissione dati con controlli logici e di coerenza appropriati
• I dati verranno continuamente inseriti man mano che i dati vengono generati in ospedale e in laboratorio
• I dati saranno validati da una serie di controlli logici e di range, producendo statistiche e tabelle riassuntive
• Inoltre, il 50% del CRF (e tutte le variabili) sarà controllato dagli investigatori.
• I dati verranno immediatamente copiati sugli hard disk dei due computer non appena la verifica dei dati sarà completata.

Calcolo della dimensione del campione e variabili di risultato (primarie e secondarie):

Per lo studio pilota, arruoleremo 18 neonati SAM per braccio di trattamento e altri 18 bambini non malnutriti, quindi un totale di 72 neonati.

Analisi dei dati I dati verranno inseriti nei moduli di registrazione clinica (CRF) pre-testati utilizzando SPSS (versione 20.0, Armonk, NY) e infine puliti con controlli ripetuti. Per conoscere l'esito dell'integrazione di prebiotici e probiotici nei bambini dello studio per dati normalmente distribuiti, eseguiremo l'ANOVA e, in caso di distribuzione non normale delle misurazioni, verranno utilizzati test non parametrici equivalenti come il test Kruskal-Wallis H e post hoc appropriato il test verrà eseguito per l'analisi dei sottogruppi, se richiesto. Una probabilità inferiore a 0,05 sarà considerata statisticamente significativa e la forza dell'associazione sarà determinata calcolando l'odds ratio (OR) e gli intervalli di confidenza al 95% (CI). Se si verifica un decesso, eseguiremo l'autopsia verbale e valuteremo i fattori di morte associati con lo stesso piano analitico.

Piano di monitoraggio della sicurezza dei dati (DSMP) Il monitoraggio della sicurezza dei dati sarà rigorosamente eseguito durante il corso dello studio. Tutti i moduli saranno esaminati dal medico dello studio dopo l'arruolamento e la raccolta dei dati seguita dal supervisore per completezza, leggibilità e coerenza interna. La somministrazione di prebiotici e probiotici in ospedale avverrà in presenza del medico dello studio. Tutti gli aspetti dell'accesso, dell'elaborazione e dell'interpretazione dei campioni saranno eseguiti anche secondo le SOP.

Accordi di collaborazione icddr,b eseguirà lo studio in collaborazione con Evolve BioSystems, Inc. USA, un'impresa privata fondata in California da accademici di fama internazionale che ricercano il microbioma intestinale infantile e la sua associazione critica con il latte materno umano.