Porucha fetálního alkoholového spektra – je to ciliopatie?

Východiska: Termín "fetální porucha alkoholového spektra" (FASD) popisuje široké spektrum neurovývojových prezentací vyplývajících z expozice alkoholu in utero. Prevalence se odhaduje na 1 ze 100 lidí a odhaduje se na více než 330 000 postižených jedinců v Kanadě. Kanadské diagnostické směrnice popisují fyzické a neurovývojové účinky vyplývající z prenatální expozice alkoholu. Patří mezi ně výrazné rysy obličeje, mikrocefalie a neurovývojové deficity.

Toxicita ethanolu je zkoumána v souvislosti s koncentrací, trváním a načasováním expozice ethanolu a možnými cestami vedoucími k fenotypové translaci k teratogenezi. Studie FASD na zvířecích modelech začínají implikovat řadu genů náchylnosti, které se podílejí na různých molekulárních drahách interakcí gen-ethanol. Některé z nich se údajně podílejí na teratogenezi ethanolu jako součást jejich rolí při kontrole poškození DNA, tvorbě osy centrálního nervového systému, buněčném přežití a také proliferaci a růstu.

Je známo, že mutace v jednom konkrétním genu, neuronální syntáze oxidu dusnatého (nNOS)), zhoršuje alkoholem indukovanou neuronovou smrt in vivo i in vitro, a exprese genu nNOS chrání neurony před toxicitou alkoholu Oxid dusnatý (NO) je syntetizován enzym syntáza oxidu dusnatého (přes NOS) L-arginin Existují tři izoformy NOS: neuronální NOS (nNOS, NOS-1), indukovatelný NOS (iNOS, NOS-2) a endoteliální NOS (eNOS, NOS-3). spojené s modulací neurotransmise a tvorby paměti spolu s dalšími životně důležitými aktivitami. V přítomnosti O2 se tvoří radikály, které mohou vést k toxicitě. Mohou rušit procesy buněčné signalizace a vést k patologickým stavům.

Data naznačují, že ethanol mění expresi a aktivitu NOS v mozku Jsou známy účinky etanolu na produkci NO, aktivity NOS a interakce NO s enzymy metabolismu alkoholu.

Dávka a délka expozice ethanolu jsou hlavními faktory určujícími účinky etanolu na produkci NO, aktivitu NOS nebo expresi NOS.

Strukturální vrozené mozkové anomálie jsou popsány v kontextu FASD včetně mikrocefalie, migračních anomálií, defektů neurální trubice spolu se středními anomáliemi mozku zahrnujícími corpus callosum, cerebelární anomálie a hydrocefalus.

Cilia jsou evolučně konzervované tykadlovité organely nacházející se na povrchu buněk. Cilia detekují různé extracelulární stimuly, jako je proudění tekutin, světlo, vůně a hormony prostřednictvím specifických ciliárních receptorů, a hrají klíčovou roli v lokomoci a dělení buněk, pohybu tekutin a také embryonálním vývoji různých tkání. Pokud jde o neurální vývoj, nedávno se ukázalo, že ciliární růstové faktory hrají roli v migraci a signalizaci embryonálních neuronálních buněk, stejně jako při tvorbě střední linie a lateralizace centrálního nervového systému (CNS). Ve zralém organismu se řasinky rozprostírají od bazálních těl ependymálních buněk lemujících komorový povrch mozku, kde usnadňují tok mozkomíšního moku (CSF).

Defekty nervového systému jsou silně spojeny s řadou ciliopatií, přičemž běžné nálezy zahrnují defekty střední čáry, jako je hydrocefalus, defekty neurální trubice a množství kortikálních a cerebelárních abnormalit.

Prototypem lidské ciliární choroby byla primární ciliární dyskineze (PCD). V posledním desetiletí vedl významný pokrok v chápání PCD ke zlepšení diagnózy, zejména díky zjištění, že nosní oxid dusnatý (nosní NO) je u těchto pacientů značně snížen. Předpokládá se, že mechanismus tohoto snížení souvisí se sníženou expresí iNOs jako součást ciliopatie. Měření nosního NO je jednoduchý neinvazivní test, který lze snadno provést i u nejmladších pacientů.

Protože měření NO je jednoduchý neinvazivní test s okamžitými výsledky, slouží jako ideální screeningový test pro sugestivní diagnostiku různých ciliopatií, včetně těch, které zahrnují malformace mozku.

V nedávné práci tato výzkumná skupina jako první určila souvislost mezi ciliární dysfunkcí měřenou koncentrací NO v nosu a izolovanými anomáliemi centrálního nervového systému (CNS) Celková průměrná hladina nazálního NO u dětí s izolovanými anomáliemi CNS ve střední linii ve studii, byla významně nižší ve srovnání s dříve stanoveným normálním rozmezím, přičemž některé byly v rozmezí primární ciliární dyskineze (PCD). Nedávné práce ukazují, že interneuronální konektivita, morfogeneze mozkových komor a správná tvorba neurální trubice závisí na nenarušené ciliární funkci.

Primární řasinky fungují jako výsledek membránových proteinů, jako je polycystin-1 (PC-1), PC-2, TRPV4, P2Y12 a fibrocystin. Acetylovaný alfa tubulin je známý ciliární marker.

Změny v PC-1 jsou spojeny s mutacemi polycystického onemocnění ledvin typu 1, u kterých bylo zjištěno, že jsou spojeny s defekty oxidace mastných kyselin v metabolomických a lipidomických testech. Acetylovaný alfa tubulin je hodnocen proteinomickou analýzou.

Hypotéza: Vzhledem k nedávnému poznání interakcí mezi NO a etanolem a důležité roli řasinek v raném vývoji mozku vědci předpokládají, že řasinky mohou být zapojeny do molekulárních drah vedoucích k poranění mozku u dětí s diagnózou FASD. Takový mechanismus nebyl dosud prozkoumán.

Výzkumníci předpokládají, že hladiny nazálního NO, stejně jako klíčových metabolitů u pacientů s diagnózou FASD, budou sníženy ve srovnání se zdravými kontrolami.

Cíl: Tato studie se zaměří na měření nosního NO u vybrané skupiny pacientů s diagnostikovanou poruchou fetálního alkoholového spektra spolu s metabolomickou a proteinomickou analýzou ve vztahu ke klíčovým metabolitům zapojeným do dráhy NO ve vzorcích moči a porovná je se zdravými dětmi. Tato studie umožní lékařům potenciálně využít neinvazivní screeningový nástroj pro dětské pacienty s podezřením na poruchu fetálního alkoholového spektra a zvážit včasnou vývojovou intervenci.

Metodika: 10 dětí ve věku 5-16 let s diagnózou FASD bude přijato z ambulance FASD v Glenrose Rehabilitation Hospital. Prostřednictvím registru HICUPP pro zdravé děti (Pro00056156) bude přijato 10 zdravých dětí stejného věku.

Vyšetřovatelé změří hladiny nazálního NO vložením inertní odběrové hadičky NO s jednorázovou pěnovou olivkou (DirectMed Inc., Glen Cove, NY) do nosní dírky dítěte, zatímco kontralaterální nosní dírka zůstane otevřená. Vzduch bude poté odebírán konstantní rychlostí 0,3 litru/min z nosu chemiluminiscenčním analyzátorem, který poskytuje měření hladiny NO v nosu v částech na miliardu (ppb). Všechna měření nazálního NO se provedou se sedícími subjekty.

Měření budou získána pomocí analyzátoru NO (CLD 88 SP, ECO PHYSICS AG, Duerten, Švýcarsko). Analyzátor bude kalibrován podle specifikací výrobce. Měření budou prováděna pomocí techniky velum-closure prostřednictvím výdechu z hluboké nádechu přes pevný odpor (jednorázový, kartonový válec s 1 mm otvorem; DirectMed Inc., Glen Cove, NY) po dobu 20–40 sekund nebo pomocí hračky na párty. se srovnatelným výdechovým odporem. Oba typy rezistoru vyžadují mírné nafouknutí tváří, aby se vyvinul tlak v ústech > 5 cm H2O, což je tlak dostatečný k uzavření měkkého patra. Manévry budou prováděny podle směrnic ATS/ERS. U pacientů, kteří při výše uvedeném manévru nespolupracují, budou měření provedena pomocí vzorkování dechového dechu.

Vyšetřující zadá naměřenou hladinu NO přímo do počítačového souboru, který se uloží v zašifrovaném formátu na zaheslovaný počítač v rehabilitační nemocnici Glenrose. Identifikační údaje, jako jsou jména účastníků nebo telefonní čísla, nebudou zadány. Každému účastníkovi bude místo jména přiděleno číslo, které bude zaznamenáno. Další identifikační údaje, jako je pohlaví, věk a diagnóza dítěte, budou rovněž kódovány pomocí čísla.

Na základě poskytnutých informací bude provedena statistická analýza kovariant, která porovná naměřené hladiny NO u pacientů s FASD se zdravými kontrolami (s referenčním rozmezím normálu, jak je publikováno v Mateo 2011 a Marthin 2011).

Kromě měření nazálního NO provedou výzkumníci také metabolomickou a proteomickou analýzu k měření hladin klíčových metabolitů a proteinů v moči pacientů s FASD. Tyto budou porovnány se zdravými kontrolami, aby se dále prozkoumala tato hypotéza o ciliárním postižení. Metabolomické analýzy budou použity k měření klíčových metabolitů účastnících se dráhy NO (arginin, citrulin, ornitin, asymetrický dimethylarginin) a také rozpustných vedlejších produktů NO (nitrotyrosin, nitrotryptofan a kyselina 3-nitro-4-hydroxyfenyloctová). Budou provedeny další metabolomické studie s cílem hledat změněné beta-oxidační markery (acylkarnitiny), které mohou být ovlivněny ciliární dysfunkcí, hladinami vitamínů (zejm. vitamin A a jeho vedlejší produkty) a také změny katecholaminů (v důsledku změněných neuronálních funkcí ovlivněných řasinkami) v moči. Metabolomické analýzy budou provedeny pomocí cílených metabolomických metod založených na MS. Vyšetřovatelé také provedou proteomickou analýzu moči u pacientů s FASD, aby změřili změny v klíčových ciliárních proteinech, jmenovitě polycystin-1 (PC-1) (PC-2, TRPV4, P2Y12, fibrocystin), a také acetylovaný alfa-tubulin a porovnali je. hodnot do skupiny zdravých dětí. Proteomické analýzy budou sestávat z kombinace proteomiky založené na MS a imunotestů.

Data budou analyzována pomocí PASW Statistics verze 19 (SPSS Inc., 2010). Alfa bude nastavena na 0,05 pro všechny analýzy. Bude vypočítáno procento dětí, které dosáhly vyššího a nižšího věku, a hraniční hodnoty založené na normě pro každé měření.

Aby se určilo, zda se dvě skupiny (FASD, zdravé kontroly) liší v naměřené úrovni, bude provedena vícerozměrná analýza variance (MANOVA) na skóre podškály s použitím skupiny jako faktoru mezi subjekty.

Vzhledem k tomu, že velikost vzorku je malá, výzkumníci uvedou velikost účinku mezi skupinami pro hladinu NO a metabolomickou analýzu, stejně jako 95% interval spolehlivosti pro velikost účinku. Hypotézou je, že mezi skupinami existuje rozdíl; vzhledem k tomu, že vyšetřovatelé nemohou prokázat nulu (tj. nedostatek statisticky významného nálezu nepotvrdí hypotézu), použijí vyšetřovatelé tuto velikost účinku k odhadu účinku místo toho. Předpokládá se však, že hladiny nazálního NO a klíčových metabolitů, které se týkají NO u dětí s FASD, budou ve srovnání se zdravými kontrolami sníženy.

Po dokončení studie budou deidentifikovaná data uchovávána v zašifrovaném souboru na heslem chráněném počítači po dobu minimálně pěti let.